专利名称：南美白对虾传染性肌肉坏死病的检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种南美白对虾传染性肌肉坏死病的检测方法及试剂盒。该检测方法为实时荧光定量PCR方法。
背景技术：
近年动物世界卫生组织(OIE)报道了一种新发现的主要感染南美白对虾的严重病毒，初步定名为传染性肌肉坏死病毒(Infectious Myonecrosis Virus, IMNV),该病发现于南美，目前已证实传入亚洲，并列入了亚太地区水生动物监测季度报告(QAAD)的病害监测名录，OIE将该病列入OIE的重点水生动物疫病名录。2002年巴西初次发生传染性肌肉坏死病，主要危害南美白对虾。引起该病的病原体为双链RNA病毒简称IMNV，为一个全新的病毒。中华人民共和国农业部2008年12月11日发布的第1125号公告，将传染性肌肉坏死病新增为二类动物疫病，为甲壳类感染的六种二类动物疫病之一。MNV能使6克左 右南美白对虾发生高达50%的致死率。本病2004年仅在巴西就造成超过I亿美元的经济损失。2006年已经传到亚洲的印度尼西亚。我国海南、福建、汕头等地也有报道，但尚未证实。由于我国的南美白对虾养殖面积大，并且在养殖过程中苗本和亲本的大规模国际、跨区域移动现象十分普遍，因此，该病传入我国并扩散的风险很大，应引起各级政府及广大对虾养殖业者的高度重视。美国、印度尼西亚和我国台湾等地的学者已经进行了该病毒的初步的流行病学研究，并在GenBank中发布了两条全序列。美国亚利桑那大学(UniversityofArizona)水产病害实验室为研究该病毒国际上最权威的实验室之一，已经尝试建立该病毒的PCR鉴定方法。但在国内除了朱泽闻和赵文武2007年提出“南美白对虾养殖应警惕传染性肌肉坏死病毒”，闻冬春2009年综述了 “对虾传染性肌肉坏死病的研究进展”外，再无其他的文献报道。OIE虽然发布有该病毒的荧光PCR检测方法，但从作者的工作实践结果来看，其敏感性不高，扩增效果不好，因此有必要重新设计一个快速、准确的新的检测方法。
发明内容
本发明的首要目的是克服现有技术的缺点与不足之处，提供一种南美白对虾传染性肌肉坏死病的检测方法。该检测方法速度快且准确率高。本发明的另一目的在于提供实现所述检测方法的试剂盒。本发明通过下述技术方案实现一种南美白对虾传染性肌肉坏死病的检测方法，包含以下步骤(I)设计实时荧光定量PCR所需要的引物和探针如下所示，方向5’ 一 3’，探针标记荧光基团为FAM、淬灭基团TAMRA 正向引物CPI-603 GGGAGTAGATATAAATGTTCAG ；反向引物CPI-732 CAACCACCCAAATTCATA ；探针PCPI-712 :FAM-CACCTGCTACCACTTCTTCTCTT_TAMRA。(2)检测以南美白对虾肌肉组织为材料提取RNA，逆转录，得到cDNA ；以cDNA为模板，在荧光PCR反应体系中加入步骤⑴设计的引物和探针，设定实时荧光PCR仪反应程序，进行实时荧光PCR，从而检测出所检测的南美白对虾是否为传染性肌肉坏死病毒阳性；步骤⑵中所述的实时荧光定量PCR反应体系优选为每25 μ L反应体系中IOXTaq DNA 聚合酶 buffer (含 Mg2+) 2. 5 μ I、IOmM dNTPl μ L、Taq DNA 聚合酶 0.5 μ L、正向引物CPI-603、反向引物CPI-732以及探针PCPI-712 ;正向引物CPI-603和反向引物CPI-732的终浓度分别为O. I μ mol/L、探针PCPI-712的终浓度为O. 06 μ mo I/L ；步骤(2)中所述的实时荧光PCR的条件优选为48°C 5min ；95°C 5min ；95°C 15s，60°C 15s, 40 个循环；实现上述南美白对虾传染性肌肉坏死病核酸检测方法的试剂盒，包含正向引物、反向引物和荧光标记探针，其中引物和探针如下正向引物CPI-603 :5' -GGGAGTAGATATAAATGTTCAG-3'；反向引物CPI-732 :5' -CAACCACCCAAATTCATA-3'；·探针PCPI-712 :5' -FAM-CACCTGCTACCACTTCTTCTCTT-TAMRA-3'；所述的试剂盒还包含RT-PCR缓冲液、逆转录反应酶混合物、DEPC处理水。