亚全能干细胞分泌的外来体及其应用的制作方法

亚全能干细胞分泌的外来体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及亚全能干细胞分泌的外来体及其应用。具体而言，本发明涉及一种亚全能干细胞分泌的外来体，所述亚全能干细胞呈Flk1阳性，在体外具有诱导分化成三胚层来源的组织细胞的能力，所述外来体特异性表达下述microRNA：hsa-miR-3191-5p、hsa-miR-4711-3p和hsa-miR-1273a，优选地，其还特异性表达下述microRNA：hsa-miR-3142、hsa-miR-4456和hsa-miR-4714-5p。本发明的外来体具有多种生理活性，具有广泛的用途。
【专利说明】亚全能干细胞分泌的外来体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及亚全能干细胞分泌的外来体及其应用。
【背景技术】
[0002]干细胞是一种具有自我更新和多向分化潜能的细胞。根据这一定义，在个体发育的不同阶段以及成体的不同组织中均存在着干细胞。根据分化潜能的不同，干细胞可分为全能干细胞(totipotent stem cell)、三胚层多潜能干细胞(pluripotent stem cell)、单胚层多能干细胞(multipotent stem cell)和单能干细胞(unipotent stem cell)。本领域现有技术中也有亚全能干细胞的概念，认为在胚胎发育过程中会有亚全能干细胞存留在人体多种组织中，其分化潜能仅次于全能干细胞，是一种原始干细胞亚群，处于干细胞等级结构的最上层。通过一系列的探索，人们已经从骨髓和脂肪组织中获得了亚全能干细胞，并对它的表型和生物学功能进行了鉴定。亚全能干细胞的特征在于其具有上皮样形态、Flkl+表型、无成瘤性且单克隆来源的该细胞在体外具有诱导分化成三胚层来源的组织细胞的能力。
[0003]Exosomes (外来体)是一类起源于内吞体系统并被排出细胞外、直径在40~IOOnm之间的双层膜性囊泡(I)。外来体可以由多种细胞包括树突状细胞、肿瘤细胞等分泌(2，3)。外来体含有大量与其来源和功能密切相关的蛋白质、核酸和脂质成分，作为细胞间传递信息的重要载体，参与多种病理生理过程，但大多数研究集中在免疫细胞和肿瘤细胞释放的外来体。近年来,干细胞中的外来体也逐渐引起了人们的关注。
[0004]本发明拟研究上述亚全能干细胞中是否也有外来体的产生及如果有外来体产生，其特殊的性质及用途。

【发明内容】
`
[0005]因此本发明的技术目的在于探究亚全能干细胞分泌的外来体及其性质和用途。
[0006]因此，本发明的第一方面涉及一种亚全能干细胞分泌的外来体，所述亚全能干细胞呈Flkl阳性，在体外具有诱导分化成三胚层来源的组织细胞的能力。
[0007]优选地，所述外来体特异性表达下述microRNA:hsa-miR-3191_5p、hsa-miR-471 l-3p和hsa_miR-1273a,优选地，其还特异性表达下述microRNA:hsa-miR-3142、hsa-miR-4456 和 hsa-miR-4714_5p。
[0008]优选地，所述亚全能干细胞的获取步骤如下:
[0009]A)常规方法分离aMSC或bMSC或其他组织来源的间充质干细胞，
[0010]B)以I个细胞/孔的密度将aMSC或bMSC或其他组织来源的间充质干细胞接种于96孔板中，待长出单克隆后，将这些单克隆进一步扩增，
[0011]C)将单克隆进一步扩增后的细胞作为种子细胞，4_6h细胞完全贴壁后加入I号诱导培养基诱导I天后，更换2号诱导培养基继续诱导培养4天，获得亚全能干细胞，即Flkl阳性的MSC，所述I号诱导培养基包含l-100ng/ml活化素A+l_500ng/ml Wnt3a+0.1-20%FBS+HG_DMEM，优选地，5_50ng/ml 活化素 A，更优选地，10_30ng/ml 活化素 A ;优选地，50-300ng/ml Wnt3a,更优选地，100-300ng/ml Wnt3a ；优选地，2-10%FBS,更优选地，5-8%FBS,所述2号诱导培养基包含l-100ng/ml活化素A+1-500 μ MRA+0.1-50%FBS+HG-DMEM, 5-50ng/ml 活化素 A，更优选地，10-30ng/ml 活化素 A ;优选地，20-400 μ M RA，更优选地，50-200 μ M RA，将获得的具有上皮样形态的亚全能干细胞进行免疫细胞荧光染色检测和Western Blot检测，其中所述免疫细胞荧光染色检测的指标包括 Foxa2、Soxl7、Kdr、Tbx6、Eomes、Gsc、T、Soxl、Pax6,所述 Western Blot 检测的指标包括Foxa2、Soxl7、T、Gsc、Epcam、Vimatin,检测获得的干细胞是否具有三胚层分化潜能重要基因表型标志，即限定性的内胚层:Foxa2、Soxl7 ;中内胚层:Gsc、T、Eomes ;中胚层:Kdr、Tbx6 ;外胚层:S0Xl、PaX6，并且具有较高的诱导效率，FOXa2、SOX17阳性的限定性内胚层细胞效率达到90%以上。
