一种新型神经干细胞培养添加剂及筛选方法、应用及利用该添加剂的培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞技术领域，涉及一种细胞培养添加剂，尤其是一种新型神经干细 胞培养添加剂及筛选方法、应用及利用该添加剂的培养基。
【背景技术】
[0002] 干细胞（stemcell)是身体内的原始未分化细胞，而神经干细胞（neuralstem cell，NSC)和神经前体（母）细胞（neuralprecursorcell，NPC，是初级分化的神经干细 胞）是神经系统的干细胞。因为其在治疗神经系统疾病和损伤中的广阔使用前景，近年来 的研宄和临床应用突飞猛进地发展。而神经干系统应用最首要的是能够在体外成功地培养 并获得增殖神经干细胞。因为神经是机体中最复杂和最高度分化的组织，神经干细胞的培 养难度极高，在培养过程中极其容易自发分化，从而很快就失去干细胞的特性和功能。所以 培养基的优化是必须的，也是极为困难的。
[0003] 目前最简单的神经干细胞培养基是在基础培养基DMEM及DMEM/F12 (1:1)和碱性 成纤维细胞生长因子（bFGF)，表皮生长因子（EGF)内加入N2培养添加剂。N2添加剂的成 分比较简单，含有细胞生长所必需的0. 025晕克/毫升胰岛素，0. 1晕克/毫升转铁蛋白以 及20微摩尔孕酮，100微摩尔腐胺，和30毫微摩尔亚硒酸钠（BottensteinandSato)。但 是因为其中总蛋白含量低，而且缺乏一些细胞生长的需求物，因此不能完全满足现有的神 经干细胞培养的使用需求。
[0004] 目前，解决N2培养添加剂存在的问题，最广泛使用的是在上述神经干细胞培养 基的基础上加入B27培养添加剂。但是，B27添加剂原本是为培养神经元设计的（Brewer etal.)，其成分相当复杂，且包含皮质酮、视黄醇和三碘-L-甲状腺原氨酸（T3)，这些成分 已被证明为会导致神经干细胞（neuralstemcell，NSC)和神经前体（母）细胞（neural precursorcell，NPC)分化的成分。还有一些B27成分并非神经干细胞所需的，或是已经 被N2所提供。
[0005] 其中，上述B27添加剂成分如下：生物素，左旋肉碱，胆固醇，皮质酮，乙醇胺， D(+) _半乳糖，谷胱甘肽，卵磷脂，亚油酸，亚麻酸，磷脂酰胆碱，孕酮，腐胺，视黄醇，视黄醇 乙酸酯，亚硒酸钠，三碘-L-甲状腺原氨酸（T3)，DL_a-维生素E，牛血清白蛋白，过氧化氢 酶，胰岛素，超氧化物歧化酶，转铁蛋白。
[0006] 通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种设计科学、配方简单、成本 低廉、经济合理，并能促进神经干细胞增殖而降低其向胶质细胞分化的新型神经干细胞培 养添加剂及筛选方法、应用及利用该添加剂的培养基。
[0008] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
[0009] -种新型神经干细胞培养添加剂，其组成成分及最终使用浓度为：
[0010] 牛血清白蛋白1晕克/毫升，生物素50晕微克/毫升，左旋肉碱1微克/毫升，乙 醇胺〇. 5微克/毫升，D⑴-半乳糖7. 5微克/毫升，谷胱甘肽0. 1微摩尔和亚硒酸钠30毫 微摩尔。
[0011] 利用如上所述的新型神经干细胞培养添加剂的培养基，所述培养基中添加新型神 经干细胞培养添加剂。
[0012] 而且，其组成成分及比例如下：
[0013] DMHM培养基和DMEM/F12培养基的合成培养基，其中DMHM和DMEM/F12的体积比 为 1:1 ;
[0014]N2培养添加剂，N2培养添加剂的成分和使用浓度：0. 025毫克/毫升胰岛素，0. 1 毫克/毫升转铁蛋白，20微摩尔孕酮，100微摩尔腐胺和30毫微摩尔亚硒酸钠；
[0015] 10晕微克/毫升碱性成纤维细胞生长因子和20晕微克/毫升表皮生长因子；
[0016] 以及上述新型神经干细胞培养添加剂。
[0017] 如上所述的新型神经干细胞培养添加剂在培养神经干细胞方面的应用。
[0018] 而且，所述神经干细胞为哺乳动物的神经干细胞。
[0019] -种如上所述的新型神经干细胞培养添加剂的筛选方法，步骤如下：
[0020] ⑴挑选B27培养添加剂中成分组成一个简化培养添加剂配方，该配方的最终使用 浓度含有牛血清白蛋白1毫克/毫升，生物素50毫微克/毫升，左旋肉碱1微克/毫升，乙 醇胺〇. 5微克/毫升，D⑴-半乳糖7. 5微克/毫升，谷胱甘肽0. 1微摩尔和亚硒酸钠30毫 微摩尔；然后在基本培养基的基础上比较该简化培养添加剂和B27培养添加剂对神经干细 胞生长的促进作用；之后再在简化培养添加剂的基础上逐个加入其它B27中成分以测定其 是否有添加效果；