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果本发明为南美白对虾传染性肌肉坏死病毒提供一种快速、准确的检测方法和试剂盒。本发明通过引物和探针的设计与筛选，得到特异性强、分辨率高的一组引物和探针，所建立的体系可重复性高，经多次试验稳定性好。其检测结果与其他检测技术相比，特异性强、灵敏度高，具有更大的可靠性和适应性，提高了检测效率，从而为南美白对虾传染性肌肉坏死病毒提供更有为效的检测手段。
图I是分别用三组引物和探针对pGMT-CPI进行RT-PCR的结果图；其中I是使用本发明所提供的引物和探针组得到的扩增曲线；2是使用对照B组引物和探针得到的扩增曲线；3是使用对照C组引物和探针得到的扩增曲线。图2是对三组引物和探针特异性检测的结果图；其中，I是本发明所提供的引物和探针对pGMT-CPI进行RT-PCR得到的扩增曲线；2是对照B组引物和探针对pGMT-CPI进行RT-PCR得到的扩增曲线；3是对照C组引物和探针对pGMT-CPI进行RT-PCR得到的扩增曲线；4为使用三组不同的引物和探针对不同的模板WSSVDNA, IHHNVDNA和水扩增得到的9条曲线基本重合在一起得到。图3是本发明所提供的引物和探针对pGMT-CPI进行RT-PCR得到的扩增曲线，其中1是以150ng的pGET-CPI为模板的扩增曲线；2是以15ng的pGET-CPI为模板的扩增曲线；3是以I. 5ng的pGET-CPI为模板的扩增曲线；4是以O. 15ng的pGET-CPI为模板的扩增曲线；5是以O. 015ng的pGET-CPI为模板的扩增曲线；6是以O. 0015ng的pGET-CPI为模板的扩增曲线-J是以O. 00015ng的pGET-CPI为模板的扩增曲线；8是以O. 000015ng的PGET-CPI为模板的扩增曲线；9为阴性对照。图4是对照B组引物和探针对pGMT-CPI进行RT-PCR得到的扩增曲线，其中1是以150ng的pGET-CPI为模板的扩增曲线；2是以15ng的pGET-CPI为模板的扩增曲线；3是以I. 5ng的pGET-CPI为模板的扩增曲线；4是以O. 15ng的pGET-CPI为模板的扩增曲线；5是以O. 015ng的pGET-CPI为模板的扩增曲线；6是以O. 0015ng的pGET-CPI为模板的扩增曲线；7是以O. 00015ng的pGET-CPI为模板的扩增曲线；8是阴性对照。图5是对照C组引物和探针对pGMT-CPI进行RT-PCR得到的扩增曲线，其中1是以150ng的pGET-CPI为模板的扩增曲线；2是以15ng的pGET-CPI为模板的扩增曲线；3是以I. 5ng的pGET-CPI为模板的扩增曲线；4是以O. 15ng的pGET-CPI为模板的扩增曲线；5是以O. 015ng的pGET-CPI为模板的扩增曲线；6是以O. 0015ng的pGET-CPI为模板的扩增曲线是以O. 00015ng的pGET-CPI为模板的扩增曲线；8是以O. 000015ng的pGET-CPI为模板的扩增曲线；9为阴性对照。图6是本发明所提供的引物和探针组与OIE方法引物和探针组对cDNA扩增的区别图；其中1为本发明提供的引物和探针，以pGET-CPI为模板的阳性对照；2为本发明提供的引物和探针，以頂NV cDNA为模板；3为OIE方法引物和探针，以MNV cDNA为模板；4为本发明提供的引物和探针，以H20为模板的阴性对照。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例I(I)根据 Areerat Kunanopparat 等(Journal of Virological Methods, 2010,171(1) :141-148)文献方法，委托大连宝生物技术有限公司合成CP-I的扩增引物，以鲁东大学生命科学院闻冬春博士馈赠的传染性肌肉坏死病毒(InfectiousMyonecrosis Virus)IMNV cDNA (IMNV cDNA 已在文献 “Borsa Μ.