[0012]优选地，所述外来体通过如下步骤获得:
[0013]A)收集亚全能干细胞培养48小时的上清液，
[0014]B)用差速离心法提取外来体，细胞培养上清液1，OOOXg，离心10min ;取上清，10，OOOXg离心10min ;取上清液，将30%蔗糖/重水垫、上清液及PBS依次放入离心管中，100，000 X g，离心Ih ;取混有外来体的蔗糖/重水垫，用PBS悬浮，加入到IOOkD超滤离心管中，重复3次，浓缩液即为P-外来体，
[0015]C)用0.22 μ m的滤膜过滤除菌，放入_80°C冰箱中保存备用。
[0016]优选地，所述亚全能干细胞的来源为脂肪组织或骨髓组织。
[0017]本发明的第二 方面涉及一种含有上述第一方面所述的亚全能干细胞分泌的外来体的组合物。
[0018]本发明的第三方面涉及一种制备上述第一方面所述的亚全能干细胞分泌的外来体的方法，其包括下述步骤:
[0019]A)常规方法分离aMSC或bMSC或其他组织来源的间充质干细胞，
[0020]B)以I个细胞/孔的密度将aMSC或bMSC或其他组织来源的间充质干细胞接种于96孔板中，待长出单克隆后，将这些单克隆进一步扩增，
[0021]C)将单克隆进一步扩增后的细胞作为种子细胞，4_6h细胞完全贴壁后加入I号诱导培养基诱导I天后，更换2号诱导培养基继续诱导培养4天，获得亚全能干细胞，即Flkl阳性的MSC，所述I号诱导培养基包含l-100ng/ml活化素A+l_500ng/ml Wnt3a+0.1-20%FBS+HG_DMEM，优选地，5_50ng/ml 活化素 A，更优选地，10_30ng/ml 活化素 A ;优选地，50-300ng/ml Wnt3a,更优选地，100-300ng/ml Wnt3a ；优选地，2-10%FBS,更优选地，5-8%FBS,所述2号诱导培养基包含l-100ng/ml活化素A+1-500 μ MRA+0.1-50%FBS+HG-DMEM, 5-50ng/ml 活化素 A，更优选地，10-30ng/ml 活化素 A ;优选地，20-400 μ M RA，更优选地，50-200 μ M RA，将获得的具有上皮样形态的亚全能干细胞进行免疫细胞荧光染色检测和Western Blot检测，其中所述免疫细胞荧光染色检测的指标包括 Foxa2、Soxl7、Kdr、Tbx6、Eomes、Gsc、T、Soxl、Pax6,所述 Western Blot 检测的指标包括Foxa2、Soxl7、T、Gsc 、Epcam、Vimatin,检测获得的干细胞是否具有三胚层分化潜能重要基因表型标志，即限定性的内胚层:Foxa2、Soxl7 ;中内胚层:Gsc、T、Eomes ;中胚层:Kdr、Tbx6 ;外胚层:S0Xl、PaX6，并且具有较高的诱导效率，FOXa2、SOX17阳性的限定性内胚层细胞效率达到90%以上，
[0022]D)收集亚全能干细胞培养48小时的上清液，
[0023]E)用差速离心法提取外来体，细胞培养上清液1，000Xg，离心10min ;取上清，10，OOOXg离心10min ;取上清液，将30%蔗糖/重水垫、上清液及PBS依次放入离心管中，100，000 X g，离心Ih ;取混有外来体的蔗糖/重水垫，用PBS悬浮，加入到IOOkD超滤离心管中，重复3次，浓缩液即为P-外来体，
[0024]F)用0.22 μ m的滤膜过滤除菌，放入_80°C冰箱中保存备用。
[0025]本发明的第四方面涉及一种根据上述第一方面所述的亚全能干细胞分泌的外来体在制备促进间充质干细胞的迁移和短期归巢能力的药物中的用途。
[0026]本发明的第五方面涉及一种根据上述第一方面所述的亚全能干细胞分泌的外来体在制备促进血管内皮细胞中NO释放的药物中的用途。
[0027]本发明的第六方面涉及一种根据上述第一方面所述的亚全能干细胞分泌的外来体在制备抑制T细胞的增殖、下调ThO向Th2的分化的药物中的用途。
[0028]本发明的第七方面涉及一种根据上述第一方面所述的亚全能干细胞分泌的外来体在制备抑制肾脏来源细胞凋亡的药物中的用途。
[0029]本发明的第八方面涉及一种根据上述第一方面所述的亚全能干细胞分泌的外来体在制备抑制肝星状细胞的药物中的用途。
[0030]本发明的第九方面涉及一种根据上述第一方面所述的亚全能干细胞分泌的外来体在制备减少谷氨酸诱导的`神经细胞凋亡的药物中的用途。
[0031]换言之，本发明利用亚全能干细胞分离出一种新的外来体，并将其命名为P-外来体，它可以参与多种生物学功能的调节，包括促进间充质干细胞归巢，调节免疫细胞等。这种P-外来体中含有多种重要的microRNA，可以通过在亚全能干细胞中过表达相应的microRNA来提高P-外来体中该种特定microRNA的表达量，将这种特异表达某种microRNA的P-外来体作为载体来应用。
[0032]本发明所用的亚全能干细胞的生物学特征为具有上皮样形态和三胚层分化，包括成脂、成骨、造血、胰腺和神经分化的能力。
[0033]本发明的P-外来体的功能详述如下:
