一种提取胎盘多种干细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及干细胞提取领域，特别是一种提取胎盘多种干细胞的方法。
【背景技术】
[0002]胎盘中含有多种干细胞，包括间充质干细胞、造血干细胞、内皮干细胞和未知功能的多潜能干细胞等。
[0003]间充质干细胞，英文名称为mesenchymal stem cells (MSC)，也有其它名称，如骨髓基质细胞、脂肪干细胞、多潜能基质细胞等，是指单个或一群符合国际统一标准的细胞(Dominici M,Le Blanc K, Mueller I,Slaper-Cortenbach I, Marini F，Krause D,DeansR,Keating A, Prockop Dj, Horwitz E.Minimal criteria for defining multipotentmesenchymal stromal cells.The Internat1nal Society for Cellular Therapyposit1n statement.Cytotherapy, 2006 ；8 (4):315-7)。间充质干细胞存在于多种组织和器官中，包括骨髓、脂肪、脐带、胎盘、肝脏、脑、骨质等，体内外均具有向骨、软骨和脂肪组织分化的能力，具有免疫调节、造血支持、促血管新生等作用。
[0004]造血干细胞是指尚未发育成熟的细胞，是所有造血细胞和免疫细胞的起源，它不仅可以分化为红细胞、白细胞、和血小板，还可以跨系统分化为各种组织器官的细胞，具有自我更新多向分化和归巢潜能。一般造血干细胞来源于三个渠道:骨髓造血干细胞；外周血造血干细胞；脐带血造血干细胞。
[0005]内皮干细胞排列在机体所有血管的内表面，不论是在胚胎还是在成体哺乳动物中，特异的内皮干细胞(endothelium stem cell)都很难鉴定。在胚胎发育过程中，受精卵形成原肠胚之后，中胚层来源的成血管细胞被认为是造血干细胞和内皮细胞的祖细胞。这个时期形成的由卵黄囊血岛构成的胚胎脉管系统是暂时的，但成血管细胞还没有从胚胎中分离出来，它们是否存在还是个问题。
[0006]胚胎中新血管的形成叫作血管发生(vasculogenesis)。
[0007]在成体中，从先前存在的血管形成血管的过程叫作血管生成(ang1genesis)。
[0008]成血管细胞存在的证据来自于鼠胚胎干细胞体外分化的研宄，这些研宄表明:一个来源于小鼠ES细胞并且能表达Flk-1(小鼠血管内皮细胞生长因子受体，VEGF)的祖细胞能形成血细胞和血管细胞。VEGF和FGF-2在体内内皮细胞分化中起重要作用。
[0009]报道称骨髓中含有一些细胞，这些细胞能在因血氧缺乏造成的缺血组织中形成新血管，但还不知道是骨髓中的哪些细胞诱导血管的发生。胎盘是胎儿和母亲血液交换的场所，含有非常丰富的血液微循环。人在母亲子宫内发育的阶段，胎盘是首先形成的器官之一。这表明在胚胎干细胞的发育、分化过程中，在胎盘中滞留有大量的早期干细胞，而且很有可能这些干细胞在胎盘内继续保持着造血干细胞的能力。
[0010]在探求诱导血管发生细胞的实验中，研宄者发现在成人骨髓中含有类似胚胎成血管细胞的细胞，因此称其为内皮干细胞。将人骨髓来源的细胞通过尾静脉注入心肌缺血模型的大鼠，发现人的细胞迀移至鼠的心脏，而且在血管梗塞部位形成新的血管(类似血管形成的过程)，这也说明人骨髓来源的细胞能诱导血管发生。
[0011]内皮干细胞是⑶34+(—个HSC的标志)，也表达转录因子GATA-2。用转入绿色荧光蛋白基因(示踪细胞)的小鼠进行同样的实验，发现骨髓衍生的细胞能够进入小鼠缺血的心肌区域，生成血管并整合人宿主组织的心肌细胞。
[0012]本发明涉及一种提取胎盘多种干细胞的方法，所获得的干细胞统称为胎盘干细胞。它是一个干细胞群，包括造血干细胞、内皮干细胞和间充质干细胞等。更为重要的是，细胞群中也包括胚胎干细胞样细胞；也就是说，这种干细胞的功能近似于胚胎干细胞。我们称之为类胚胎干细胞(embryonic-like stem cells，ELS细胞)。
