专利名称：一种检测驼背鲈的引物对、试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于检测驼背鲈的引物对、试剂盒及其检测方法。
背景技术：
骑背自卢iCromileptes alti又称老鼠斑,是名贵的经济鱼类,市场需求量很大，价格特别昂贵。近年来随着人们生活水平的提高和需求的不断变化，名贵鱼类的消费发展极为迅猛，一些不法商贩频频通过错误标签、以次充好和虚假标注等手段牟取暴利，损害消费者的利益和健康，也使得食品成分、品质和质量安全等问题逐渐凸现。为保护消费者权益，需要确定产品所用鱼类的真实性和种类，建立可靠而准确的鱼类物种鉴定方法。 鱼类的物种鉴定，已从形态学方法发展到目前广泛应用的分子生物学方法。形态学方法是经典的方法，但只适用于完整形态的鱼样品，一旦进行了加工，如鱼片、鱼糜等，那些用于鉴定的特征就可能被破坏，形态学鉴定就会变得困难，也会导致结果不准确。分子生物学方法包括蛋白质方法和DNA检测方法。蛋白质方法的缺点是不适用于加工食品，因为高盐、高热、高压等常见的加工方式会导致蛋白变性，从而使分析可靠性较低。而DNA检测方法则更稳定耐热，更特异，结果也更加灵敏和准确。目前在物种鉴定领域应用最广泛的DNA检测方法包括PCR及其相关技术(如RFLP)和DNA序列分析等。PCR是通过扩增待测样品的DNA，使其能够从最初的微小数量增至足以达到检测限量的巨大数量。目前，PCR方法已广泛应用于各个基因检测领域。国内外学者对驼背鲈进行物种DNA鉴定的研究较少，国内外尚未见报道能够快速、简单、特异且灵敏地检测驼背鲈的PCR方法以及试剂盒。因此，目前需要一种能够快速、简单、特异且灵敏地检测驼背鲈的鉴定方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种快速、简单、特异且灵敏地检测驼背鲈的鉴定方法。为实现上述目的，提供一种检测驼背鲈的引物对，具体为所述引物对序列为SEQID No 1和SEQ ID No 2所示的序列。本发明还提供一种试剂盒，含有SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示的序列引物对的试剂盒。本发明保护了所述引物对和含引物对的试剂盒用于检测驼背鲈的用途。本发明提供了一种用于检测驼背鲈的方法，其特征在于包括用所述引物对或者含所述引物对的试剂盒进行PCR扩增的步骤。具体步骤为
从样品中提取DNA为I旲板；
利用所述引物对或者含所述引物对的试剂盒中的引物对作为PCR扩增的引物，进行PCR扩增，得到扩增产物；
检测扩增产物，并作出判断。所述的PCR反应体系为25 μ L，即在O. 2 mL的PCR反应管中加入2. 5 μ L 10XPCR缓冲液，2. 5 μ L 25 mmol/L 的 MgCl2, 2. 5 μ L2. 5 mmol/L 的 dNTP，0.2 μ L 5 U/μ L 的DNA聚合酶，I μ L 10 4 11101/1的上游引物0&1匕1 μ L 10 μ mol/L的下游引物Calr，I μ L样品基因组DNA，14. 3 μ L超纯水。所述的PCR 反应条件为95 0C 5 min ；94 °C 30 s，60 °C 40 s，72 °C I min，共35个循环；72 V延伸7 min。所述的检测扩增产物并作出判断是采用电泳检测，出现275 bp左右的特异性扩增条带即判断为检出驼背鲈。本发明引物对是通过分析已报道的驼背鲈线粒体细胞色素氧化酶I亚基 (cytochrome oxidase subunit I，C0I)基因序列设计。本发明的引物对根据驼背鲈COI基因序列(Genbank序列号JF750765即SEQ IDNo 3)和其他石斑鱼 COI 序列(Genbank 序列号 JF750758、JF750759、JF750760、JF750761、JF750762、JF750763、JF750764)设计得到。使用本发明的引物对，能够特异、灵敏地扩增出目的片段。使用本发明的引物对进行检测，实施例显示，只有驼背鲈特异性产生275 bp的扩增条带，其他9种石斑鱼和其他30种鱼均未产生275 bp的扩增条带。驼背鲈与石斑鱼属的关系比较近，故选择这9种石斑鱼进行PCR扩增，以检测本发明方法的特异性。结果表明建立的PCR方法具有良好的特异性，可用于驼背鲈的检测。这9种石斑鱼为赤点石斑鱼{Epinephelus akaara )、云纹石斑鱼{Epinephelus moara )、掠点石斑鱼{Epinephelusfuscoguttatus)、 带石斑鱼{Epinephelus coioides)、青石斑鱼{Epinephelus awoara)、琐瑁石斑鱼 QEpinephelus quoyanus )、宽额 S卢{Promicrops lanceola tus )、斑觸棘鱼卢iPlec tropomus macula tus )、豹纹鱼思棘鱼卢 QPlec tropomus Ieopardus )。使用本发明的引物对进行检测，可从驼背鲈含量为0. I %的样品中成功检测出驼背鲈。具有较高的灵敏度，符合日常检测的要求。使用本发明的引物对进行检测，具有灵敏度高、特异性强的特点；本发明的PCR检测方法，具有高效、快速和敏感性高的优点。使用本发明的引物对进行检测，其快速、特异、灵敏、准确和简便的特点适合用于国内外市场上驼背鲈的真伪鉴别和样品中驼背鲈成分的检测等。