[0034]I)能促进间充质干细胞的迁移和短期归巢能力
[0035]间充质干细胞是一种具有广泛应用潜能的成体干细胞。P-外来体可以促进间充质干细胞的迁移和短期归巢能力。P-外来体短时间(24-48hr)内刺激间充质干细胞后，间充质干细胞的迁移能力增强(图2)，把P-外来体刺激后的间充质干细胞移植到经亚致死量照射的N0D/SCID小鼠体内，发生骨髓归巢的细胞数目是未经处理的对照组的1.6倍。由于间充质干细胞要在病变部位才能发挥作用，因此首先要能到达病变部位，因此其迁移和归巢能力至关重要。P-外来体能够促进间充质干细胞的迁移和短期归巢能力，因此可以与间充质干细胞共同使用，增加间充质干细胞的治疗效果。
[0036]2)参与调节免疫
[0037]P-外来体可以抑制T细胞的增殖，下调ThO向Th2的分化，从而使Thl细胞的比例上调，进而扭转了 Thl细胞和Th2细胞的比例失衡而达到新的平衡点，因此对于移植物抗宿主病具有治疗作用。[0038]3)促进血管内皮细胞中NO的释放
[0039]P-外来体可以促进血管内皮细胞中NO的释放，而NO在维持血管张力的恒定和调节血压的稳定性中起着重要作用。
[0040]4)抑制肾脏来源细胞的凋亡
[0041]P-外来体可以抑制HK2肾小管上皮细胞或HEK294T人胚胎肾脏细胞凋亡，从而可以在一些肾损伤性疾病中起保护作用(图3)
[0042]5)抑制肝星状细胞增殖
[0043]P-外来体可以抑制肝星状细胞增殖(图4)。肝星状细胞是肝脏的一种非实质细胞。它们在纤维化进程中起了重要的作用，它们导致了以I型胶原为主的细胞外基质的过度沉积(4，5)。因此P-外来体可以用于肝纤维化的治疗中。
[0044]6)神经保护作用
[0045]P-外来体能够明显减少谷氨酸损伤后神经细胞PC12的凋亡，具有神经保护作用(图 5)。
[0046]因此，本发明所发现的亚全能干细胞分泌的外来体具有多种有利的生物活性，可以具有广泛的用途。
[0047]同时，本领域技术人员知晓，尽管本发明公开的技术方案中对亚全能干细胞和其分泌的外来体的制备过 程进行了限定，但这并非意味着本发明只能以所述限定的技术方案实施。本领域技术人员可以在不违背本发明宗旨的情况下对所述技术方案做出各种改变而仍能实现本发明的技术目的，这样的技术方案也包括在本发明的保护范围之内。
【专利附图】

【附图说明】
[0048]图1:亚全能干细胞的三胚层分化能力，其中左侧两栏上部a_d图显示了亚全能干细胞的成骨分化，左侧两栏下部a-d图显示了亚全能干细胞的成脂分化，右侧两栏上部四图显示了亚全能干细胞的成胰腺细胞分化，右侧两栏下部四图显示了亚全能干细胞的成神经分化。
[0049]图2:间充质干细胞在外来体处理后迁移能力增强。P-外来体刺激后，干细胞在24h、36h和48h的迁移能力均明显增加。
[0050]图3:P-外来体可以抑制HK2肾小管上皮细胞或HEK294T人胚胎肾脏细胞的凋亡。
[0051]图4:P-外来体抑制肝星状细胞系的增殖能力。将不同浓度的P-外来体与肝星状细胞系分别进行共培养后，肝星状细胞系的增殖能力均相对于单独培养时下降，提示P-外来体对肝星状细胞系的增殖影响是抑制性的作用。
[0052]图5:P-外来体保护谷氨酸毒性损伤的神经细胞系PC12细胞。应用MTS法检测谷氨酸损伤后不同处理组PC12细胞的存活率，结果显示P-外来体对于谷氨酸诱导的PC 12细胞凋亡具有保护作用。
【具体实施方式】
[0053]下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
[0054]下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。本发明下述实施例中使用的各种抗体均来源于商业途径的标准抗体。
[0055]实施例
[0056]实施例1亚全能干细胞的获得及检测
[0057]1.实验方法
[0058]实验标本
[0059]成人脂肪样品取自医科院整形医院，成人骨髓样品取自解放军307医院。所有样品均签订知情同意书。
[0060]成人脂肪源间充质干细胞(aMSCs)的分离:成人脂肪组织取自吸脂手术患者(中国医学科学院整形医院)，与供者签订知情同意书，供者均为25~35岁的健康女性。脂肪源间充质干细胞的分离方法简述如下:
[0061]I)将采用吸脂术采集出来的脂肪组织用D-Hanks洗去血细胞和麻醉药，0.2%11型胶原酶消化lh，然后用D-Hanks洗涤2遍以除去胶原酶；
[0062]2)离心收集细胞，细胞以2X IO6个细胞/ml的密度接种于含58%DMEM/F12+40%MCDB-201、2% 胎牛血清(FCS)、10ng/ml EGFUOng/ml PDGF、1X 胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸(Insulin-Transferrin-Selenium, ITS)、IX 亚油酸-牛血清白蛋白(Iinoleicacid-bovine serum albumin, LA_BSA)、50 μ M β 疏基乙醇、2mM L-谷氨酸胺、100 μ g/ml 青霉素和100U/ml硫酸链 霉素的培养液，37°C、5%C02、95%湿度的培养箱培养；