等，Detection of infectious myonecrosisvirus in penaeid shrimps using immunoassays usefulnessof monoclonal antibodiesdirected to the viral maj or capsid protein. Arch Virol,published2010-09_23，，中公开)为模板，经PCR (反应体系为10倍PCR缓冲液5 μ 1，IOmM dNTPs2 μ 1，20 μ M正反引物(正向引物5’ -GCTGCAAAAGAGGGTGCTCG-3’ ；反向引物5’ -TTGCATTGAACTCCACGAAAAC-3’ )各1μ 1，Taq聚合酶O. 5 μ 1，cDNA2y 1，用ddH20补足50 μ I。反应条件为94°C 3分钟；940C 15秒，550C 30秒，72°C I分钟34个循环；72°C延伸5分钟，10°C保温。扩增获得CP-I全长，将CP-I全长克隆到质粒pGMT(天根生化科技(北京有限公司)，编号为VT202-02)，得到重组载体pGMT-CPI。CP-I全长克隆序列如下GCTGCAAAAGAGGGTGCTCGAACATTGGCAATGTATGTTTTAATGTTTGCAGAATGGCCATTTGGTATGTATACAAAAACTAAACAAACAACAGACAATGCTGGTAATAACCAATCAGATCAAATTTTCATTCACTCCGAATCTACTGTACATATTCCAGGACAAAAACAAATGCATATTGTGCTGCCAAGAAAAGTGAACATGGTGAACCCCACTACAATTGCAGAAGCAAATGCACGTGTAGTAATTCAACCAACATACGGTACAGTGGCAGCTGGGGCAGGTGTCGCAAATGGTAATATTAACGTAGCTGCTGTTGGTGTGGCCCTGCCAACTGTAAATTTGACTGACTATCTTGTATCCTGGGCAACCGATTTCACACTTGGCGACATAAAACAATTGGTTGAAAGAATGAAAACAACACTGCCAATTAGTCGAGACTTGATGGCAGCACGTCAAAATGCTATGTTATTAAGTACTCTATTTCCTCCACTAATTCAGAGCAATGTGGCTTCAGACACAAAGGAAGTCCCAGGAACAGCTGGAGCATACACTGCATGTCTTGCAAACTTAGGTATTCCTGAAACACTAACAGTTAACTGGGGAGTAGATATAAATGTTCAGCCATTGTATCAGCTACTTGAAACGGACATCACAGCCCACAATCGGTACGTATTAAACCTGTTCAAAAGAGAAGAAGTGGTAGCAGGTGCATATGAATTTGGGTGGTTGGGACACATGGCCAGTTATATGATGGGACTCCTTCTAACAATGAATATATCATCAGTGTTTAACGTTTGGTATTCAACAAGACGTATTTCAACAAAGGCGTGGGACACGGCATATGATAGTAACATCCAAGCATATCAGGACATGCATTACCAAATGTTTTCGTGGAGTTCAATGCAA。