图I为本发明驼背鲈PCR检测方法的特异性试验结果 图2为本发明驼背鲈PCR检测方法的特异性试验结果 图3为本发明驼背鲈PCR检测方法的特异性试验结果 图4为是本发明驼背鲈PCR检测方法的灵敏度试验结果图。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例I :
I.引物对的设计根据驼背鲈COI基因序列(Genbank序列号JF750765即SEQ ID No:3)和其他石斑鱼COI序列设计得到，具体引物对序列如下
SEQ ID No :1 :5’ - gCTTCTCCTTgCTTCTTCTg -3，
SEQ ID No :2 :5’ - gTACAgggAgAgAAAgAAgTAg -3’。弓丨物序列由TAKARA公司合成。
2.引物对的合成和试剂盒的制备
根据上述核苷酸序列信息由TAKARA公司合成引物对。将上述合成好引物对分别配制成浓度为10 Mfflol/L的溶液作为试剂盒，备用。以下实施例所述的上游引物Calf即为SEQ ID No :1，下游引物Calr即为SEQ IDNo 2 ο3.样品基因组DNA的提取(按照QIAGEN DNeasy血液和组织DNA提取试剂盒制备样品的基因组DNA溶液)
1)取鱼的肌肉组织剪碎后，用液氮充分研磨混匀。从中取约25mg置于灭菌的I. 5 mL离心管中；
2)加入180μ ATL缓冲液和20 PL蛋白酶K，漩涡混匀，56 °C水浴约I h，并不断摇动，直至组织完全消化；
3)加入200μ AL缓冲液，漩涡混匀。再加入200 μ 无水乙醇，再次混匀；
4)将离心管中的溶液转移至置于2mL收集管中的DNeasy Mini spin column柱中，12
000rpm离心I min，弃去收集管和管中的离心液体；
5)将spincolumn柱套在新的2 mL收集管中，加入500 AWl缓冲液(试剂盒所带)，12 000 rpm离心I min，弃去收集管和管中的离心液体；
6)将spincolumn柱套在新的2 mL收集管中，加入500 AW2缓冲液(试剂盒所带)，12 000 rpm离心3 min，弃去收集管和管中的离心液体；
7)将spincolumn柱置于新的I. 5 mL离心管中，加入100 65 °C预热的AE缓冲液(试剂盒所带)溶解DNA，室温静置2 min ；
8)12 000 rpm离心2 min。离心管中的液体即为提取的样品基因组DNA溶液。检测DNA浓度及质量(DNA浓度不低于0.05 mg/L), - 20 °C保存备用。4. PCR 扩增
I)PCR反应体系和反应条件
以步骤3提取的基因组DNA为模板，进行PCR反应；
PCR反应体系为25 μ L，即在0. 2 mL的PCR反应管中加入2. 5 μ L 10XPCR缓冲液，2.5 μ L MgCl2C 25 mmol/L), 2. 5 μ L dNTP(2. 5 mmol/L), 0. 2 μ L DNA 聚合酶(5 U/μ L)，
1μ L Calf (10 μ mol/L), I μ L Calr (10 μ mol/L), I μ L 基因组 DNA，14. 3 μ L 超纯水；
将样品管放入PTC-200 PCR仪(美国Bio-Rad公司)，设置反应条件为95 V 5 min ；94V 30 S，60 V 40 S，72 V I min，共 35 个循环；72 V 延伸 7 min ；
2)PCR扩增产物的电泳检测
用IXTAE电泳缓冲液制备I 一 I. 5 %的琼脂糖凝胶。取10 μ L PCR扩增产物与I μ LIOX上样缓冲液混合后,在凝胶板上的孔中点样。用100 bp的DNA Marker做分子量标记。设置电压(3V/cm—5V/cm),电泳时间为50 min — 60 min。用凝胶成像仪(Alpha ImagerEP)拍照记录；
采用上述引物对Calf和Calr特异性PCR扩增的驼背鲈COI基因片段长度为275 bp,根据样品是否产生275 bp的PCR扩增条带判定样品中是否含有驼背鲈；
3)用于检测驼背鲈的PCR方法的特异性确定