[0063]3) 2d后换液，弃去未贴壁的细胞，以后每3d半量换液；
[0064]4)当细胞达70%~80%汇合时，0.25%胰酶(Gibco公司)常规消化，细胞按照1:3进行传代。
[0065]成人骨髓源间充质干细胞(bMSCs)的分离方法简述如下:
[0066]I)无菌采集健康志愿者的骨髓5-10ml于无菌的肝素管中；
[0067]2)取一无菌的离心管，用D-Hanks液适当稀释骨髓后计数，并调整骨髓细胞浓度至IO7个细胞/ml ；
[0068]3)取一新的离心管，分别加入恢复至室温的Ficoll和上述骨髓细胞悬液，加入时仔细操作勿破坏界面，二者的比例为1:1;
[0069]4)将上述离心管重量配平后放入常温台式离心机中，20°C以l，800rpm的速度离心20min。取出离心管后，无菌操作条件下仔细吸取白膜层即获得了单个核细胞，将单个核细胞用D-Hanks液洗涤两次并计数；
[0070]5)将上述单个核细胞以I X IO6个细胞/cm2的密度接种于25cm2的培养瓶中，细胞培养体系均为含 58%DMEM/F12+40%MCDB-201、2% 胎牛血清(FCS)、10ng/ml EGF、10ng/mlPDGF>I X 膜岛素-转铁蛋白-亚硒酸(Insulin-Transferrin-Selenium, ITS)、1X 亚油酸-牛血清白蛋白(linoleic acid-bovine serum albumin, LA-BSA)>50 μ M β 疏基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、100 μ g/ml青霉素和100U/ml硫酸链霉素的培养液，37°C、5%C02、95%湿度的培养箱培养；
[0071 ] 6)24hr后，去除悬浮细胞，补充培养基，细胞每隔3d换液一次，待细胞长至70_80%汇合时，用0.05%胰蛋白酶-0.0P/oEDTA消化传代。
[0072]2.亚全能干细胞的获得[0073]以I个细胞/孔的密度将第三代脂肪或者骨髓来源的间充质干细胞接种于96孔板中，待长出单克隆后，将这些单克隆进一步扩增，将单克隆进一步扩增后的细胞作为种子细胞，4-6h细胞完全贴壁后加入I号诱导培养基诱导Id后，更换2号诱导培养基继续诱导培养4d，获得亚全能干细胞，即Flkl阳性的MSC，所述I号诱导培养基是高糖DMEM(HG-DMEM)，其中包含20ng/ml活化素A+200ng/ml Wnt3a+6%FBS，所述2号诱导培养基也是高糖 DMEM (HG-DMEM)，其中包含 20ng/ml 活化素 Α+100 μ M RA+10%FBS。
[0074]3.亚全能干细胞的检测
[0075]将获得的具有上皮样形态的亚全能干细胞进行常规的免疫细胞荧光染色检测和Western Blot检测，其中所述免疫细胞荧光染色检测的指标包括Foxa2、Soxl7、Kdr、Tbx6、Eomes、Gsc、T、Soxl、Pax6,所述 Western Blot 检测的指标包括 Foxa2、Soxl7、T、Gsc、Epcam、Vimatin。采用流式细胞术检测获得的亚全能干细胞的表型,方法如下:
[0076]用间接免疫荧光法检测细胞的免疫表型，针对细胞表面抗原，细胞经胰酶消化后，用洗液(含0.5%BSA的PBS)冲洗，加入一抗4°C孵育30min。一抗为小鼠抗人的CD29、CD31、⑶34、⑶45、⑶44、⑶105、FlkUvWF或HLA-DR的单克隆抗体。用洗液洗两次。为检测细胞内抗原，细胞与一抗孵育之前，用2%多聚甲醛4°C固定15min，并在室温下用0.1%的皂角素透膜lh。本发明选用同种同型非相关IgG抗体作为阴性对照。用洗液洗过后，加入FITC标记的羊抗鼠二抗4°C孵育30min。细胞洗3次，并悬浮在300 μ L的PBS中，置于冰上待流式细胞仪检测。本发明上述方法获得的亚全能干细胞的典型指标是Flkl+CD31TD34_。
[0077]实施例2亚全能干细胞的分化
[0078]对亚全能干细胞进行向三胚层多谱系的诱导分化；神经诱导分化:DMEM/F12(DF12)1:1基础培养基中加入N2/B27、20ng/ml EGF和50ng/ml IGF-1，诱导两周后加入30ng/ml NT3 和 10n g/ml bFGF，两周后加入 30ng/ml NT3 和 10ng/ml BDNF再诱导 7d ;成脂分化:DMEM基础培养基加入10%FCS、I μ M地塞米松、0.5mM IBMX、ImM抗坏血酸诱导8d ;成骨分化:DMEM基础培养基加入10%FCS、IOmM β -甘油磷酸钠、IOnM地塞米松和0.2mM抗坏血酸诱导8d;肝上皮诱导分化:基础培养基中加入20ng/ml HGFUOng/ml FGF_4、20ng/mlEGF和2%FBS诱导3周；造血细胞诱导分化:基础培养基中加入150ng/mL SCF和200ng/mL