一种鳜传染性脾肾坏死病毒isknv的增殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法。
【背景技术】
[0002]鳜鱼(Siniperca chuatsi)是我国重要的淡水特色养殖品种之一,而近年来由传染性脾肾坏死病毒(Infect1us spleen and kidney necrosis virus, ISKNV)引起的績虹彩病毒病给鳜鱼养殖产业造成了严重的经济损失。1997年，吴淑勤等首先在患病鳜鱼中发现了直径150nm的球形病毒，并认为是鳜鱼暴发性传染病的病原。1998年，何建国等通过回归感染进一步证明了该病毒的病原性，通过组织学研究发现鳜鱼脾脏和肾脏是其感染的主要器官，将其命名为传染性脾肾坏死病毒，并通过主衣壳蛋白(MCP)基因等序列分析确定其为一种虹彩病毒。根据国际病毒分类委员会(Internat1nal Committee on Taxonomy ofViruses, ICTV)第八次报告，ISKNV是虹彩病毒科肿大细胞病毒属的代表种，其传染力强，发病率高达30%，致死率高达90%以上，可以感染近60种淡水和海水鱼，给鳜鱼、加洲鲈、乌鳢、美国红鱼、石斑鱼等海淡水鱼类养殖业造成了巨大威胁。自1994年以来，ISKNV给我国鳜鱼养殖业造成的平均年经济损失高达2亿元，是制约鳜鱼养殖业健康发展的主要瓶颈。
[0003]免疫接种是预防传染病发生的主要手段，付小哲实验室建立了 ISKNV敏感的鳜脑组织细胞系CPB，研制出细胞培养灭活疫苗。但如何以低成本生产获得高滴度病毒是疫苗制备的关键步骤。病毒接种方法有两种，同步接毒和异步接毒。同步接毒法是在细胞传代同时或不久接种毒种，进行培养，如猫、犬传染性肠炎疫苗(细小病毒)；异步接毒法是在细胞形成单层后接种毒种，如流行性乙型脑炎细胞培养疫苗。目前多数病毒采用异步接毒法这种接毒方式。
[0004]罗维等在适合猪圆环病毒2生长的PK15均质细胞株的构建中发现异步接毒样品的PCR检测结果均为阳性，且信号都较强，说明异步接毒比同步接毒要稳定，重复性较好，不会出现接不上毒的情况。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法。
[0006]本发明所采取的技术方案是:
一种鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法，包括以下步骤:
1)将ISKNV敏感的鳜脑组织细胞系CPB传代后培养20?96小时，使用胰酶消化细胞；
2)将消化后的CPB细胞转入含有5%v/v?10%v/v胎牛血清的L15培养液中，同时接种ISKNV ；
3)28?32°C恒温培养接种后的鳜脑组织细胞系CPB 2d?12d，收获细胞并提取病毒核酸。
[0007]进一步的，上述鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的低成本增殖方法中，步骤I)中ISKNV敏感的鳜脑组织细胞系CPB传代后培养时间为30h?60h。
[0008]进一步的，上述鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的低成本增殖方法中，步骤2)中培养液中胎牛血清的添加量为5%v/v?8%v/v。
[0009]进一步的，上述鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的低成本增殖方法中，步骤2)中按照MOI值为0.85?2.3接种ISKNV。
[0010]进一步的，上述鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的低成本增殖方法中，步骤3)中恒温培养，观察CPE达80%以上时收获细胞并提取病毒核酸。
[0011]进一步的，上述鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的短时间增殖方法中，步骤I)中ISKNV敏感的鳜脑组织细胞系CPB传代后培养时间为20h?40h。
[0012]进一步的，上述鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的短时间增殖方法中，步骤2)中培养液中胎牛血清的添加量为8%?10%v/v。
[0013]进一步的，上述鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的短时间增殖方法中，步骤2)中按照MOI值为30?45接种ISKNV。
[0014]进一步的，上述鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的短时间增殖方法中，步骤3)中恒温培养，观察CPE达80%以上时收获细胞并提取病毒核酸。
