著。
[0024]实施例1
通过Countstar细胞计数仪测定传代至65代培养0h、24h、48h、72h、96h的CPB数量，制作细胞生长曲线(见图1)。选取培养48h、处于对数生长期中期的细胞，使用胰酶进行消化，I?2min后倒掉胰酶，加入含有6%v/v胎牛血清的L15培养液将CPB重悬，同时将ISKNV原液稀释，按照MOI为0.85?2.3同步接种CPB。28°C恒温培养接种后的鳜脑组织细胞系CPB，待CPE达80%以上时收毒。
[0025]测定病毒含量，处理数据以及统计分析。
[0026]结果分析:处于对数生长中期数量为1.08 X 15个/ml的CPB细胞，最适合接种ISKNV，经过培养和收毒，400ul细胞液所含病毒拷贝数最多可达2.54X 108个拷贝。核算后得到，每元人民币所得病毒量最高为4.24X 111个拷贝/元，时间成本为2.31 X 10 8拷贝/天。在时间充裕的情况下，可选择实施例1的接毒方法，用最低的价格成本生产出最高的病毒拷贝数。
[0027]实施例2
选取传代至65代CPB细胞，28°C恒温培养。选取培养24h、处于对数生长期早期的细胞，使用胰酶进行消化，I?2min后倒掉胰酶，加入含有10%v/v胎牛血清的L15培养液将CPB重悬，并将ISKNV原液稀释，按照MOI为30?45同步接种CPB。28 °C恒温培养接种后的鳜脑组织细胞系CPBJt CPE达80%以上时收毒。
[0028]测定病毒含量，处理数据以及统计分析。
[0029]结果分析:处于对数生长早期数量为0.92 X 15个/ml的CPB细胞，最适合接种ISKNV，经过培养和收毒，400ul细胞液所含病毒拷贝数最多可达1.62 X 18个拷贝。核算后得到，每元人民币所得病毒量最高为1.62X 111个拷贝/元，时间成本为3.64X 10 8拷贝/天。当时间比较紧张的情况下，可选取实施例2的接毒方法，用最短的时间内生产出最高的病毒拷贝数。
[0030]对比例I
选取传代至65代CPB细胞，28°C恒温培养。选取培养72h、处于对数生长期中晚期的细胞，使用胰酶消化细胞。将消化后的细胞CPB转入含有10%v/v胎牛血清的L15培养液中，并将ISKNV原液稀释按照MOI为21?36同步接种CPB。28°C恒温培养接种后的鳜脑组织细胞系CPB，观察CPE达80%以上时收毒。
[0031]测定病毒含量，处理数据以及统计分析。
[0032]结果分析:处于对数生长中晚期数量为1.23X 15个/ml的CPB细胞，接种ISKNV后，经过培养和收毒，400ul细胞液所含病毒拷贝数最多可达1.03X 18个拷贝。核算后得至IJ，每元人民币所得病毒量最高为1.03X 111个拷贝/元，时间成本为1.28X 18拷贝/天。在时间充裕的情况下，对比例I中的接毒结果在价格成本和时间成本方面都差于实施例1，差异极显著(p〈0.01)。
[0033]对比例2
选取传代至65代CPB细胞，28°C恒温培养。选取培养24h、处于对数生长期早期的细胞，使用胰酶进行消化，I?2min后倒掉胰酶，加入含有8%v/v胎牛血清的L15培养液将CPB重悬，同时将ISKNV原液稀释，按照MOI为48?58同步接种CPB。28°C恒温培养接种后的鳜脑组织细胞系CPB，观察CPE达80%以上时收毒。
[0034]测定病毒含量，处理数据以及统计分析。
[0035]结果分析:处于对数生长早期数量为0.92X 105个/ml的CPB细胞，接种ISKNV后，经过培养和收毒，400ul细胞液所含病毒拷贝数最多可达1.3 X 18个拷贝。核算后得到，每元人民币所得病毒量最高为1.63X 111个拷贝/元，时间成本为2.61 X 10 8拷贝/天。在时间比较紧张的情况下，对比例2中的接毒结果在价格成本与实施例2持平，时间成本差于实施例2，差异显著(p〈0.05)。
[0036]对比例3
选取培养48h、处于对数生长期中期的CPB细胞，使用胰酶进行消化，I?2min后倒掉胰酶，加入含有8%v/v胎牛血清的L15培养液将CPB重悬，同时将ISKNV原液稀释，按照MOI为48?58同步接种CPB。28°C恒温培养4天后收获，400ul细胞液得到病毒的拷贝数约为1.22 X 108，折算成价格成本为1.53 X 111拷贝/元，时间成本为1.75 X 10 8拷贝/天。通过对比，优化后实施例1比本对比例3每元所得病毒拷贝数提高了 63.9%，而实施例2每天所得病毒拷贝数比对比例3提高51.9%。