(2)设计实时荧光定量PCR所需要的三组引物和探针，如下所示，方向均为5，一 3，本发明所提供的引物对及探针正向引物CPI-603 GGGAGTAGATATAAATGTTCAG ；反向引物CPI-732 CAACCACCCAAATTCATA ；探针PCPI-712 FAM-CACCTGCTACCACTTCTTCTCTT-TAMRA ；对照B组引物和探针正向引物CPI-490 CCACTAATTCAGAGCAAT ； 反向引物CPI-642 AAGTAGCTGATACAATGG ；探针PCPI-567 FAM-AAACTTAGGTATTCCTGAAACACTA-TAMRA ；对照C组引物和探针正向引物 CPI-490 CCACTAATTCAGAGCAAT ；反向引物CPI-642 AAGTAGCTGATACAATGG ；探针PCPI-596 :FAM-TTAACTGGGGAGTAGATATAAATGT_TAMRA ；(3)对引物和探针有效性的荧光PCR检测以pGMT-CPI质粒为模板，分别加入上述设计的3对引物和探针，配制成25 μ T反应体系，含有 IOXTaq DNAbuffer (含 Mg2+) 2. 5 μ IUOmMdNTPl μ l、Taq DNA 聚合酶(TAKARA公司)0. 5 μ L，模板DNA为150ng，正、反向引物终浓度分别为O. I μ mol/L、探针的终浓度为
O.06ymol/L，用双蒸水将体积调整为25 μ L。PCR的反应条件为48°C 5min ；95°C 5min ；95°C 15s，60。。15s，40 个循环。三组引物和探针都能分别对pGMT-CPI质粒进行有效扩增，如图I所示，但在完全相同的反应条件下，本发明所提供的引物和探针组的扩增有效性最好，说明该组引物和探针在对CPI特异性扩增的片段长度、Tm值、匹配特异性及有效性等因素上都是最优化的。实施例2三组引物探针特异性的荧光PCR检测分别以pGMT-CPI质粒、WSSV (对虾白斑综合症病毒)DNA、IHHNV (对虾传染性皮下及造血组织坏死病)DNA为模板(对虾白斑综合症病毒(WSSVDNA和IHHNV DNA在文献“杨冰等，对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV) PCR检测方法的建立.海洋水产研究，2005,26(2) :1_5”公开)，同时设置阴性对照组，阴性对照中模板用双蒸水替代。分别加入上述设计的3对引物和探针，配制成25 μ L反应体系，共有12组。其中，每25 μ L反应体系含有10Xbuffer (含Mg2+) 2. 5 μ I、dNTPl μ I、Taq DNA聚合酶O. 5 μ L，正、反向引物终浓度分别为O. I μ mol/L、探针的终浓度为O. 06 μ mol/L,模板DNA为150ng，用双蒸水将体积调整为 25yL。PCR 的反应条件为48°C 5min ；95°C 5min ；95°C 15s，60°C 15s，40 个循环。如图2所示，三对引物探针均只能对以pGMT-CPI质粒为模板时进行有效扩增，对其他虾病毒没有有效性扩增，且仍然为本发明推荐组引物和探针效果最好，说明该组引物和探针对南美白对虾传染性肌肉坏死病毒核酸的荧光PCR检测具有特异性。实施例3三对引物探针敏感性的荧光PCR检测
(I)以CPI-603、CPI-732为引物，PCPI-712为探针，以不同浓度的pGMT-CPI质粒为模板的扩增曲线。配制成25 μ L反应体系，含有10Xbuffer (含Mg2+) 2. 5 μ l、dNTPl μ I、Taq DNA聚合酶O. 5 μ L，引物终浓度分别为O. I μ mol/L、探针的终浓度为O. 06 μ mol/L，用双蒸水将体积调整为25 μ L。PCR的反应条件为48°C 5min ；95°C 5min ；95°C 15s，60°C 15s，40个循环。如图3所示，CPI-603、CPI-732、PCPI-712的引物探针组，对从低达O. 000015ng至高达150ng的病毒核酸均有有效性扩增，能定量反映模板的浓度梯度，其检测灵敏度非常高。鉴于对O. 000015ng的病毒核酸检测时Ct值已接近35，(更低稀释度的模板DNA在溶液中不稳定，容易产生不稳定的扩增信号，)因此不建议使用浓度低于此值的核酸作为模板。(2)以CPI-490、CPI-642、PCPI-567为引物探针组，以不同浓度的pGMT-CPI质粒为模板的扩增曲线。