专利名称：再育镰刀菌zjb-09150及在生物合成烟酸中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株产腈水解酶菌株一再育镰刀菌(Fusarium proliferatum)ZJB-09150，及其在烟酸合成中的应用。
背景技术：
烟酸(Nicotinic Acid),又称为3_卩比唳甲酸(3-picoline acid),即维生素B3,是结构最简单，理化性质最稳定的一种维生素。烟酸为白色结晶或结晶性粉末，无臭或有微臭，水溶液呈酸性反应，熔点234 237°C。易溶于沸水和沸乙醇，溶于苛性碱、碳酸钠，不溶于乙醚和酯类。烟酸在医药、食品和饲料及化学工业中有着广泛的应用前途。烟酸在机体组织中的氧化还原过程中发挥重要作用，具有促进细胞新陈代谢和扩张血管的功能，能促进人体和动物的生长发育。烟酸作为药品可防治皮肤病和类似的维生素缺乏症，具有扩张血管的作用，用于医治末梢神经痉挛，动脉硬化等病症。烟酸还具有生理和化学活性的精细中间体、医药中间体，用它可以开发一系列高附加值的产品，如烟酸铬、烟酸肌醇酯、VE烟酸酯、2-氯烟酸等。因此对烟酸的研究具有重要的实际应用价值。烟酸最初是通过尼古丁氧化制得的。目前合成多以烷基吡唆，如3-甲基吡啶、2-甲基-5-乙基吡啶、甲基戊二氰、6-羟基喹啉、萘和吡啶-3-甲醛等为原料。从合成方法看，可分为试剂氧化法、氨氧化法、气相氧化法、液相氧化法、电解氧化法、生物氧化法和光
化学氧化法等。(I)试剂氧化法试剂氧化法是发展最早的制备烟酸的方法之一，使用的氧化剂有KMnO4, HNO3或NO2、浓H2SO4或S03、H2SO4和HN03、O3或H2O2等，其中以HNO3作为氧化剂最为普遍。3-甲基吡唆、2-甲基-5-乙基吡唆、喹啉、6-羟基喹啉、萘和植物中的尼古丁或盐碱的衍生物均可在上述氧 化剂作用下生成烟碱，总收率为67-86%。(2)氧气氧化法日产化学工业株式会社以钴、锰及铈等金属的醋酸盐与溴的氢化物为催化剂，以纯氧或氧与其它惰性气体的混合物为氧化剂，在无溶剂的液相中氧化3-甲基吡啶得到烟酸，多次循环由3-甲基吡啶制得烟酸的转化率可达80%左右。(3)氨氧化法氨氧化法主要是以3-甲基吡啶或2-甲基-5-乙基吡啶为原料，用空气、氯气和水蒸气混合气体高温催化氧化，得到吡啶腈，然后在氨气和氢氧化钠的水溶液中水解得烟酸。氨氧化的催化剂有Mo，V，Fe，Ti，Zr等的磷酸盐V205/Ti02、Sb-V-Ti氧化物、VaTibZrcOx、V205/A1F3、Sb-V_SAP0_5等。氨氧化法原料价廉易得，可连续大规模生产。在常压或低压下反应，产率较高，纯度也较高，生产安全可靠，是工业上制备烟酸广泛采用的方法。其缺点是从原料烷基吡啶出发到制得产品至少需要两步以上的化学反应，且反应温度较高、催化剂制备有一定困难，不但加大了设备投资，而且增加了成本。(4)空气氧化法以空气或富氧空气做氧化剂，高温催化氧化3-甲基吡啶制得烟酸。所用的催化剂多数是五氧化二钒与铬、锡、铅、钛、铝、锆等氧化物的组合物或含氧酸化合物，如改性的 V2O5, V205/Zr0 2，V205/Sn02, V205/Ti02，还有用 Crl-xAlxV04 和 CrVl_xPx04 等作催化剂的情况。由于催化剂不同.反应温度不同，一般烟酸的收率在61% 86. 8%之间。
以上方法具有氧化剂价格昂贵，过程复杂，产物难分离，污染高及对生产设备要求也高等缺点。近年来生物技术领域的突破性进展，使生物催化在化学合成中日趋重要。利用腈转化酶生物催化生产酰胺、羧酸及其衍生物是一种非常有效的生产方法，可以极大地降低能耗、节省原料、减少污染，将生物技术应用于腈化合物的转化合成，已经引起人们的高度重视和关注。这一切给生物法生产烟酸的发展带来了机遇。
发明内容
