面的方法，其中步骤(g)所述清洗冻存容器表面是用蘸有75%酒精的无尘布将冻存容器表面水滴擦拭。
[0042]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(g)所述将免疫细胞转移至装有培养基的离心容器中、重悬和混匀的步骤是用Iml移液枪将冻存容器中复苏后的免疫细胞迅速吸出转移至装有2-10ml (优选5ml) X-VIVO无血清培养基的10_20ml (优选15ml)离心容器中重悬，并用枪头反复吹洗混匀2-8次(优选3-5次)。
[0043]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(g)所述补加培养基是补加X-VIVO无血清培养基至5_15ml (优选1ml)。
[0044]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(g)所述离心洗涤是设置水平离心机升速为9，降速为9，转速为1000-3000rpm，离心时间为5_20min，离心温度为15_30°C，优选转速为1500-2500rpm，优选转速为1800rpm，优选离心时间为lOmin，优选离心温度为20°C。
[0045]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(h)所述的检测单个核细胞总数和单个核细胞活率及复苏率是向步骤(g)收集的细胞沉淀中加入10-30ml生理盐水，优选20ml，用1ml移液管反复吹吸细胞，充分混匀，吸取20 μ I细胞，加入180 μ I台盼蓝染液，充分混匀后加入计数板计算细胞总数、活率及复苏率，记录结果。
[0046]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)所述细胞培养液为含有X-VIVO无血清培养基及10%的自体人血清。
[0047]根据本发明第一方面的方法，其中步骤⑴所述重悬培养是将细胞密度为4\104-4\108(优选4父106)的免疫细胞置于体温条件下(优选37°C )，在2-10% (优选5% )的二氧化碳培养箱中孵育1-4小时(2小时)。
[0048]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)所述转移至离心容器为50ml离心管。
[0049]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)所述贴壁细胞吹洗1-5遍，优选2-3遍。
[0050]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)所述重悬未成熟树突状细胞(iDC)通过施加l_5ml的X-VIVO无血清培养基重悬，优选2_3ml。
[0051]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)所述细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)细胞计数为吸取20 μ I细胞，加入180 μ I台盼兰染液，充分混匀后加入计数板计算细胞总数和活率。
[0052]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)所述未成熟树突状细胞(iDC)细胞计数为单个核细胞总数减去细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)总数。
[0053]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)所述未成熟树突状细胞(iDC)的培养为第I天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的细胞培养液、粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF) 1000U/ml和白细胞介素4 (IL-4) 500U/ml ;第4天，半量换液；第5天，加入抗原负载；第6天，加入人肿瘤坏死因子a (TNF-a) 1000U/ml过夜；第7天，DC第一次收获，计数，测定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；第9天，DC第二次收获，计数，测定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；第11天，DC第三次收获，计数，测定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；第13天，DC第四次收获，计数，测定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量。
[0054]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)所述细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的培养为第I天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的细胞培养液及细胞因子INF-γ 1000U/ml ;第2天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10 %自体人血清的细胞培养液及细胞因子CD3单抗375ng/ml、白细胞介素2(IL_2) 1000U/ml、白细胞介素la (IL-la)500U/ml ;第4天，半量换液；第6天，加入含有X-VIV0无血清培养基及10%自体人血清的细胞培养液、白细胞介素2(IL-2) 1000U/ml、白细胞介素I a (IL-1 a ) 500U/ml ；第8天，补加一倍含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的细胞培养液、白细胞介素2(IL-2) 1000U/ml、白细胞介素la (IL-1 a ) 500U/ml ;第12天，CIK第一次收获，计数，测定CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD3-CD19+、CD4/CD8 等细胞表面抗原的表达量；第14 天，CIK 第二次收获，计数，测定 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD3-CD19+、CD4/CD8等细胞表面抗原的表达量。