G-CSF诱导7d，收集细胞，接种在无血清甲基纤维素半固体培养基中，该培养基含l%BSA、50ng/mLBMP-4、50ng/mL IL_6、50ng/mL SCF、50ng/mL Flt_3L、lOng/mL G-CSF、lOng/mL TP0U0μ g/mL ΕΡ0、200μ g/mL转铁蛋白、2mM L-谷氨酰胺、0.1mMβ巯基乙醇、1%非必需氨基酸，诱导9d，收集的细胞，洗去甲基纤维素，计数5000个细胞，重新接种在含血清的甲基纤维素半固体培养基中再诱导14d检测获得的干细胞是否具有三胚层分化潜能重要基因表型标志，即限定性的内胚层:Foxa2、Soxl7 ;中内胚层:Gsc、T、Eomes ;中胚层:Kdr、Tbx6 ;外胚层:SoxU Pax6，并且具有较高的诱导效率，Foxa2、Soxl7阳性的限定性内胚层细胞效率达到90%以上。本发明所用的亚全能干细胞具备向三胚层多谱系的分化能力(图1)。
[0079]实施例3亚全能干细胞中外来体的获得
[0080]收集亚全能干细胞培养48hr后的上清液，用差速离心法提取外来体，简述如下:细胞培养上清液1，000 X g离心10min ;取上清，10，000 X g离心10min ;取上清液，将30%蔗糖/重水垫、上清液及PBS依次放入离心管中，100，000Xg离心Ih ;取混有外来体的蔗糖/重水垫，用PBS悬浮，加入到IOOkD超滤离心管中，重复3次，浓缩液即为外来体，本发明将其命名为P-外来体，用0.22 μ m的滤膜过滤除菌，放入-80°C冰箱中保存备用。
[0081]实施例4P-外来体的鉴定
[0082]提取P-外来体中的总RNA，变性琼脂糖凝胶电泳法检测RNA的完整性，获得完整的总RNA。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(分离胶浓度为15%，浓缩胶浓度为10%)分离总RNA中的microRNA。初步结果表明本发明所获得的P-外来体除表达外来体通用的标志物CD63、CD81外，其特征在于同时特异性表达hsa-miR-3191-5p、hsa-miR-471 l-3p和hsa_miR-1273a三种microRNA。另外在部分外来体中还发现同时特异性表达hsa-miR-3142、hsa-miR-4456和hsa-miR-4714-5p。本发明后续使用5’端32P标记的特异性microRNA探针(序列分别为:hsa-miR-3191_5p 探针:5，uggaagguagucggccagagag3’ (SEQ ID NO:1)，hsa-miR-471l_3p 探针:5，aucaagccagaagacacg3’ (SEQ ID NO:2), hsa_miR-1273a探针:5，aagaaagagucuugcuuugucgccc3’ (SEQ ID NO:3), hsa-miR-3142 探针:5Jucugaagguucagaaaggccuu3J (SEQ ID NO:4),hsa-miR-4456 探针:5，aaaaggaagccaccagg3，(SEQ ID NO:5)和 hsa-miR-4714_5p 探针:5，aucaaccuaaggggucagaguu 3，(SEQIDNO:6))，通过放射自显影方法观察按本发明上述方法重复获得的P-外来体中hsa-miR-3191_5p、hsa-miR-471 l-3p> hsa_miR-1273a、hsa-miR-3142、hsa-miR-4456 和hsa-miR-4714-5p的表达情况,发现每批次获得的亚全能干细胞分泌的P-外来体中均至少特异性表达 hsa-miR-3191-5p、hsa-miR-4711_3p 和 hsa_miR-1273a 三种 microRNA,另外在部分外来体中还发现同时特异性表达hsa-miR-3142、hsa-miR-4456和hsa-miR-4714_5p。因此，若前三种miCToRNA均同时存在，则认为此批次P-外来体符合本发明的标准，可以用于随后的功能实验。
[0083]实施例5P-外来体的功能实验
[0084]1.促进间充质干细胞的迁移和短期归巢能力
[0085]迁移实验:`
[0086]迁移实验在Transwell小室(Costar公司)中进行。具体过程如下:
[0087]I)配制C-Buffer (DMEM培养基+ 0.5%BSA)，趋化液及细胞悬液均用C-Buffer配制，使用前应预先平衡至37°C ；
[0088]2)上室膜(12mm直径，孔径12 μ m)用FN (纤连蛋白)包被:10 μ g/mL，37°C孵育Ih ；PBS洗两遍；
[0089]3)在下室配制趋化液1.5mL/孔(用C-Buffer将SDF-1 (基质细胞衍生因子-1)稀释为0、100、200、300、400叩/1^)，然后将上室放入，371:平衡Ih ；
[0090]4)将间充质干细胞消化制成细胞悬液(调整细胞浓度为1.4X IO6个细胞/mL)，把500 μ L细胞悬液加入上室中；
[0091]5) 37°C、5%C02培养15h后取出滤膜，PBS洗两遍，甲醇固定；
[0092]6)将0.5%结晶紫用PBS 1:4稀释后，室温染色20min ；