本发明目的是提供一株产腈水解酶的新菌株，及其在生物催化3-氰基吡啶制备烟酸中的应用。本发明采用的技术方案是本发明提供一株产腈水解酶新菌株-再育镰刀菌(Fusarium proliferatum)
ZJB-09150,保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC No :M2011472，保藏日期2011年12月15日。所述再育镰刀菌ZJB-09150菌株是从来自浙江省内(杭州、金华、台州)等地100余份土样中，经初筛、复筛及分离纯化而得到的能高效的催化3-氰基吡啶制备烟酸的新菌株。根据它的生理生化特征，鉴定为再育镰刀菌(Fusarium proliferatum)。所述再育镰刀菌ZJB-09150菌株的主要生理生化特征如下菌落形态于28°C在PDA平板培养基培养4d，菌落直径5cm左右，菌落呈同心圆状，菌落周边白色绒毛状，内环浅褐色，中心有小突起。生理生化特征对碳源阳性利用项目吐温40、N_乙酰-D-葡糖胺、β -环糊精、糊精、L-果糖、D-葡萄糖酸、甘油、肝糖、2-酮-D-葡萄糖酸、D-甘露醇、D-核糖、水杨苷、L-山梨糖、反丁烯二酸、L-乳酸 、D-苹果酸、L-苹果酸、D-糖二酸、琥珀酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-鸟氨酸、L-脯氨酸、L-焦谷氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、2-乙醇胺。对碳源阴性利用项目Ν-乙酰-D半乳糖胺、N-乙酰-D甘露糖胺、核糖醇、D-纤维二糖、a-环糊精、D-果糖、D-半乳糖、D-半乳糖醛酸、龙胆二糖、D-氨基葡萄糖、a-D-葡萄糖、a-D-葡萄糖-1-磷酸、葡糖醛酰胺、D-葡萄糖醛酸、m-肌糖、a-D-乳糖、乳果糖、麦芽糖醇、麦芽糖、麦芽三糖、D-松三糖、a-甲基-D-半乳糖苷、β-甲基-D-半乳糖苷、a-甲基-D-葡萄糖苷、β-甲基-D-葡萄糖苷、帕拉金糖、D-阿洛酮糖、D-棉子糖、L-鼠李糖、景天庚醛聚糖、水苏糖、蔗糖、D-塔格糖、D-海藻糖、松二糖、D-木糖、溴代琥珀酸、β -羟丁酸、Y-羟丁酸、β -羟基苯乙酸、a-酮戊二酸、D-乳酸甲酯、癸二酸、琥珀酸甲酯、N-乙酰-L-谷氨酸、L-丙氨酰胺、甘氨酰-L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、腐胺、腺苷、尿苷、腺苷-5’-磷酸。所述再育镰刀菌ZJB-09150菌株18S DNA扩增产物的实际长度为521bp，SEQ IDNO.1序列如下TCTACCTGATCCGAGGTCACATTCAGAAGTTGGGGGTTTAACGGCTTGGC CGCGCCGCGTACCAGTTGCGAGGGTTTTACTACTACGCAATGGAAGCTGC AGCGAGACCGCCACTAGATTTCGGGGCCGGCTTGCCGCAAGGGCTCGCCG ATCCCCAACACCAAACCCGGGGGCTTGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACA GGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGA TGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTTGCTGCGTT CTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTTAT TTATGGTTTTACTCAGAAGTTACATATAGAAACAGAGTTTAGGGGTCCTC