[0055]根据本发明第一方面的方法，该方法包括以下步骤:
[0056](a)全血样本预处理:将采集的成人外周血血样，转移至AXP处理袋中，加入羟乙基淀粉溶液放置在摇床上充分混匀，其中血样与羟乙基淀粉溶液的混合体积比为2?6:1，例如3?5:1，例如4:1，该羟乙基淀粉溶液是将羟乙基淀粉添加到0.9%氯化钠溶液中配制得到的；
[0057](b)自动分离^fAXP处理袋放入AXP全自动细胞分离设备后，进行自动分离；
[0058](c)单个核细胞收集:由AXP全自动细胞分离设备自动分离得到的免疫细胞自动收集于AXP全自动细胞分离设备内所附的冻存袋中；
[0059](d)单个核细胞计数:重悬所收集的单个核细胞，于细胞沉淀中加入20ml生理盐水，用1ml移液管反复吹吸细胞，充分混匀；细胞计数，吸取20 μ I细胞，加入180 μ I台盼蓝染液，充分混匀后加入计数板计算细胞总数与活率，记录结果。
[0060]进一步地，可以包括以下对提取的免疫细胞进行冻存的步骤:
[0061](e)单个核细胞冻存:按照50% X-VIVO无血清培养基+40%人血白蛋白+10%DMSO的配方配制冻存液15ml，放置4°C冰箱中备用，将上述获得的细胞沉淀按照2X 107/ml的密度用冻存液充分混匀重悬，将细胞转移至2ml冻存管中，用封口膜封口并贴上客户标签，将冻存管放入程序降温盒中，放入4°C冰箱储存一个小时，转移至-80°C冰箱储存过夜，次日，从程序降温盒中取出冻存管，转至液氮罐内进行储存，同时程序降温盒放入4°C冰箱以备下一次使用，冻存管在液氮罐中长期储存；
[0062](f)记录步骤(e)的冻存样本储存的位置，建立免疫细胞的数据库。
[0063]进一步地，可以包括以下对冻存的免疫细胞进行复苏的步骤:
[0064](g)细胞复苏:从液氮罐中取出单个核细胞冻存管，迅速放入预先准备的37°C的水浴锅中，反复振荡8-10次，时间控制在2min以内，直至看到冻存管中只剩下一团冰晶后从水浴锅中取出冻存管，用蘸有75%酒精的无尘布将冻存管表面水滴擦拭后，迅速转移至生物安全柜中，用Iml移液枪将冻存管中复苏后的免疫细胞迅速吸出转移至一装有5mlX-VIVO无血清培养基的15ml离心管中重悬，并用枪头反复吹洗混匀3_5次，补加X-VIVO无血清培养基至10ml，离心洗涤，水平离心机升速为9，降速为9，转速为1800rpm，离心时间为lOmin，离心温度为20°C ；
[0065](h)单个核细胞计数:重悬，于细胞沉淀中加入20ml生理盐水，用1ml移液管反复吹吸细胞，充分混匀；细胞计数，吸取20 μ I细胞，加入180 μ I台盼蓝染液，充分混匀后加入计数板计算细胞总数、活率及复苏率；
[0066]进一步地，可以包括以下对复苏的免疫细胞进行扩增的步骤:
[0067](i)细胞扩增:用含有X-VIVO无血清培养基及10%的自体人血清的细胞培养液对复苏后的单个核细胞进行重悬培养，细胞密度为4X 16个细胞，置于37°C温度条件下，5%的二氧化碳培养箱中孵育2小时，2小时后，取出细胞培养瓶，将细胞培养液吸出，转移至50ml离心管中，剩下瓶中的贴壁细胞用生理盐水反复吹洗2-3遍，直至贴壁细胞完全不被吹洗下来，此时的细胞为未成熟树突状细胞(iDC)，添加2-3ml的X-VIVO无血清培养基重悬未成熟树突状细胞(iDC)，将上述转移至50ml的离心管中的细胞培养液进行离心，获得的细胞沉淀为细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，吸取20 μ I细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，加入180 μ I台盼蓝染液，充分混匀后加入计数板计算细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)细胞总数和活率，单个核细胞总数减去细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)总数为未成熟树突状细胞(iDC)细胞计数，然后分别针对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)和未成熟树突状细胞(iDC)进行细胞培养；
[0068]优选未成熟树突状细胞(iDC)的培养步骤如下:
[0069]第I天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的细胞培养液、粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF) 1000U/ml和白细胞介素4 (IL_4) 500U/ml ；
[0070]第4天，半量换液；第5天，加入抗原负载；
[0071 ] 第6天，加入人肿瘤坏死因子a (TNF- a ) 1000U/ml过夜；
[0072]第7天，DC第一次收获，计数，测定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；
[0073]第9天，DC第二次收获，计数，测定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；
[0074]第11天，DC第三次收获，计数，测定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；
[0075]第13天，DC第四次收获，计数，测定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；
[0076]优选细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的培养步骤如下:
[0077]第I天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的细胞培养液及细胞因子 INF-γ 1000U/ml ；
[0078]第2天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的细胞培养液及细胞因子 CD3 单抗 375ng/ml、白细胞介素 2(IL-2) 1000U/ml、白细胞介素 la (IL-1 a ) 500U/ml ；
[0079]第4天，半量换液；
[0080]第6天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的细胞培养液、白细胞介素 2(IL-2) 1000U/ml、白细胞介素 la (IL-1 a ) 500U/ml ；
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