[0093]7)用湿棉签小心将膜上层细胞擦去；
[0094]8)显微镜下计数迁移至滤膜外表面的细胞数，每张滤膜随机取5个视野(X400)，取均值，三次独立实验。
[0095]短期归巢实验:
[0096]I)将分离纯化得到的间充质干细胞用PKH26染色(按照Sigma的说明书进行)。[0097]具体步骤如下:
[0098]a)常规消化，用不含FCS的MDM培养基洗涤一次，1000rpm, IOmin,倾去上清；
[0099]b)用500mL C液重悬细胞，涡旋振荡器混匀；
[0100]c)将4yL PKH26染料加入500 μ L C液中混匀后，加入到细胞悬液中，反复振荡5min ；
[0101]d)用FCS ImL中止反应，室温放置Imin ；
[0102]e)用含 5% FCS 的 RPMI 1640 培养基洗涤 4 次，每次 lOOOrpm，IOmin ；
[0103]f)用 D-Hank’ s 平衡盐溶液洗漆一次，I, OOOrpm, IOmin ；
[0104]g)显微镜下计数，调整细胞悬液为IO7个细胞/mL，放置在冰上待用；
[0105]h)用流式细胞仪检测荧光染料染色情况；
[0106]上述操作步骤均在避光的条件下进行。
[0107]2)经PKH26染色的间充质干细胞移植:
[0108]将受体N0D/SCID小鼠(6_8周龄)预先经铯源全身照射300cGy后在4h内从尾静脉输入经PKH26染色的间充质干细胞。实验组移植前用P-外来体预先孵育细胞，并将细胞与P-外来体一起经静脉注射小鼠。对照组的间充质干细胞未经P-外来体处理。所有小鼠均饲养在无菌环境下至移植后24h，以颈椎脱白法处死小鼠。取受体小鼠的骨髓，用流式细胞仪分析其中PKH26+供体 细胞的数量，实验组和对照组比较。
[0109]结果
[0110]间充质干细胞的迁移:
[0111]结果显示P-外来体短时间(24_48hr)内刺激间充质干细胞后，间充质干细胞的迁移能力增强(图2)。
[0112]间充质干细胞的短期归巢能力:
[0113]结果显示，P-外来体刺激后，干细胞的短期归巢能力明显增加。24h后其骨髓中PKH26+细胞的数量较未刺激组增加了约1.6倍。
[0114]2.参与调节免疫
[0115]本发明的初步结果表明P-外来体可以抑制T细胞的增殖，下调ThO向Th2的分化，从而使Thl细胞的比例上调，进而扭转了 Thl细胞和Th2细胞的比例失衡而达到新的平衡点。因此对于移植物抗宿主病具有治疗作用。
[0116]3.促进血管内皮细胞中NO的释放
[0117]本发明的初步结果表明P-外来体可以促进血管内皮细胞中NO的释放。NO在维持血管张力的恒定和调节血压的稳定性中起着重要作用。
[0118]4.P-外来体可以抑制HK2肾小管上皮细胞或HEK294T人胚胎肾脏细胞凋亡
[0119]凋亡诱导:
[0120]将HK2肾小管上皮细胞或HEK294T人胚胎肾脏细胞在无血清培养基中培养48h，诱导凋亡。实验组加入P-外来体。
[0121]凋亡的TUNEL (TdT-mediated dUTP nick end labeling)检测:
[0122]I)用新鲜配制的固定液室温固定细胞Ih個定液:pH 7.4PBS配制4%多聚甲醛)；
[0123]2)用 PBS 洗涤一次；
[0124]3)透化液(Permeabilisation solution)冰上作用 2min (透化液:0.l%TritonX-1OO溶于新鲜制备的0.1%柠檬酸钠)；
[0125]4) PBS 洗 2 遍;
[0126]5)将样品晾干；
[0127]6)每份样本加入 50 μ I TUNEL reaction mixture ；
[0128]7) 37 °C 避光孵育 Ih ;
[0129]8)加入 Hoechst33342 室温 Imin ；
[0130]9) PBS 洗 3 遍;
[0131]10)荧光显微镜下观察，拍照。[0132]结果:
[0133]P-外来体可以抑制HK2肾小管上皮细胞或HEK294T人胚胎肾脏细胞的凋亡(图3)。
[0134]5.P-外来体可以抑制肝星状细胞增殖
[0135]I)人永生化的肝星状细胞系(SCs) twnt-4:
[0136]用DMEM培养基加10%胎牛血清培养于37°C、5%C02、95%湿度的培养箱中。每3d半量换液。当细胞达70%~80%汇合时，用0.125%胰蛋白酶-0.0P/oEDTA常规消化，细胞按照1:3进行传代；
[0137]2) 3H-TdR掺入法检测肝星状细胞系的增殖能力:
[0138]将肝星状细胞系(SCs) twnt-4与不同的量的P-外来体共培养于24孔板中24h。加入I μ Ci/孔3H-TdR,继续在37°C、5%饱和湿度的CO2培养箱中培养。18h后，中止。用液闪仪测定每分钟脉冲数(cpm表示)。
[0139]结果:
[0140]P-外来体抑制肝星状细胞系的增殖能力:
[0141]将不同浓度的P-外来体与肝星状细胞系分别进行共培养后，肝星状细胞系的增殖能力均相对于单独培养时下降，提示P-外来体对肝星状细胞系的增殖影响是抑制性的作用(图4)。