[0015]本发明的有益效果是:
本发明采用了同步接毒法培养鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV。选择处于对数生长期的ISKNV敏感的鳜脑组织细胞系CPB细胞，此时CPB细胞分裂生长旺盛，状态良好，利于病毒增殖，是最适合接种ISKNV的细胞；同时采用同步接毒法的病毒与CPB细胞成悬浮状态，互相接触的表面积大，使病毒通过更多的空间受体进入细胞；此外在细胞分裂增殖的同时病毒侵染细胞，病毒不必再通过细胞间传递而几乎侵染到全体细胞，所以能够获得高含量的鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV。
[0016]本发明单从价格成本即培养液的成本来考虑，按照发明中的方法，将ISKNV原液稀释按照MOI为0.85?2.3同步接种于培养48h处于对数生长中期数量约为1.08 X 15个/ml的CPB细胞，培养液中胎牛血清终浓度为6%时，28°C恒温培养9d后CPE达80%以上时收获细胞，400ul细胞液所含病毒拷贝数最多可达2.54X 18个拷贝。核算后得到，每元人民币所得病毒量最高为4.24X 111个拷贝，时间成本为2.31 X 10 8拷贝/天。
[0017]本发明从时间成本考虑即尽可能缩短细胞培养时间和病毒培养时间的角度来考虑，按照发明中的方法，将病毒原液稀释按照MOI为30?45同步接种培养24h处于对数生长早期浓度为0.92 X 15个/mL的CPB细胞，培养液中胎牛血清终浓度为10%，28°C培养4d后CPE达80%以上时收获细胞，每日所得病毒量最高，为3.64X 18个拷贝/天。
[0018]本发明分别提供了低成本的鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法以及短时间的鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法。可根据不同需要选择最适合的接毒方法，即在时间充裕的情况下选择第一种接毒方法即用最低的价格成本生产出最高的病毒拷贝数，当时间比较紧张时则可选取第二种接毒方法即在最短的时间内生产出最高的病毒拷贝数。该研究为低成本疫苗的生产提供了理论依据。
【附图说明】
[0019]图1为ISKNV敏感的鳜脑组织细胞系CPB生长曲线。
【具体实施方式】
[0020]实验材料:
ISKNV敏感的鳜脑组织细胞系(CPB)由本实验室付小哲等建立并保藏；鳜传染性脾肾坏死病毒QY株(ISKNV-QY)由本实验室分离保存；L15培养基、胎牛血清、胰酶为Gibco公司产品；DNA提取试剂盒为OMEGA公司产品；10XTaq反应缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Premix Ex TaqTM 购于 TaKaRa 公司。
[0021]病毒含量的测定方法:
收获的病毒液在_20°C的条件下反复冻融3次后，置_70°C保存。取400ul含有病毒的CPB细胞液按照OMEGA公司的DNA提取试剂盒说明书提取病毒核酸后，在荧光定量PCR仪上(ABI 7500)检测病毒含量，根据付小哲等报道的公式CT= -3.3141gx + 41.48 (x代表病毒拷贝数)计算病毒拷贝数(Fu X，Li N, Lai Y, et al.A novel fish cell linederived from the brain of Chinese perch Siniperca chuats1: development andcharacterizat1n[J].Journal of Fish B1logy, 2015，86(I):32 - 45.)。
[0022]数据的处理:
以价格成本为参考因素，将所测得的病毒拷贝数进行不同方式处理，分别折算成价格成本(Y)即每元人民币所得病毒拷贝数(拷贝/元)和时间成本(D)即每日所得的病毒拷贝数(拷贝/天)，对培养增殖条件进行评价。ISKNV增殖所用培养基成本主要包括L15培养基和胎牛血清，其中L15培养基的价钱为65元/L，胎牛血清为10000元/L，以培养IL体积病毒计算，胎牛血清浓度为6%的培养基价格分别为665元，则增殖病毒所产生的价格成本(Y)计算公式如下:Y =106χ /665 ;增殖病毒所产生的时间成本(D)计算公式如下:D=x/ (接毒前细胞培养天数+接毒后病毒培养天数)，其中X代表病毒拷贝数，并依据上述公式进行数据处理。
[0023]数据统计分析:
实验所得数据均表示为平均数土标准差(mean土SD)，采用软件Oringin Pro 8.0进行数据处理，并利用t检验进行差异性分析，当P < 0.05时差异显著，p〈0.01时差异极显