.52 X 16,复苏率为62 %。
[0137]实施例8、免疫细胞复苏的方法
[0138]参考实施例5的方法进行。志愿者王五(化名)，冻存密度为I X 10Vml的冻存免疫细胞复苏3管，细胞数量为4.57 X 17,复苏后细胞数量为3.42 X 17,复苏率为75 %。
[0139]实施例9、免疫细胞复苏的方法
[0140]参考实施例5的方法进行。志愿者王五(化名)，冻存密度为2 X 10Vml的冻存免疫细胞复苏2管，细胞数量为6.1XlO7,复苏后细胞数量为5.16 X 17,复苏率为85 %。
[0141]根据实施例5-9可以得出结论:以2Χ 17冻存密度保存的免疫细胞复苏率是最高的。
[0142]实施例10、复苏后免疫细胞扩增的方法
[0143]复苏后免疫细胞扩增的方法包括以下步骤:
[0144](9)细胞扩增:用含有X-VIVO无血清培养基及10%的自体人血清的细胞培养液对复苏后的单个核细胞进行重悬培养，细胞密度为4Χ 16个细胞，置于37°C温度条件下，5%的二氧化碳培养箱中孵育2小时；
[0145]2小时后，取出细胞培养瓶，将细胞培养液吸出，转移至50ml离心管中，剩下瓶中的贴壁细胞用生理盐水反复吹洗2-3遍，直至贴壁细胞完全不被吹洗下来，此时的细胞为未成熟树突状细胞(iDC)，添加2-3ml的X-VIVO无血清培养基重悬未成熟树突状细胞(iDC)；
[0146]将上述转移至50ml的离心管中的细胞培养液进行离心，获得的细胞沉淀为细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)；
[0147]吸取20 μ I细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，加入180 μ I台盼蓝染液，充分混匀后加入计数板计算细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)细胞总数和活率，单个核细胞总数减去细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)总数为未成熟树突状细胞(iDC)细胞计数；
[0148]未成熟树突状细胞(iDC)的培养为第I天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的细胞培养液、粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF) 1000U/ml和白细胞介素4 (IL-4) 500U/ml ;第4天，半量换液；第5天，加入抗原负载；第6天，加入人肿瘤坏死因子 α (TNF-α ) 1000U/ml 过夜；第 7 天，DC 第一次收获，计数，测定 CD80、CD86、CD83、CDllc、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；第9天，DC第二次收获，计数，测定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；第11天，DC第三次收获，计数，测定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；第13天，DC第四次收获，计数，测定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；
[0149]细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的培养为第I天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的细胞培养液及细胞因子INF-γ 1000U/ml ;第2天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的细胞培养液及细胞因子CD3单抗375ng/ml、白细胞介素2 (IL-2) 1000U/ml、白细胞介素I a (IL-1 a ) 500U/ml ;第4天，半量换液；第6天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的细胞培养液、白细胞介素2(IL-2) 1000U/ml、白细胞介素I a (IL-la)500U/ml ;第8天，补加一倍含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的细胞培养液、白细胞介素2(IL-2) 1000U/ml、白细胞介素I a (IL-1 a ) 500U/ml ;第12天，CIK 第一次收获，计数，测定 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD3-CD19+、CD4/CD8等细胞表面抗原的表达量；第14天，CIK第二次收获，计数，测定⑶3+、⑶3+⑶4+、⑶3+⑶8+、⑶3+⑶56+、⑶3-⑶19+、⑶4/⑶8等细胞表面抗原的表达量。
[0150]扩增结果在100X显微镜下拍摄图片，见图4。
[0151]志愿者张三(化名)的免疫细胞扩增，在第8天细胞开始增殖，克隆球明显，视野中仍有少许血小板(见图4a)，故在此换液，吹散克隆球，继续培养；在第10天细胞克隆明显增大，细胞已经有活化现象，视野清亮，血小板较少(见图4b)，此后继续加液即可。
[0152]实施例11、复苏后免疫细胞扩增的方法
[0153]参考实施例10的方法进行。扩增结果在100X显微镜下拍摄图片，见图5。志愿者李四(化名)的免疫细胞扩增，在第8天细胞开始增殖，克隆球明显，视野中仍有少许血小板(见图5a)，故在此换液，吹散克隆球，继续培养；在第10天细胞克隆明显增大，细胞已经有活化现象，视野清亮，血小板较少(见图5b)，此后继续加液即可。
[0154]实施例12、复苏后免疫细胞的药效实验