[0142]6.P-外来体能够明显减少谷氨酸损伤后神经细胞PC12的凋亡，具有神经保护作用
[0143]I)谷氨酸毒性损伤模型及分组:
[0144]将PC12细胞按照I X IO5个细胞/孔的密度接种至96孔细胞培养板(或I X IO6个细胞/孔的密度接种至6孔细胞培养板)，正常培养24hr后弃去培养上清，D-Hanks?洗I遍，用DF12配制的0.5mM谷氨酸室温下作用15min，弃去含谷氨酸的培养基，D-Hanks’洗2遍，分别用不同组别培养基孵育，37°C培养箱培养24小时。用未经谷氨酸损伤的细胞作为对照组。
[0145]分组:1、正常培养组(对照组)
[0146]2、谷氨酸损伤组
[0147]3、谷氨酸损伤P-外来体保护组
[0148]2)细胞存活率检测(MTS法):
[0149]细胞存活检测使用CellTiter 96 AQueous One Solution Assay试剂盒,按照说明书进行操作。[0150]96孔板弃去培养上清，用D-Hanks’洗I遍后，每孔加入100 μ LDF12+20 μ L MTS,37°C培养箱孵育2hn酶标仪490nm检测吸光度。
[0151]结果:
[0152]应用MTS法检测谷氨酸损伤后不同处理组PC12细胞的存活率，结果显示p_外来体对于谷氨酸诱导的PC12细胞凋亡具有保护作用(图5)。
[0153]参考文献:
[0154]1.Pfeffer SR.Two Rabs for exo some re I ease [J].Nat CellBiol, 2010，12(1):3-4.[0155]2.Lachenal G, Pernet-Gallay Kj Chivet M，et a 1.Release of exosomesfrom differentiated neurons and its regulation by synaptic glutamatergicactivity[J].Mol Cell Neuroscij 2011, 46(2):409—418.[0156]3.Masyuk Al，Huang BQj Ward CJj et al.Bi I iary exosomes influencecholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through interaction withprimary cilia[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2010，299(4):G990_999.[0157]4.Friedman SL.Molecular regulation of hepatic fibrosis,an integratedcellular response to tissue injury.J.Biol.Chem.2000;275:2247.[0158]5.Friedman SL.Liver fibrosis_from bench to bedside.J Hepatol2003;38(Suppl.1):S38_`53.
【权利要求】
1.一种亚全能干细胞分泌的外来体，所述亚全能干细胞呈Flkl阳性，在体外具有诱导分化成三胚层来源的组织细胞的能力。
2.根据权利要求1所述的亚全能干细胞分泌的外来体，其特征在于其特异性表达下述microRNA:hsa-miR-3191_5p、hsa-miR-471l-3p 和 hsa_miR-1273a,优选地，其还特异性表达下述 microRNA:hsa_miR-3142、hsa-miR-4456 和 hsa-miR-4714_5p。
3.根据权利要求1或2所述的亚全能干细胞分泌的外来体，其特征在于所述亚全能干细胞的获取步骤如下: A)常规方法分离aMSC或bMSC或其他组织来源的间充质干细胞， B)以I个细胞/孔的密度将aMSC或bMSC或其他组织来源的间充质干细胞接种于96孔板中，待长出单克隆后，将这些单克隆进一步扩增， C)将单克隆进一步扩增后的细胞作为种子细胞，4-6h细胞完全贴壁后加入I号诱导培养基诱导I天后，更换2号诱导培养基继续诱导培养4天，获得亚全能干细胞，即Flkl阳性的MSC，所述I号诱导培养基包含l-100ng/ml活化素A+l_500ng/ml Wnt3a+0.1-20%FBS+HG_DMEM，优选地，5_50ng/ml 活化素 A，更优选地，10_30ng/ml 活化素 A ;优选地,50-300ng/ml Wnt3a,更优选地，100-300ng/ml Wnt3a ；优选地，2-10%FBS,更优选地，5-8%FBS,所述2号诱导培养基包含l-100ng/ml活化素A+1-500 μ MRA+0.1-50%FBS+HG-DMEM, 5-50ng/ml 活化素 A，更优选地，10-30ng/ml 活化素 A ;优选地，20-400 μ M RA，更优选地，50-200 μ M RA，将获得的具有上皮样形态的亚全能干细胞进行免疫细胞荧光染色检测和Western Blot检测，其中所述免疫细胞荧光染色检测的指标包括 Foxa2、Soxl7、Kdr、Tbx6、Eomes、Gsc、T、Soxl、Pax6,所述 Western Blot 检测的指标包括Foxa2、Soxl7、T、Gsc、Epcam、Vimatin,检测获得的干细胞是否具有三胚层分化潜能重要基因表型标志，即限定性的内胚层:Foxa2、Soxl7 ;中内胚层:Gsc、T、Eomes ;中胚层:Kdr、Tbx6 ;外胚层:S0Xl、PaX6，并且具有较高的诱导效率，FOXa2、SOX17阳性的限定性内胚层细胞效率达到90%以上。