【发明内容】
[0013]利用本方法分离的干细胞，可以表达胚胎干细胞特有的标记，如0CT-4，这是间充质干细胞和造血干细胞所不具备的标记，另外，这群细胞中，部分细胞表达⑶133和⑶34，两者是造血干细胞和内皮祖细胞的标记。
[0014]一种提取胎盘多种干细胞的方法，由以下步骤组成:
[0015]步骤一、胎盘收集前的处理:
[0016]胎盘娩出后十五分钟，结扎脐带，吸取50ml胎盘抗凝液，装置静脉插管接头，缓慢向胎盘注射，有少量血液从动脉流出即可，立即用血管夹夹住脐带，位置是胎盘上5厘米，夹紧后，轻轻颠倒胎盘数次，检查胎盘完整性，并使液体混匀；将胎盘放入胎盘保存液中，置于运输箱，温度在20度左右为宜；
[0017]步骤二、胎盘的实验室处理:
[0018]使用碘伏消毒脐带及胎盘表面；生理盐水充分冲洗残留脐带和胎盘，至少三次；将脐带置于相对高处，高度20cm-30cm之间；打开血管夹，插入静脉导管和动脉导管，连接灌洗液瓶和细胞收集瓶及蠕动泵，进行第一次灌注，液体量在100ml-200ml左右，大部分血液流出，流出的液体变浅，夹住静脉导管，挤压胎盘，使残存血液流出，此时收集的细胞主要是造血干细胞，如果处理得当，此时收集的造血干细胞量相当于一个脐血单位，打开静脉导管，夹住动脉导管，将干细胞动员剂灌入胎盘，用量不超过100ml，将动脉导管和静脉导管夹住，将导管放入胎盘处理盒，将盒子放入37度培养箱，静置2小时；取出，放入超净台，连接动静脉导管、灌洗液瓶和细胞收集瓶；缓慢灌装，当收集的液体透明，说明所有的细胞均已收集，灌洗液用量500ml-800ml，停止灌洗。步骤三、细胞处理阶段:
[0019]将收集的细胞悬液大约1L，离心速度为600g，10分钟，离心去除大量的液体，用alpha-MEM悬浮细胞沉淀，利用3%醋酸计数有核细胞数；调整细胞浓度为I X 107/ml左右，淋巴细胞分离液密度梯度离心收集单个核细胞，同时，去除细胞碎片，离心速度为800g，20分钟，离心洗涤；810g，10分钟；使用生理盐水离心洗涤，500g，10分钟，使用生理盐水；利用冻存液悬浮，常规方法冷冻；
[0020]步骤四、细胞进行质检:
[0021]流式细胞学分析:部分细胞表达⑶133和⑶34造血干细胞和内皮祖细胞标志物，PCR,可检测到胚胎干细胞特有标记0CT-4表达。
[0022]利用本方法分离的干细胞，可以表达胚胎干细胞特有的标记，如0CT-4，这是间充质干细胞和造血干细胞所不具备的标记；另外，这群细胞中，部分细胞表达⑶133和⑶34，两者是造血干细胞和内皮祖细胞的标记。
[0023]这个方法比较简单易行，不但可以得到胎盘干细胞，也可以通过消化等手段，从已经分离过胎盘干细胞的胎盘组织中，分离另外三种干细胞，即造血干细胞、间充质干细胞和内皮祖细胞。
[0024]所有实验均在相对无菌条件下进行。
[0025]胎盘收集前的处理:这是整个实验成败的关键，应在胎盘娩出后十几分钟内注射胎盘抗凝液。
[0026]获取这群干细胞的关键因素是胎盘的处理，即胎盘娩出后，在收集胎盘前，助产士必须对胎盘进行适当的处理；否则，无法开展后续实验工作。
[0027]另外，最好在24小时内收集胎盘及时处理，以保证细胞活性，在运输过程中，胎盘最好储存在20°C左右，浸泡在含抗生素和抗凝剂的培养液中。
[0028]另外，冲洗液中加入了趋化因子SDF-1 alpha(基质细胞衍生因子)，剂量为50ng/ml,目的在于促进胎盘组织中的干细胞迀徙至血管中，从而获得更多的干细胞。
[0029]为保存胎盘干细胞，将获得的细胞进行适当的处理是必需的。
【具体实施方式】
[0030]以下结合实施例对发明的内容作出详细的说明
[0031]实施利I
[0032]需要材料
[0033]1.器材:
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