[0155]生物分布:通过生物分布分析来评价体内靶向性能。通过在10至12周龄的Balb/c雌性裸鼠体内皮下注射17个MDA-MB-231人乳癌细胞来获得荷瘤小鼠(Charles RiverLabor atories)。当可明显触及肿瘤时将小鼠分组(n ^ 5)并在生物分布8天、24h或2h之前，将复苏扩增的免疫细胞进行放射性碘化并注射到所有小鼠的侧向尾静脉中。在注射后24小时处死小鼠(12.5 μ g，3.3 μ Ci/小鼠)。对器官进行称重并用Packard Cobra伽玛计数器读出其放射性。代表性器官的放射性含量被表示为每克组织注射剂量的百分比ID/g) ο
[0156]这些实验的结果表明，冻存、复苏和扩增不会削弱免疫细胞的肿瘤靶向作用。
[0157]治疗:过在10至12周龄的Balb/c雌性裸鼠体内皮下注射2X 17个MDA-MB-231人乳癌细胞来获得荷瘤小鼠(Charles River Laboratories)。在肿瘤细胞植入9天后，当可明显触及肿瘤时将小鼠分组(η = 5)并在侧向尾静脉通过静脉注射盐水和复苏扩增后的免疫细胞。每天监测小鼠并且每周用测径器测量三次肿瘤生长，利用以下公式计算体积:体积=长度X宽度2X0.5。当肿瘤达到体积> 2000mm3或当肿瘤坏死时，将动物处死。肿瘤的尺寸由平均值土 SE表示。
[0158]在植入到裸鼠体内的MDA-MB231人乳癌模型中观察到复苏扩增后的免疫细胞具有抑制肿瘤的活性。
【主权项】
1.从成人外周血中自动化提取免疫细胞的方法，该方法包括以下分离步骤: (a)全血样本预处理:将采集的成人外周血血样，转移至AXP处理袋中，加入羟乙基淀粉溶液放置在摇床上充分混匀(其中血样与羟乙基淀粉溶液的混合体积比为2?6:1，例如3?5:1，例如4:1)； (b)自动分离:将AXP处理袋放入AXP全自动细胞分离设备后，进行自动分离； (c)单个核细胞(在本文中可用缩写MNC表示)收集:由AXP全自动细胞分离设备自动分离得到的免疫细胞自动收集于AXP全自动细胞分离设备内所附的冻存袋中； 以及任选的下列步骤: (d)针对步骤(C)所得免疫细胞，检测以下项目的至少一项:单个核细胞总数、单个核细胞活率、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型。
2.根据权利要求1的方法，该方法还包括以下对提取的免疫细胞进行冻存的步骤: (e)单个核细胞冻存:向步骤(c)提取的免疫细胞中加入冻存液，重悬免疫细胞，将免疫细胞加入冻存容器，程序降温，然后再将冻存容器置于液氮罐中长期储存； 以及任选的下列步骤: (f)建立包含步骤以上信息的免疫细胞的数据库，并使该数据库与步骤(e)的冻存免疫细胞进行关联。
3.根据权利要求2的方法，该方法还包括以下对冻存的免疫细胞进行复苏的步骤: (g)细胞复苏:将步骤(e)冻存的冻存容器从液氮罐中取出，水浴，清洗冻存容器表面后转移至生物安全柜中，将免疫细胞转移至装有培养基的离心容器中，重悬，混匀，补加培养基，离心洗涤； 以及任选的下列步骤: (h)针对步骤(g)所得复苏的免疫细胞，检测以下项目的至少一项:单个核细胞总数、单个核细胞活率及复苏率、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型。
4.根据权利要求3的方法，该方法还包括以下对复苏的免疫细胞进行扩增的步骤: (i)细胞扩增:用含有培养基和血清的细胞培养液对复苏后的单个核细胞进行重悬培养，吸出细胞培养液，转移至离心容器，反复吹洗贴壁细胞，直至贴壁细胞完全不被吹洗下来，获得未成熟树突状细胞(iDC)，添加培养基重悬未成熟树突状细胞(iDC)，将离心容器中的细胞培养液进行离心处理，获得的细胞沉淀为细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，针对iDC细胞和CIK细胞进行细胞计数，再分别针对iDC细胞及CIK细胞进行培养。
5.根据权利要求1-4任一项的方法，其特征在于: 所述羟乙基淀粉溶液中羟乙基淀粉的浓度为4-8%，例如5-7%，例如6% ； 所述羟乙基淀粉溶液是将羟乙基淀粉添加到0.9%氯化钠溶液中配制得到的； 所述羟乙基淀粉溶液中还包含麦芽糖； 所述羟乙基淀粉溶液中还包含麦芽糖，麦芽糖的浓度为0.2?2%，特别是0.25?1.5%，特别是0.5?1% ; 步骤(b)中在AXP全自动细胞分离设备中进行自动分离时，执行两次离心处理，第一次离心条件为:1430rcf、20min、15°C，第二次离心条件为:80rcf、lOmin、15°C ； 步骤(a)中，转移至AXP处理袋中的血液留取5ml血样于15ml离心容器中，用于血型检测； 步骤(d)所述的检测单个核细胞总数和单个核细胞活率是向步骤(C)收集的细胞沉淀中加入10-30ml生理盐水，优选20ml，用1ml移液管反复吹吸细胞，充分混匀，吸取20 μ I细胞，加入180 μ I台盼蓝染液，充分混匀后加入计数板计算细胞总数与活率，记录结果；步骤(e)所述的冻存液是按照20-60重量份的X-VIVO无血清培养基、10-50重量份的人血清白蛋白和5-15重量份的DMSO的配方配制而成的，优选X-VIVO无血清培养基的配方量为30重量份、40重量份或50重量份，优选人血清白蛋白的配方量为20重量份、30重量份或40重量份，优选DMSO的配方量为8重量份、10重量份或12重量份。在一个实施方案中，冻存液中含有约50重量份的X-VIVO无血清培养基、约40重量份的人血清白蛋白和约10重量份的DMSO的冻存液。本发明人发现，含有约50重量份的X-VIVO无血清培养基、约40重量份的人血清白蛋白和约10重量份的DMSO的冻存液是特别优选的，比之于使该冻存液的任一成分含量变化10%以上的配方在提高冷冻效果、保护冷冻细胞等效果方面具有显著优势； 步骤(e)所述的冻存液配置10-20ml，优选15ml，放置于0_7°C冰箱中备存，优选4°C