4.根据权利要求1至3任一项所述的亚全能干细胞分泌的外来体，其特征在于其通过如下步骤获得: A)收集亚全能干细胞培养48小时的上清液， B)用差速离心法提取外来体，细胞培养上清液l，000Xg，离心10min;取上清，10，OOOXg离心10min ;取上清液，将30%蔗糖/重水垫、上清液及PBS依次放入离心管中，100，000 X g，离心Ih ;取混有外来体的蔗糖/重水垫，用PBS悬浮，加入到IOOkD超滤离心管中，重复3次，浓缩液即为P-外来体， C)用0.22 μ m的滤膜过滤除菌，放入_80°C冰箱中保存备用。
5.根据权利要求1至4任一项所述的亚全能干细胞分泌的外来体，其特征在于所述亚全能干细胞的来源为脂肪组织或骨髓组织。
6.一种含有权利要求1至5任一项所述的亚全能干细胞分泌的外来体的组合物。
7.一种制备权利要求1至5任一项所述的亚全能干细胞分泌的外来体的方法，其包括下述步骤: A)常规方法分离aMSC或bMSC或其他组织来源的间充质干细胞， B)以I个细胞/孔的密度将a MSC或bMSC或其他组织来源的间充质干细胞接种于96孔板中，待长出单克隆后，将这些单克隆进一步扩增， C)将单克隆进一步扩增后的细胞作为种子细胞，4-6h细胞完全贴壁后加入I号诱导培养基诱导I天后，更换2号诱导培养基继续诱导培养4天，获得亚全能干细胞，即Flkl阳性的MSC，所述I号诱导培养基包含l-100ng/ml活化素A+l_500ng/ml Wnt3a+0.1-20%FBS+HG_DMEM，优选地，5_50ng/ml 活化素 A，更优选地，10_30ng/ml 活化素 A ;优选地,50-300ng/ml Wnt3a,更优选地，100-300ng/ml Wnt3a ；优选地，2-10%FBS,更优选地，5-8%FBS,所述2号诱导培养基包含l-100ng/ml活化素A+1-500 μ MRA+0.1-50%FBS+HG-DMEM, 5-50ng/ml 活化素 A，更优选地，10-30ng/ml 活化素 A ;优选地，20-400 μ M RA，更优选地，50-200 μ M RA，将获得的具有上皮样形态的亚全能干细胞进行免疫细胞荧光染色检测和Western Blot检测，其中所述免疫细胞荧光染色检测的指标包括 Foxa2、Soxl7、Kdr、Tbx6、Eomes、Gsc、T、Soxl、Pax6,所述 Western Blot 检测的指标包括Foxa2、Soxl7、T、Gsc、Epcam、Vimatin,检测获得的干细胞是否具有三胚层分化潜能重要基因表型标志，即限定性的内胚层:Foxa2、Soxl7 ;中内胚层:Gsc、T、Eomes ;中胚层:Kdr、Tbx6 ;外胚层:S0Xl、PaX6，并且具有较高的诱导效率，FOXa2、SOX17阳性的限定性内胚层细胞效率达到90%以上， D)收集亚全能干细胞培养48小时的上清液， E)用差速离心法提取外来体，细胞培养上清液l，000Xg，离心10min;取上清，`10，OOOXg离心10min ;取上清液，将30%蔗糖/重水垫、上清液及PBS依次放入离心管中，`100，000 X g，离心Ih ;取混有外来体的蔗糖/重水垫，用PBS悬浮，加入到IOOkD超滤离心管中，重复3次，浓缩液即为P-外来体， F)用0.22 μ m的滤膜过滤除菌，放入_80°C冰箱中保存备用。
8.一种根据权利要求1至5任一项所述的亚全能干细胞分泌的外来体在制备促进间充质干细胞的迁移和短期归巢能力的药物中的用途。
9.一种根据权利要求1至5任一项所述的亚全能干细胞分泌的外来体在制备促进血管内皮细胞中NO释放的药物中的用途。
10.一种根据权利要求1至5任一项所述的亚全能干细胞分泌的外来体在制备抑制T细胞的增殖、下调ThO向Th2的分化的药物中的用途。
11.一种根据权利要求1至5任一项所述的亚全能干细胞分泌的外来体在制备抑制肾脏来源细胞凋亡的药物中的用途。`
12.一种根据权利要求1至5任一项所述的亚全能干细胞分泌的外来体在制备抑制肝星状细胞的药物中的用途。
13.一种根据权利要求1至5任一项所述的亚全能干细胞分泌的外来体在制备减少谷氨酸诱导的神经细胞凋亡的药物中的用途。
【文档编号】C12N5/0775GK103865873SQ201210535397
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月12日 优先权日:2012年12月12日
【发明者】赵春华 申请人:中国医学科学院基础医学研究所