胎盘底蜕膜间充质干细胞的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及间充质干细胞的制备，特别涉及一种胎盘底蜕膜间充质干细胞的制备方法。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞，最初在骨髓中发现，因其具有以下特点:1)造血支持作用。作为造血微环境主要细胞成分一一基质细胞系的干/祖细胞，MSCs与造血干细胞共同移植可促进造血干祖细胞的植入；2)免疫调控。MSCs不表达⑶34，⑶45，HLA-DR等协同刺激分子，体外可抑制混合淋巴细胞反应，对于预防和治疗异基因造血细胞移植后引起的移植物抗宿主病，治疗自身免疫系统疾病有重要意义；3)基因治疗，由于MSCs体外扩增、增殖能力强，可以作为基因操作的干细胞平台，加之MSC具有对肿瘤的靶向性，在肿瘤的基因治疗中有着十分诱人的前景；4)多向分化潜能。在体外特定的诱导条件下可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于组织工程。
[0003]目前，从胎盘、脐带获得间充质干细胞常用酶消化法，通常是采用胶原酶消化2?3小时后加入胰酶，这种酶消化方法会因为消化不完全导致获得间充质干细胞量少，没有分离出的细胞被浪费，增大了细胞扩增的难度，延长了细胞培养时间。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种胎盘底蜕膜间充质干细胞的制备方法，能够在很大程度上消化胎盘底蜕膜组织块，进而能够获得大量间充质干细胞，增大底蜕膜组织块利用率，缩短细胞培养时间。
[0005]为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种胎盘底蜕膜间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤:将I型胶原酶加入底蜕膜组织块中消化18?20h后加入胰酶继续消化，然后进行过滤和离心，获得胎盘底蜕膜间充质干细胞；将获得的胎盘底蜕膜间充质干细胞进行培养扩增。由此，I型胶原酶消化底蜕膜组织块时间较长，能够获取大量间充质干细胞，增大底蜕膜组织块利用率，缩短细胞培养时间及培养周期，避免了细胞因多次复制引起的细胞质量下降以及功能形态变化，为临床使用胎盘底蜕膜间充质干细胞提供了良好的保障。
[0006]在一些实施方式中，I型胶原酶的加入量是底蜕膜组织块体积的2倍。由此，I型胶原酶在此用量范围内，能够满足较长的消化时间。
[0007]在一些实施方式中，胰酶的加入量是底蜕膜组织块经I型胶原酶消化后总体积的0.2?0.3倍。由此，胰酶在此用量范围内，能够得到较好的消化效果。
[0008]在一些实施方式中，胰酶在37°C下消化20?40min。由此，在此时间范围内胰酶对底蜕膜组织块有较好的消化效果。
[0009]在一些实施方式中，底蜕膜组织块经胰酶消化后加入总体积三倍量生理盐水，然后经过200目筛网过滤，ISOOrpm离心lOmin，获得沉淀细胞。可获得含杂质较少的细胞。
[0010]在一些实施方式中，将生理盐水加入所述沉淀细胞，1500rpm离心lOmin，获得胎盘底蜕膜间充质干细胞。进一步清洗提纯获得基本不含杂质的胎盘底蜕膜间充质干细胞。
[0011]在一些实施方式中，将获得的胎盘底蜕膜间充质干细胞以2 X 14个/cm2密度接种于培养瓶中，进行原代细胞培养。对间充质干细胞进行第一次增殖培养，以上述密度接种，能够具有较好的增殖效果。
[0012]在一些实施方式中，将所述培养瓶置于37°C、饱和湿度、5%的0)2培养箱中进行原代细胞培养。在此环境下进行细胞培养，使细胞具有良好的增殖速度。
[0013]在一些实施方式中，原代细胞培养过程中，细胞培养到80?90%融合时，用含重量0.25% EDTA的胰酶消化，将原培养瓶中的培养基与细胞的混合物按1:2?1:5体积比接种到新培养瓶中培养，细胞再次培养到80?90%融合时，收集细胞。由此，依照上述步骤转移至新培养瓶中进行细胞培养，能够使细胞具有良好的增殖速度。