[0037]异步接种对比例I 选取传代至65代CPB细胞，28°C恒温培养。选取培养48h、处于对数生长期中期的细胞，使用胰酶进行消化，I?2min后倒掉胰酶，加入含有10%v/v胎牛血清的L15培养液将CPB重悬，按照I传3的比例进行分瓶，28°C恒温培养I?2天，待细胞长成单层后再进行接毒。将ISKNV原液稀释，按照MOI为1.65 X 13接种CPB。28°C恒温培养接种后的鳜脑组织细胞系CPB，待CPE达80%以上时收毒。
[0038]测定病毒含量，处理数据以及统计分析。
[0039]结果分析:400ul细胞液所含得到病毒的拷贝数约为8.89X 108，折算成价格成本为1.11 X 111拷贝/元，时间成本为9.87 X 10 6拷贝/天，与本研究中所选用的同步接毒法相比差异极显著(P〈0.01)，说明本研究建立的同步接毒法能够提高ISKNV的产量、降低生产成本，更具有产业化应用前景。
【主权项】
1.一种鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于:包括以下步骤: 1)将ISKNV敏感的鳜脑组织细胞系CPB传代后培养20?96小时，使用胰酶消化细胞； 2)将消化后的CPB细胞转入含有5%v/v?10%v/v胎牛血清的L15培养液中，同时接种ISKNV ； 3)28?32°C恒温培养接种后的鳜脑组织细胞系CPB 2d?12d，收获细胞并提取病毒核酸。
2.根据权利要求1所述的一种鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于:步骤I)中ISKNV敏感的鳜脑组织细胞系CPB传代后培养时间为30h?60h。
3.根据权利要求2所述的一种鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于:步骤2)中培养液中胎牛血清的添加量为5%v/v?8%v/v。
4.根据权利要求2所述的一种鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于:步骤2)中按照MOI值为0.85?2.3接种ISKNV。
5.根据权利要求2所述的一种鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于:步骤3)中恒温培养，观察CPE达80%以上时收获细胞并提取病毒核酸。
6.根据权利要求1所述的一种鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于:步骤I)中ISKNV敏感的鳜脑组织细胞系CPB传代后培养时间为20h?40h。
7.根据权利要求6所述的一种鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于:步骤2)中培养液中胎牛血清的添加量为8%v/v?10%v/v。
8.根据权利要求6所述的一种鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于:步骤2)中按照MOI值为30?45接种ISKNV。
9.根据权利要求6所述的一种鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于:步骤3)中恒温培养，观察CPE达80%以上时收获细胞并提取病毒核酸。
【专利摘要】本发明公开了一种鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法。本发明采用同步接毒的方式，病毒与鳜脑组织细胞系CPB成悬浮状态，互相接触的表面积大，使病毒通过更多的空间受体进入细胞；病毒在细胞分裂增殖的同时侵染细胞，从而获得高含量的ISKNV。当CPB培养30h～60h后，转入5%～8%v/v胎牛血清培养基中，同步接种ISKNV的MOI值为0.85～2.3，得到低成本的ISKNV增殖方法。当CPB培养20h～40h后，转入8%～10%v/v胎牛血清培养基中，同步接种ISKNV 的MOI值为30～45，得到短时间的ISKNV增殖方法。可根据现有条件选择培养方法，本发明为低成本疫苗的生产提供了理论依据。
【IPC分类】C12R1-93, C12N7-00
【公开号】CN104694483
【申请号】CN201510076301
【发明人】罗霞, 付小哲, 李宁求, 黄志斌, 林强
【申请人】中国水产科学研究院珠江水产研究所
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年2月11日