配制成25 μ L反应体系，含有10Xbuffer (含Mg2+) 2. 5 μ l、dNTPl μ I、Taq DNA聚合酶O. 5 μ L，引物终浓度分别为O. I μ mol/L、探针的终浓度为O. 06 μ mol/L，用双蒸水将体积调整为25 μ L。PCR的反应条件为48°C 5min ；95°C 5min ；95°C 15s，60°C 15s，40个循环。 如图4所示，CPI-490、CPI-642, PCPI-567引物探针组，对CPI标准分子有有效扩±曾，但相比较与本发明推荐引物探针组，仅能对高浓度模板扩增效果明显，检测低限至少要高一个数量级，在模板浓度O. 00015ng时扩增信号已不稳定。(3)以CPI-490、CPI-642、PCPI-596为引物探针组，以不同浓度的pGMT-CPI质粒为模板的扩增曲线。配制成25 μ L反应体系，含有10Xbuffer (含Mg2+) 2. 5 μ l、dNTPl μ I、Taq DNA聚合酶O. 5 μ L，引物终浓度分别为O. I μ mol/L、探针的终浓度为0. 06 μ mol/L，用双蒸水将体积调整为25 μ L。PCR的反应条件为48°C 5min ；95°C 5min ；95°C 15s，60°C 15s，40个循环。如图5所示，CPI-490、CPI-642、PCPI-596引物探针组，仅能对高浓度CPI模板进行有效扩增，但模板浓度梯度反应的定量检测效果不好。对从低达0. 000015ng至高达150ng的病毒核酸均有有效性扩增，其敏感性非常强，鉴于对0. 000015ng的病毒核酸检测时ct值超过30接近35，不建议用过低的浓度低于此值的核酸作为模板。(4)分别以CPI-603、CPI-732和PCPI-712引物探针组，及OIE提供的引物探针(引物 MNV412F :5’-GGACCTATCATACATAGCGTTTGCA-3’ ；引物 MNV545R :5’-AACCCATATCTATTGTCGCTGGAT-3’ ；探针 MNVpl : 5 ’-FAM-CCACCTTTACTTTCAATACTACATCATCCCCGG-TAMRA-3’)配制成 25 μ L 反应体系，含有 10 Xbuffer (含 Mg2+) 2. 5 μ UdNTPl μ l、TaqDNA聚合酶0. 5 μ L，引物终浓度分别为0. I μ mol/L、探针的终浓度为0. 06 μ mol/L,模板为75ng，用双蒸水将体积调整为25 μ L。PCR的反应条件为48°C 5min ；95°C 5min ；95°C 15s，60°C 15s,40 个循环。如图6所示，本发明所提供的引物和探针组与OIE方法引物和探针组对cDNA扩增的区别；本方法推荐的引物和探针与OIE方法引物和探针，在反应体系一致、模板浓度一致、反应条件一致的情况下，本发明所提供的引物探针比OIE推荐的引物探针的反应循环数明显低。检测实例取去壳的新鲜南美白对奸奸肉(中山市阜沙镇永健养殖场采集)IOOmg,用天根病毒检测用提取试剂盒(离心柱型SD101)提取病毒RNA，用天根QuantcDNA第一链合成试剂盒将提取的RNA反转录成cDNA。以pGMT-CPI为模板作为阳性对照，以双蒸去离子水为模板作为阴性对照，以反转录得到的cDNA为模板为检测反应，加入实施例I中的引物对及探针，配制成25 μ L反应体系，含有10Xbuffer (含Mg2+) 2. 5 μ I、dNTPl μ I, Taq DNA聚合酶