TGGCGGGCCGTCCCGTTTTACCGGGAGCGGGCTGATCCGCCGAGGCAACA ATTGGTATGTTCACAGGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCT CCGCAGGTTA ACCCTACGGAG本发明还提供所述再育镰刀菌ZJB-09150在生物转化合成烟酸中的应用，所述应用为以再育镰刀菌ZJB-09150发酵培养获得的含酶湿菌体为催化剂，以3-氰基吡啶为底物，于ρΗ7. (ΓΙΟ. O的缓冲溶液中构成转化反应体系，在35飞5°C条件下进行转化反应，反应完全后，获得的转化反应液即为含烟酸的混合液，将混合液分离纯化，获得所述烟酸。进一步，所述在35 55°C条件下转化反应时间优选为l(Tl20min。进一步，所述反应体系中底物的初始终浓度为1.(T5.0g/L，所述再育镰刀菌ZJB-09150发酵培养获得的含酶湿菌体的质量用量以菌体干重计为2. 5 5g/L。进一步，所述催化剂按如下步骤获得(I)斜面培养将再育镰刀菌Z JB-09150接种至斜面培养基，在28 30°C培养72 84h，获得斜面菌体；所述斜面培养基的终浓度组成为葡萄糖10. (Γ20. O g/L，酵母膏3. (Γ6. O g/ L，氯化钠 1.0 2.0 g/ LjK2HPO4 ·3Η20 O. 2 O. 4 g/ LjMgSO4 O. 2 O. 4 g/ L，琼脂 15. 0 20· O g/ L，pH6. 5 7. 0，溶剂为水；(2)种子培养从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，28 3(TC培养6(T72h，得到种子液；所述种子培养基终浓度组成为葡萄糖10. (Γ20. O g/L,酵母膏3. 0 6· O g/ L，氯化钠1. 0 2· O g/ L, K2HPO4 · 3H20 O. 2 O. 4 g/ L, MgSO4 O. 2 O. 4 g/ L,PH6. 5 7.0，溶剂为水；
(3)发酵培养将步骤(2)获得的种子液以2飞％体积比接种至发酵培养基，在28 30°C、初始pH 6. 5^7. O条件下震荡培养72、6 h，培养液离心分离，弃去上清，取沉淀即得到所述含酶湿菌体；所述发酵培养基终浓度组成为:蔗糖3. (Γ6.0 g/ L，牛肉膏2. (Γ4.0g/ L, NaNO2 2. 0 4· O g/ L, K2HPO1 · 3H.0 O. Γθ. 2 g/ L, MgSO1 · 7H.0 O. 5 1. O g/ LiKClO. 5 1. O g/ L, FeSO1 · 7H.0 O. 02、. 04 g/ L,己内酿胺 4. O 8. O g/ L, pH 6. 5 7. O,溶剂为水。进一步，所述混合液分离纯化的方法为:转化结束后，将转化反应液离心，弃沉淀，取上清液用孔径O. 45 μ m微滤膜过滤，滤液抽真空浓缩至无溶剂流出，取浓缩物加入无水乙醇，冷却结晶，取晶体干燥，获得所述烟酸。更进一步,所述再育镰刀菌ZJB-09150在生物转化合成烟酸中的应用按如下步骤进行将再育镰刀菌ZJB-09150发酵培养获得的含酶湿菌体与3-氰基吡啶混合，于pH9. O的Tris-HCl缓冲溶液中构成转化反应体系，在55°C条件下转化反应lOmin，反应结束后，获得的转化反应液即为含所述烟酸的混合液，将混合液在IOOOOrpm离心lOmin，弃沉淀，取上清液用孔径O. 45 μ m微滤膜过滤，滤液真空浓缩至无溶剂流出，取浓缩物加入无水乙醇，冷却结晶，取晶体干燥，获得所述烟酸；所述再育镰刀菌ZJB-09150发酵培养获得的含酶湿菌体的质量用量以菌体干重计为2. 5g/L，所述3-氰基吡啶的初始终浓度为1. 2g/L。本发明所述再育镰刀菌ZJB-09150含酶湿菌体制备方法推荐为(I)斜面培养将再育镰刀菌ZJB-09150接种至斜面培养基，28°C培养72h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为葡萄糖10. O 8/1，酵母膏3.0 g/ L，氯化钠1. O g/L，K2HPO4 · 3H20 O. 2 g/ L，MgSO4 O. 2 g/ L，琼脂 15. O g/ L，ρΗ7· 0，溶剂为水；