实验中所有鱼样品均来自水产品批发市场。取驼背鲈、9种不同的石斑鱼[赤点石斑鱼{Epinephelus akaara )、云纹石斑鱼{Epinephelus moara )、掠点石斑鱼{Epinephelusfuscogutta tus )、 带石斑鱼{Epinephelus coi oi des )、青石斑鱼{Epinephelus awoara )、琐瑁石斑鱼 QEpinephelus quoyanus )、宽额 S卢{Promicrops lanceola tus )、斑觸棘鱼卢(.Plectropomus豹纹觸棘自卢Ieopardus^ ]和三文鱼、金枪鱼、
金线鱼、真鲷、髭鲷、条石鲷、大目鲷、黄鳍鲷、花鲈、三线矶鲈、大西洋红鲈、黄花鱼、齿颌眶棘鲈、鹦嘴鱼、银鲫、尖嘴魟、四指马鲅、银鲳、乌鲳、日本单鳍电鳐、犁头鳐、棘鲳、条纹鲽、棕斑蓝子鱼、金带细鰺、褐菖鈾、横纹东方飩、条纹斑竹鲨、星鲨、鼠鲨等其他常见鱼类30种，按上述方法分别提取基因组DNA，并进行PCR扩增，凝胶电泳检测结果。凝胶电泳结果见图I、图2和图3，结果显示只有驼背鲈特异性产生275 bp的扩增条带，其他9种石斑鱼不产生275 bp的扩增条带，其他30种鱼也均未产生275 bp的扩增条带。表明建立的PCR方法具有良好的特异性，可用于驼背鲈的检测。图1、2、3中M均为分子量100 bp DNA marker,图I的泳道I — 11依次为驼背鲈、
赤点石斑鱼、云纹石斑鱼、棕点石斑鱼、点带石斑鱼、青石斑鱼、玳瑁石斑鱼、宽额鲈、斑鳃棘鲈、豹纹鳃棘鲈及空白对照(ddH20)的PCR检测结果。图2的泳道I 一 15依次为三文鱼、金枪鱼、金线鱼、真鲷、髭鲷、条石鲷、大目鲷、黄鳍鲷、花鲈、三线矶鲈、大西洋红鲈、黄花鱼、齿颌眶棘鲈、鹦嘴鱼、银鲫、图3的泳道16 - 30依次为尖嘴魟、四指马鲅、银鲳、乌鲳、日本单鳍电鳐、犁头鳐、棘鲳、条纹鲽、棕斑蓝子鱼、金带细鰺、褐菖鈾、横纹东方飩、条纹斑竹鲨、星鲨、鼠鲨的PCR检测结果。4)用于检测驼背鲈的PCR方法的灵敏度确定
将驼背鲈的鱼肉组织与花鲈的鱼肉组织混合，配制成驼背鲈相对百分含量(w/w)为10%、I %、0. I %、0. 01 %和0%的鱼类组织样品，按上述方法分别提取基因组DNA，进行PCR扩增，凝胶电泳检测结果。检测结果如图4所示。其中M为分子量100 bp DNA marker，泳道
I一 5依次为驼背鲈含量分别为10 %、1 %、0· 1%、0·01 %和0%的鱼肉样品的PCR检测结果，泳道6为空白对照(ddH20)的PCR检测结果，结果表明建立的PCR方法可从驼背鲈含量为0.1 %的样品中成功检测出驼背鲈。具有较高的灵敏度，符合日常检测的要求。
权利要求
1.一种用于检测驼背鲈的引物对，其特征在于，所述引物对序列为SEQ ID No :1和SEQID No 2所示的序列。
2.一种用于检测驼背鲈的试剂盒，其特征在于含有权利要求I所述引物对的试剂盒。
3.权利要求I的引物对、权利要求2的试剂盒用于检测驼背鲈的用途。
4.一种用于检测驼背鲈的方法，其特征在于包括用权利要求I的引物对或者权利要求2试剂盒中的引物对进行PCR扩增的步骤。
5.权利要求4所述方法，其特征在于 从样品中提取DNA为I旲板； 利用权利要求I的引物对或者权利要求2试剂盒中的引物对作为PCR扩增的引物，进行PCR扩增，得到扩增产物； 检测扩增产物，并作出判断。
6.权利要求4或5所述方法，其特征在于所述的PCR反应体系为25μ L，即在O. 2 mL的 PCR 反应管中加入 2. 5 μ L IOXPCR 缓冲液，2. 5 μ L 25 mmol/L 的 MgCl2, 2. 5 μ L2. 5mmol/L 的 dNTP，0.2 μ L 5 U/μ L 的 DNA 聚合酶，I μ L 10 μ mol/L 的上游引物 Calf，Iμ L 10 μ mol/L的下游引物Calr，l μ L样品基因组DNA，14. 3 μ L超纯水。
7.权利要求4或5所述方法，其特征在于所述的PCR反应条件为95V 5 min ；940C 30 S，60 0C 40 S，72 °C I min，共 35 个循环；72 °C 延伸 7 min。
8.权利要求4或5所述方法，其特征在于所述的检测扩增产物并作出判断是采用电泳检测，出现275 bp左右的特异性扩增条带即判断为检出驼背鲈。
全文摘要
本发明涉及一种检测驼背鲈的引物对、试剂盒和检测方法，其引物对序列如SEQIDNo1和SEQIDNo2所示。还包括含有该引物对的试剂盒及其用引物对和试剂盒的检测方法。本发明的检测方法简单、快速、特异、灵敏。
文档编号C12N15/11GK102839221SQ20121038487
公开日2012年12月26日 申请日期2012年10月12日 优先权日2012年10月12日
发明者陈双雅, 陈伟玲, 王嘉鹤, 张永祥, 徐敦明, 周昱 申请人:厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心