O.5 μ L，引物终浓度分别为O. I μ mol/L、探针的终浓度为O. 06 μ mol/L，用双蒸水将体积调整为 25 μ L。PCR 的反应条件为48°C 5min ;95°C 5min ;95°C 15s，60°C 15s，40 个循环。阳性对照呈明显扩增曲线，阴性对照在35个Ct值下无明显扩增为体系反应正常；如果检测反应在35Ct值以下有明显扩增曲线，则判断为阳性，在35Ct值以下无明显扩增曲线，则判断为阴性。由于该病在国内尚没有爆发案例发生，因此采用添加阳性标准质粒的方式，验证其检测的有效性。试验实施中添加标准分子DNA低达O. 0015ng，Ct值为25左右。实验中共提取了 30组对虾样品总RNA，经逆转录后，其中18个样品的cDNA模板添加了阳性对照质粒，12个没有添加，结果18个添加样品的阳性扩增率为100%。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的·限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种南美白对虾传染性肌肉坏死病的检测方法，其特征在于包含以下步骤 (1)设计实时荧光定量PCR所需要的引物和探针如下所示，方向5’一 3’ 正向引物 CPI-603 GGGAGTAGATATAAATGTTCAG ；反向引物 CPI-732 CAACCACCCAAATTCATA ；探针 PCPI-712 FAM-CACCTGCTACCACTTCTTCTCTT-TAMRA ； (2)检测以南美白对虾肌肉组织为材料提取RNA，逆转录，得到cDNA；以cDNA为模板，在荧光PCR反应体系中加入步骤⑴设计的引物和探针，设定实时荧光PCR仪反应程序，进行实时荧光PCR，从而检测出所检测的南美白对虾是否为传染性肌肉坏死病毒阳性。
2.根据权利要求I所述的南美白对虾传染性肌肉坏死病的检测方法，其特征在于步骤(2)中所述的实时荧光定量PCR的反应体系为每25 μ L反应体系中含有10倍浓度的含镁离子的TaqDNA聚合酶缓冲液2. 5 μ l、10mM dNTPly I、TaqDNA聚合酶O. 5 μ L、正向引物CPI-603、反向引物CPI-732以及探针PCPI-712 ;正向引物CPI-603和反向引物CPI-732的终浓度分别为O. I μ mol/L、探针PCPI-712的终浓度为O. 06 μ mol/L。
3.根据权利要求I所述的南美白对虾传染性肌肉坏死病的检测方法，其特征在于步骤(2)中所述的实时荧光定量PCR的条件为48°C 5min ；95°C 5min ；95°C 15s，60°C 15s，40个循环。
4.实现权利要求I 3任一项所述的南美白对虾传染性肌肉坏死病核酸的检测方法的试剂盒，其特征在于包含正向引物、反向引物和荧光标记探针，其中引物和探针如下 正向引物 CPI-603 5' -GGGAGTAGATATAAATGTTCAG-3'； 反向引物 CPI-732 5' -CAACCACCCAAATTCATA-3'；探针 PCPI-712 :5' -FAM-CACCTGCTACCACTTCTTCTCTT-TAMRA-3'。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还包含RT-PCR缓冲液、逆转录反应酶混合物和DEPC处理水。
全文摘要
本发明公开了一种南美白对虾传染性肌肉坏死病的检测方法及试剂盒。本发明以南美白对虾肌肉组织的cDNA为模板，在荧光PCR反应体系中加入引物和探针，进行实时荧光定量PCR，能够有效检测南美白对虾是否被传染性肌肉坏死病毒感染；引物对为5′-GGGAGTAGATATAAATGTTCAG-3′和5′-CAACCACCCAAATTCATA-3′；探针为5′-FAM-CACCTGCTACCACTTCTTCTCTT-TAMRA-3′。实现该方法的试剂盒主要包含该引物对和探针。本发明提供的方法和试剂盒准确、快速，其检测结果与其他检测技术相比，特异性好，检测灵敏度高，具有更大的可靠性和适应性，提高了检测效率，从而为南美白对虾传染性肌肉坏死病毒提供更有为效的检测手段。
文档编号C12Q1/68GK102888468SQ20121038412
公开日2013年1月23日 申请日期2012年10月11日 优先权日2012年10月11日
发明者岳巧云, 邱德义, 蔡先全, 王一飞, 闫冬春, 胡佳, 刘国雄, 汪小东, 魏晓雅, 刘德星 申请人:中华人民共和国中山出入境检验检疫局