(2)种子培养从步骤(I)斜面菌体挑取一环菌体，接种至50. O ml无菌种子培养基，28°C条件下培养72h，获得种子液；种子培养基终浓度组成为葡萄糖15. 0g，酵母膏5g，氯化钠1. 5 g, K2HPO4 · 3H20 O. 3g，MgSO4 O. 3 g, pH 7. 0，水补足至1. 0L，培养基 121°C灭菌20分钟；(3)发酵培养将步骤(2)获得的种子液以体积比5%的接种量接种至发酵培养基，28°C、、初始pH 6. 5 7. O、150rpm条件下震荡培养96h，收集发酵液，IOOOOrpm离心IOmin后，弃上清收集湿菌体，湿菌体用质量浓度O. 95%生理盐水洗涤3次，收集的菌泥即为含酶湿菌体，具有3-氰基吡啶水解活性的生物催化剂，4°C冰箱保藏、备用；所述发酵培养基终浓度组成为蔗糖 3. O g/ L，牛肉膏 2. O g/ L，NaNO 3 2. O g/ L, K2HPO4 · 3H20 O.1 g/ L，MgSO4 ·7Η20 O. 5g/ L，KC1 0.5 g/ L，FeS04.7H20 0. 02 g/ L，己内酰胺 4.0 g/ L，pH 7.0，溶剂为水。本发明所述再育镰刀菌ZJB-09150发酵培养获得的含酶湿菌体的菌体干重测量方法为测量单位菌浊度、单位体积的菌体细胞干重，得0D_与菌体细胞干重的关系曲线，可以获得各阶段的菌体干重。本发明所述检测产物烟酸的高效液相色谱条件为日本岛津液相色谱仪，不锈钢填充柱，填料为C18,长O. 25m,内径4. 6mm,流速lml/min,柱温室温,流动相为乙腈0· 1%磷酸水溶液(25V: 75V)，进样量为10μ I。其中，烟酸出峰时间为4.2 min。采用外标法确定样品中烟酸的含量。本发明的有益效果主要体现在(I)本发明从微生物群中筛选得到可生物催化生产烟酸的新菌株再育镰刀菌 ZJB-09150 (Fusarium proliferatum)CCTCC NO :M2011472，其在适合条件下，能有效生产烟酸；(2)本发明将再育镰刀菌ZJB-09150用于生物催化生产烟酸实验，结果表明，该菌可有效生物催化生产烟酸，15分钟内60mM3-氰基吡啶转化率可达到100%，因此该菌在生物催化生产烟酸的领域中具有广泛的应用前景。
图1为菌株ZJB-09150单菌落形态照片(放大倍数IOX 100)；图2为菌株ZJB-09150单菌落扫描电镜图(放大倍数I X 12000)；图3为菌株16S rDNA序列PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图；图4为ZJB-09150菌株与NCBI上的菌株的进化树分析结果。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1 :新菌株ZJB-09150的筛选从将由浙江省杭州市某药厂附近采集的土样和污水样接种到富集培养基中；在28 0C，150rpm的摇床上富集培养72h后，再取2ml培养液接种到新鲜的富集培养基上进行二次培养，如此重复3个循环。最后一次培养液稀释后涂布到葡萄糖酵母膏平板培养基上，28°C培养72h获得单菌落，挑取单菌落接种到斜面培养基进行保藏。从斜面培养基挑取一接种环菌种接种到发酵培养基，在28°C、初始pH6. 