[0021] ⑵细胞培养：
[0022] 1)解剖取材妊娠12. 5天和13. 5之间胚胎小鼠的大脑皮质（el2. 5-13. 5);
[0023] 2)DMEM洗涤培养后神经组织一次，在10单位/毫升木瓜蛋白酶和4毫克/毫升 DNA酶溶液中，37°C消化45分钟；
[0024] 3)加入4毫克/毫升DNA酶后用吸管轻轻地吹打5-7次以分散组织；
[0025] 4)在1000转/分钟离心5分钟，再悬浮于无钙镁的Hanks平衡盐溶液中清洗；重 复三次后，将制成的单细胞悬液经台盼蓝染色后用血细胞计数仪测定细胞密度；
[0026] 5)按5X104/平方厘米的密度将细胞悬浮在含有新型简化培养添加剂的神经干 细胞完全培养基中，接种于24孔培养板中；细胞培养板先涂覆过15毫微克/毫升多聚鸟 氨酸，然后是3毫微克/毫升的纤维连接蛋白；在37°C5%C02水套式二氧化碳培养箱里培 养；
[0027] 6)每两天作总量四分之三培养基的换液，直至细胞长满培养板时，一般需要6-7 天，即可用来进行3H_胸腺嘧啶核苷掺入法来测定小鼠神经干细胞增殖；
[0028] 7)为了用免疫细胞化学染色来决定培养中各种分化后细胞所占的比例，需要在细 胞长满培养板时全部换用新鲜培养基并撤除碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子以 促使干细胞分化成为神经元和胶质细胞；四天后用4%多聚甲醛固定之后作免疫细胞化学 染色；
[0029] ⑶3H_胸腺嘧啶核苷掺入法来测定小鼠神经干细胞增殖：
[0030] 首先向培养液中加入0. 5毫微居里/毫升3H-胸腺嘧啶核苷并孵育24小时；用 10%三氯乙酸沉淀细胞的DNA10分钟，在室温和10%三氯醋酸洗涤两次后，用0. 2摩尔氢氧 化钠在室温下提取DNA样品10分钟，所述DNA样品含4毫克％切碎的DNA;同液体闪烁液 混合后在液体闪烁计数仪上测量同位素放射量；
[0031] ⑷免疫细胞化学染色来决定培养中各种细胞的比例
[0032] 用4%多聚甲醛在室温固定细胞培养25分钟，用磷酸缓冲盐水（PBS)洗涤三次； 对于细胞内抗原的染色，在〇. 1%TritonX-100中破细胞膜30分钟，接着在5%正常山羊 血清孵育30分钟以阻断非特异性结合；在室温孵育2小时；使用抗体是小鼠单克隆抗-微 管蛋白用于染神经元，1:750稀释，兔多克隆抗GFAP用于染星形胶质细胞（1:400);小鼠单 克隆抗04用于染少突胶质细胞及其前体细胞（1:10);用PBS洗三次后，在生物素标记的羊 抗鼠IgG二抗中孵育1小时；用PBS洗三次后，在链霉亲和素碱性磷酸酶溶液孵育30分钟； 最后用底物BCIP/NBT显示颜色；在倒置显微镜下观察和计数；
[0033] 所述各种细胞的比例是细胞数量比；
[0034] (5)选取具有最强的促进神经干细胞增殖的简化培养添加剂配方，即得新型神经干 细胞培养添加剂的筛选方法。
[0035] 而且，所述步骤中⑴中的基本培养基的组成是：DMEM和DMEM/F12(体积比为1:1) 合成培养基，加N2培养添加剂和10晕微克/毫升碱性成纤维细胞生长因子和20晕微克/ 毫升表皮生长因子；
[0036] 其中，所述N2培养添加剂按1:100体积比从商售浓缩液稀释于合成培养基中。
[0037] 本发明的优点和积极效果是：
[0038] 1、本发明添加剂设计科学、配方简单、成本低廉、经济合理，并能促进神经干细胞 增殖而降低其向胶质细胞分化，该培养添加剂能够应用在培养神经干细胞方面，包括人在 内的所有哺乳动物的神经干细胞和神经前体细胞的培养，使用范围极为广泛。
[0039] 2、本发明添加剂对神经干细胞培养时，在添加N2的基础上，该培养添加剂具有最 强的促进神经干细胞增殖作用，细胞增殖比只有N2时高出30%，其效果优于复杂且昂贵的 B27(图1)。相比之下B27比只有N2时只高出微不足道的5%，而且没有显著性差异；在N2 和该培养添加剂基础上增加三碘-L-甲状腺原氨酸（T3)或维生素E对神经干细胞生长有 抑制作用，而其他的B27成分包括皮质酮，视黄醇，脂酸，谷胱甘肽，过氧化氢酶+超氧化物 歧化酶（SOD)则无明显的添加作用。这些结果证明N2加上简化培养添加剂足以满足神经 干细胞高度生长的需要，没有必要添加其它的B27培养添加剂的成分，因此节约了成本。
[0040] 3、本发明添加剂对神经干细胞培养时，在N2的