从成人外周血中自动化提取免疫细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及从血液特别是外周血中自动分离免疫细胞的方法及其在治疗疾病中的应用，具体涉及从健康人体的血液中特别是外周血中自动分离免疫细胞并冻存，以及在出现免疫低下或发生疾病症状时，将免疫细胞进行体外扩增并施用于患者进行免疫细胞治疗的方法。
【背景技术】
[0002]免疫细胞(immune cell)是白细胞的俗称，包括淋巴细胞和各种吞噬细胞，也特指能识别抗原、产生特异性免疫应答的淋巴细胞。淋巴细胞是免疫系统的基本成分，在体内分布很广泛。研宄发现血液中蕴含丰富的淋巴细胞，由于这类细胞具有免疫调控和自我复制等特点，所以一直受到人们的关注。淋巴细胞具有自然杀伤和自我保护的特性，针对病毒、细菌、真菌感染的治疗均起到关键的作用，在癌症的治疗中具有很大的临床应用价值。
[0003]免疫细胞在健康人体的血液中蕴含丰富，但由于年龄老化、亚健康、罹患疾病等原因，血液中的免疫细胞数目会显著降低，增殖分化能力亦大幅度衰退；而其他健康人的免疫细胞移植给患者则可能引起免疫排斥反应；提取免疫细胞过程对患者的损伤性和在采集时遇到的其他问题，都直接影响了免疫细胞的临床应用，使得寻找一种稳定可靠的免疫细胞获取来源成为一个重要的问题。
[0004]研宄显示，健康人的新鲜血液中含有大量有效的免疫细胞并且能有效分离，这种组织来源的免疫细胞不仅保持了免疫细胞的特异性免疫应答的生物学特性，而且分离出来的免疫细胞具有原始的、强劲的增殖能力，同时还易于冷冻保存和复苏。由于免疫细胞起源于自身，大大减低了触发免疫反应及引起移植物抗宿主病的风险。潜伏性病毒和微生物的感染及传播几率比较低。采集过程简单，对健康的被采集者无任何危害及损伤。以上原因足以令从血液中分离免疫细胞成为获得免疫细胞的有效途径。
[0005]但是，目前关于血液免疫细胞的分离和扩增方法不一，且大多步骤复杂，获得较多数量血液免疫细胞也存在一定困难，同时患者在罹患疾病时采集血液存在一定风险。因此，本领域需要有从血液中分离、保存和扩增免疫细胞的简单、有效的方法，以满足医药、科研、临床应用等领域的需求。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是解决现有技术提取、冻存、复苏血液免疫细胞方法的缺陷，提供一种简单有效的血液免疫细胞的提取方法，以及相配套使用的冻存和复苏的方法，以及复苏后免疫细胞扩增的方法。本发明发现使用特定操作步骤的提取、冻存、复苏以及扩增，可以有效地获得免疫细胞。本发明基于此发现而得以完成。
[0007]本发明方法中使用到一种称为AXP(Auto Xpress Platform)的全自动细胞分离设备，其是美国TG公司(ThermoGenesis)制造的，TG公司是全球范围内专业从事干细胞与再生医学相关医疗设备与技术开发的国际领导型企业。公司研发的AXP、B1Archive等干细胞全自动化技术设备，获得国际干细胞行业的广泛认可，并已得到美国食品药品管理局(FDA)和美国血库协会(AABB)等行业管理机构与协会的认同。目前，世界最大的CBR私人血库，纽约NYBC公共血库以及台湾、香港等地区的170多家血库都纷纷弓I进他们的设备，全面实现干细胞技术自动化。AXP全自动干细胞分离设备根据国际干细胞、血库的行业技术要求设计发明的，不仅能全密闭式分离干细胞，将污染程度降到最低点，还能将干细胞的质量从手工采集的70%提升到98.7%。自动化将是国内干细胞产业技术的一个里程碑。
[0008]本发明第一方面提供了从健康哺乳动物的新鲜血液中获取免疫细胞的方法，具体提供了从成人外周血中自动化提取免疫细胞的方法，该方法包括以下分离步骤:
[0009](a)全血样本预处理:将采集的成人外周血血样，转移至AXP处理袋中，加入羟乙基淀粉溶液放置在摇床上充分混匀(其中血样与羟乙基淀粉溶液的混合体积比为2?6:1，例如3?5:1，例如4:1)；
[0010](b)自动分离^fAXP处理袋放入AXP全自动细胞分离设备后，进行自动分离；
[0011](c)单个核细胞(在本文中可用缩写MNC表示)收集:由AXP全自动细胞分离设备自动分离得到的免疫细胞自动收集于AXP全自动细胞分离设备内所附的冻存袋中；
[0012]以及任选的下列步骤:
[0013](d)针对步骤(C)所得免疫细胞，检测以下项目的至少一项:单个核细胞总数、单个核细胞活率、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型。
[0014]根据本发明第一方面的方法，该方法还包括以下对提取的免疫细胞进行冻存的步骤:
[0015](e)单个核细胞冻存:向步骤(C)提取的免疫细胞中加入冻存液，重悬免疫细胞，将免疫细胞加入冻存容器，程序降温，然后再将冻存容器置于液氮罐中长期储存；
[0016]以及任选的下列步骤:
[0017](f)建立包含步骤以上信息的免疫细胞的数据库，并使该数据库与步骤(e)的冻存免疫细胞进行关联。
[0018]根据本发明第一方面的方法，该方法还包括以下对冻存的免疫细胞进行复苏的步骤:
[0019](g)细胞复苏:将步骤(e)冻存的冻存容器从液氮罐中取出，水浴，清洗冻存容器表面后转移至生物安全柜中，将免疫细胞转移至装有培养基的离心容器中，重悬，混匀，补加培养基，离心洗涤；
[0020]以及任选的下列步骤:
[0021](h)针对步骤(g)所得复苏的免疫细胞，检测以下项目的至少一项:单个核细胞总数、单个核细胞活率及复苏率、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型。
[0022]根据本发明第一方面的方法，该方法还包括以下对复苏的免疫细胞进行扩增的步骤:
[0023](i)细胞扩增:用含有培养基和血清的细胞培养液对复苏后的单个核细胞进行重悬培养，吸出细胞培养液，转移至离心容器，反复吹洗贴壁细胞，直至贴壁细胞完全不被吹洗下来，获得未成熟树突状细胞(iDC)，添加培养基重悬未成熟树突状细胞(iDC)，将离心容器中的细胞培养液进行离心处理，获得的细胞沉淀为细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，针对iDC细胞和CIK细胞进行细胞计数，再分别针对iDC细胞及CIK细胞进行培养。
[0024]根据本发明第一方面的方法，所述哺乳动物是人。例如是成年人。
[0025]根据本发明第一方面的方法，所述新鲜血液是外周血。
[0026]根据本发明第一方面的方法，所述羟乙基淀粉溶液中羟乙基淀粉的浓度为4-8%，例如5-7%，例如6%。
[0027]根据本发明第一方面的方法，所述羟乙基淀粉溶液是将羟乙基淀粉添加到0.9%氯化钠溶液中配制得到的。
[0028]根据本发明第一方面的方法，所述羟乙基淀粉溶液中还包含麦芽糖。
[0029]根据本发明第一方面的方法，所述羟乙基淀粉溶液中还包含麦芽糖，麦芽糖的浓度为0.2?2%，特别是0.25?1.5%，特别是0.5?1%。已经出人意料地发现，在用AXP全自动细胞分离设备进行从外周血中自动分离免疫细胞时，使用添加了适量麦芽糖的羟乙基淀粉溶液稀释血样后，免疫细胞的收率至少可以提高15%，这具有极其重大的临床意义。
[0030]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中在AXP全自动细胞分离设备中进行自动分离时，执行两次离心处理，第一次离心条件为:1430rcf、20min、15°C，第二次离心条件为:80rcf、10min、15°C。众所周知，rcf (relative centrifugal force)系指相对离心力。
[0031]根据本发明第一方面的方法，在步骤(a)中，转移至AXP处理袋中的血液留取5ml血样于15ml离心容器中，用于血型检测。
[0032]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(d)所述的检测单个核细胞总数和单个核细胞活率是向步骤(c)收集的细胞沉淀中加入10-30ml生理盐水，优选20ml，用1ml移液管反复吹吸细胞，充分混匀，吸取20 μ I细胞，加入180 μ I台盼蓝染液，充分混匀后加入计数板计算细胞总数与活率，记录结果。
[0033]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(e)所述的冻存液是按照20-60重量份的X-VIVO无血清培养基、10-50重量份的人血清白蛋白和5-15重量份的DMSO的配方配制而成的，优选X-VIVO无血清培养基的配方量为30重量份、40重量份或50重量份，优选人血清白蛋白的配方量为20重量份、30重量份或40重量份，优选DMSO的配方量为8重量份、10重量份或12重量份。在一个实施方案中，冻存液中含有约50重量份的X-VIVO无血清培养基、约40重量份的人血清白蛋白和约10重量份的DMSO的冻存液。本发明人发现，含有约50重量份的X-VIVO无血清培养基、约40重量份的人血清白蛋白和约10重量份的DMSO的冻存液是特别优选的，比之于使该冻存液的任一成分含量变化10%以上的配方在提高冷冻效果、保护冷冻细胞等效果方面具有显著优势。
[0034]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(e)所述的冻存液配置10_20ml，优选15ml,放置于0-7 0C冰箱中备存，优选4 V。
[0035]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(e)所述的重悬免疫细胞是将步骤(C)获得的细胞沉淀按照2X 105-2X 109/ml的密度用冻存液充分混勾，优选2X 107/ml的密度。
[0036]根据本发明第一方面的方法，其中所述的冻存容器为冻存管，优选2ml的冻存管。
[0037]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(e)所述的将免疫细胞加入冻存容器后，将冻存容器用封口膜封口，并标示免疫细胞的相关信息，优选标示免疫细胞来源的标签。
[0038]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(e)所述的程序降温是将冻存容器放入程序降温装置(优选程序降温盒)中，放入0-7°C (优选4°C)冰箱中备用，转移至-100°C至-40 °C (优选-80 °C )的冰箱中储存20-36小时(优选24小时)，再将冻存容器从程序降温装置中取出。在一个实施方案中，冻存容器取出后，程序降温装置放入4°C冰箱以备下一次使用。
[0039]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(e)所述冻存容器置于液氮罐中长期储存，同时记录样本储存的位置。
[0040]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(g)所述水浴是将从液氮中取出的冻存容器迅速放入水浴装置(优选水浴锅)中实施的。在一个【具体实施方式】中，所述水浴装置的温度在体温附近，优选37°C。在一个【具体实施方式】中，所述冻存容器在水浴装置中反复震荡5-15次，优选8-10次，震荡时间控制在5min以内，优选控制在2min以内。在一个【具体实施方式】中，直至看到冻存容器中只剩下一团冰晶后从水浴装置中取出冻存容器。
[0041]根据本发明第一方