5 7. O条件下震荡培养96h，离心分离，弃去上清，取沉淀即得到含酶湿菌体；将含酶湿菌体分别悬浮于PH7. O磷酸缓冲液中，通过加Λ 3-氰基吡啶作为底物进行转化实验。将上述O.1g含酶湿菌体分别加入初始终浓度为IOmM的3-氰基吡啶的磷酸缓冲液的反应体系中，35°C反应30分钟后，将反应液离心，取上清液分别用高效液相色谱检测烟酸的含量，选择有转化活性的菌株，最终选择出一株转化活性最高的菌株(编号为ZJB-09150，即CCTCC NO M2011472)做后续的菌种鉴定及转化条件优化实验。所述富集培养基配方为(终浓度)葡萄糖5 g/1，K2HPO4 · 3H20 O. 5 g/1，KH2PO4O. 5 g/1, MgSO4 0. 5 g/1, FeSO4 · 7H20 0. 02 g/1,己内酰胺 4 g/1, pH7. 0，溶剂为水。培养基 121。。，灭菌 20min。所述发酵培养基配方为(终浓度)蔗糖3 g/Ι，牛肉膏2 g/1, NaNO3 2 g/1,K2HPO4 · 3H20 O.1 g/1, MgSO4 · 7H20 0. 5 g/1, KCl 0. 5g/l, FeSO4 · 7H20 0. 02 g/1,己内酰胺4 g/l，pH7.0，溶剂为水。所述葡萄糖酵母膏平板培养基配方为(终浓度)蔗糖3 g/Ι，牛肉膏2 g/1, NaNO32 g/1, K2HPO4 · 3H20 O.1 g/1, MgSO4 · 7H20 0. 5 g/1, KCl 0. 5g/l, FeSO4 · 7H20 0. 02 g/1,己内酰胺4 g/1, pH7. 0，琼脂20g/L，溶剂为水。实施例2 :新菌株Z JB-09150的鉴定实施例1中从土壤中经过富集培养然后用稀释涂布法，经过高效液相色谱检测筛选得到一株活性最强的菌株标号为ZJB-09150，单菌落的显微照片见图1所示，电镜扫描照片见图2所示，菌落直径3. 7cm左右，呈同心圆状，菌落周边白色绒毛状，内环浅黄色，稍突起。利用Biolog (GEN III)自动微生物鉴定系统对菌株ZJB-09150进行了 94种表型测试(Biolog微生物自动鉴定专用试剂及培养基等购自Biolog公司),经Biolog读数仪分析代谢指纹，菌株ZJB-09150鉴定结果，如表I所示。表I菌株ZJB-09150对Biolog GEN III板上71种碳源和23种化学物质的利用能力
权利要求
1.再育镰刀菌(Fusariumproliferatum) ZJB-09150,保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC No :M2011472，保藏日期2011年12月15日。
2.—种权利要求1所述再育镰刀菌ZJB-09150在生物转化合成烟酸中的应用，其特征在于所述应用为以再育镰刀菌ZJB-09150发酵培养获得的含酶湿菌体为催化剂，以3-氰基吡啶为底物，于pH7. (TlO. 0的缓冲溶液中构成转化反应体系，在35飞5°C条件下进行转化反应，反应完全后，获得的转化反应液即为含烟酸的混合液，将混合液分离纯化，获得所述烟酸。
3.如权利要求2所述再育镰刀菌ZJB-09150在生物转化合成烟酸中的应用，其特征在于所述35 55°C条件下转化反应时间为l(Tl20min。
4.如权利要求2所述再育镰刀菌ZJB-09150在生物转化合成烟酸中的应用，其特征在于所述反应体系中底物的初始终浓度为1. (T5. Og/L，所述再育镰刀菌ZJB-09150发酵培养获得的含酶湿菌体的质量用量以菌体干重计为2. 5^5. Og/L。