[0014]在一些实施方式中，培养扩增得到的胎盘底蜕膜间充质干细胞用于项目检测或冻存。
[0015]本发明的有益效果为:本发明的制备方法采用I型胶原酶消化底蜕膜组织块18?20h后，在加入胰酶继续消化。I型胶原酶消化底蜕膜组织块时间较长，能够获取大量间充质干细胞，增大底蜕膜组织块利用率，缩短细胞培养时间及培养周期，避免了细胞因多次复制引起的细胞质量下降以及功能形态变化，为临床使用胎盘底蜕膜间充质干细胞提供了良好的保障。
【附图说明】
[0016]图1为A组的组织贴壁法制备间充质干细胞中细胞培养第9天间充质干细胞形态图；
[0017]图2为A组的组织贴壁法制备间充质干细胞中细胞培养第15天间充质干细胞融合80%?90%形态图；
[0018]图3为B组的胰酶消化法制备间充质干细胞中细胞培养第20天间充质干细胞形态图；
[0019]图4为B组的胰酶消化法制备间充质干细胞中细胞培养第28天间充质干细胞融合80%?90%形态图；
[0020]图5为C组的胰酶加胶原酶直接消化法制备间充质干细胞中细胞培养第10天间充质干细胞形态图；
[0021]图6为C组的胰酶加胶原酶直接消化法制备间充质干细胞中细胞培养第22天间充质干细胞融合80%?90%形态图；
[0022]图7为D组本发明的制备间充质干细胞方法中细胞培养第3天间充质干细胞形态图；
[0023]图8为D组本发明的制备间充质干细胞方法中细胞培养第7天间充质干细胞融合80%?90%形态图；
[0024]图9为D组本发明的制备间充质干细胞方法中细胞培养生长曲线及对应的细胞活率图；
[0025]图10为D组本发明的制备间充质干细胞方法中细胞培养P2代间充质干细胞流式表型图；
[0026]图11为D组本发明的制备间充质干细胞方法获得间充质干细胞的成骨诱导分化图；
[0027]图12为D组本发明的制备间充质干细胞方法获得间充质干细胞的成软骨诱导分化图；
[0028]图13为D组本发明的制备间充质干细胞方法获得间充质干细胞的成脂肪诱导分化图。
【具体实施方式】
[0029]以下通过对比几种胎盘底蜕膜间充质干细胞的制备方法，进一步解释本发明的有益效果。其中几种胎盘底蜕膜间充质干细胞的制备方法包括组织块贴壁法、胰酶消化法、胰酶加胶原酶直接消化法和本发明的制备方法。其中，I型胶原酶、胰酶、DMEM-F12培养基均采购自GIBCO公司。对比操作包括以下步骤:
[0030]S101、从新鲜足月胎盘组织中剥取底蜕膜，用生理盐水对底蜕膜组织进行清洗。
[0031]S102、尽量沥干底蜕膜组织表面的生理盐水，在玻璃皿中剪碎为底蜕膜组织块，组织块的体积为Imm3左右，然后平均分成A、B、C、D4组。
[0032]S103、将A、B、C、D4组分别采用组织块贴壁法、胰酶消化法、胰酶加胶原酶直接消化法和本发明的方法制备间充质干细胞。制备过程如下。
[0033]1、A组采用组织块贴壁法制备间充质干细胞。
[0034]将A组的底蜕膜组织块均匀贴于10mm的培养皿中，组织块之间的距离在I?2cm，晾干贴壁40min后，每个培养皿中加入1mlDMEM完全培养基，置于37 °C、饱和湿度、5 %的0)2培养箱中进行原代细胞培养。
[0035]待细胞爬出后，剔除组织块，继续进行细胞培养，如图1所示，为细胞培养第9天间充质干细胞形态图。细胞培养到80?90%融合时，用含重量0.25% EDTA的胰酶消化，按
1:2?1:5接种到新培养瓶中培养。
[0036]如图2所示，细胞培养第15天细胞再次培养到80?90%融合。此时收集细胞，取
2X 15个用于流式检测；取5X 10 3个/cm2接种于培养孔板中，进行成骨、成脂肪、成软骨诱导实验；剩余细胞按2X 16个/ml永久冻存于液氮中。
[0037]2、B组采用胰酶消化法制备间充质干细胞。
[0038]将B组的底蜕膜组织块放入15ml离心管中，且加入组织块体积1/4的