5.如权利要求2所述再育镰刀菌ZJB-09150在生物转化合成烟酸中的应用，其特征在于所述催化剂按如下步骤获得 (1)斜面培养将再育镰刀菌ZJB-09150接种至斜面培养基，在28 30°C培养72 84h，获得斜面菌体；所述斜面培养基的终浓度组成为葡萄糖10. (T20.0 g/L，酵母膏3.0飞.0 g/L，氯化钠 1.0 2.0 g/ LjK2HPO4 *3H20 0. 2 0. 4 g/ LjMgSO4 0. 2 0. 4 g/ L，琼脂 15. 0 20. 0g/ L，pH6.5 7.0，溶剂为水； (2)种子培养从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，28 3(TC培养6(T72h，得到种子液；所述种子培养基终浓度组成为葡萄糖10.(T20.0 g/L，酵母膏3.0 6. 0 g/ L，氯化钠1. 0 2. 0 g/ L, K2HPO4 3H20 0. 2 0. 4 g/ L, MgSO4 0. 2 0. 4 g/ L,PH6. 5 7.0，溶剂为水； (3)发酵培养将步骤(2)获得的种子液以2飞％体积比接种至发酵培养基，在28 30°C、初始pH 6. 5^7. 0条件下震荡培养72、6 h，培养液离心分离，弃去上清，取沉淀即得到所述含酶湿菌体；所述发酵培养基终浓度组成为:蔗糖3. (T6.0 g/ L，牛肉膏2. (T4.0g/L, NaNO, 2. 0^4. 0 g/L, K^HPO1 3H.0 0.广0. 2 g/L, MgSO1 7H.0 0. 5 1. 0 g/L, KCl0. 5 1. 0 g/L, FeSO1 7H.0 0. 02 0. 04 g/L,己内酿胺 4.0 8. 0 g/L, pH 6. 5 7. 0,溶剂为水。
6.如权利要求2所述再育镰刀菌ZJB-09150在生物转化合成烟酸中的应用，其特征在于所述混合液分离纯化的方法为转化结束后，将转化反应液离心，弃沉淀，取上清液用孔径0. 45 y m微滤膜过滤，滤液进行真空浓缩，浓缩物加入无水乙醇，冷却结晶，取晶体干燥，获得所述烟酸。
7.如权利要求5所述再育镰刀菌ZJB-09150在生物转化合成烟酸中的应用，其特征在于所述应用按如下步骤进行将再育镰刀菌ZJB-09150发酵培养获得的含酶湿菌体与3-氰基吡啶混合，于pH9. 0的Tris-HCl缓冲溶液中构成转化反应体系，在55°C条件下转化反应lOmin，反应结束后，转化反应液即为含所述烟酸的混合液，将所述混合液在IOOOOrpm离心IOmin,弃沉淀,取上清液用孔径0. 45 ii m微滤膜过滤,滤液真空浓缩,取浓缩物加入无水乙醇，冷却结晶，取晶体干燥，获得所述烟酸；所述再育镰刀菌ZJB-09150发酵培养获得的含酶湿菌体 的质量用量以含酶湿菌体的菌体干重计为2. 5g/L，所述3-氰基吡啶的初始终浓度为1. 2g/L。
全文摘要
本发明公开了一种再育镰刀菌(Fusarium proliferatum)ZJB-09150及在生物合成烟酸中的应用，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉，武汉大学，保藏编号CCTCC NoM2011472，保藏日期2011年12月15日；所述合成烟酸的方法为以再育镰刀菌ZJB-09150发酵培养获得的含酶湿菌体为催化剂，以3-氰基吡啶为底物，于pH7.0~10.0的缓冲溶液中构成转化反应体系，在35~55℃条件下进行转化反应，反应完全后，转化反应液即为含烟酸的混合液，混合液分离纯化获得所述烟酸；本发明提供新菌株再育镰刀菌ZJB-09150，该菌可有效生物催化生产烟酸，具有广泛的应用前景。
文档编号C12R1/77GK103045486SQ201210386670
公开日2013年4月17日 申请日期2012年10月12日 优先权日2012年10月12日
发明者郑裕国, 金利群, 柳志强, 沈寅初 申请人:浙江工业大学