从胎盘胎儿面绒毛膜中提取亚全能干细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及干细胞领域，涉及一种来源于胎盘胎儿面绒毛膜的亚全能干细胞的方法，还涉及一种从胎盘胎儿面绒毛膜中提取亚全能干细胞的方法，本发明进一步涉及该亚全能干细胞的用途。所得的亚全能干细胞还可以进一步地被扩增。
【背景技术】
[0002]哺乳动物生物体是由万亿个细胞构成的。细胞是人体的基本结构单位和功能单位，由干细胞分化而来，因此干细胞是人体各种组织器官的起源细胞。干细胞具有自我复制和多向分化的特征。在正常生殖生理过程中，干细胞由受精卵分化而来。受精卵最初发育形成原始胚胎干细胞，后者具有形成完整个体的全部潜能。原始胚胎干细胞进一步分化增殖形成囊胚样结构，其内层细胞群的细胞也称胚胎干细胞。囊胚内层的单个胚胎干细胞不能形成一个完整的个体，但具有形成人体各种组织的全能性。囊胚胚胎干细胞继续分化发育，逐步形成胎儿各器官的功能执行细胞，同时以不对称分裂增殖的模式在机体组织特别是造血组织，包括连接胎儿和母体的胎盘脐带血、骨髓、外周血、肝和脾中保留有不同分化潜能的干细胞。在整个胎儿发育到成年这个漫长而复杂的过程中，干细胞逐级丧失其全能性，形成亚全能干细胞(Pluripotent stem cell，PSC ;亦有称为 sub-totipotent stem cells)、多能干细胞(Multipotent stem cell)和专能干细胞(Specialized stem cell)，后者按分化功能分别称造血干细胞、血管干细胞、皮肤干细胞，等等。这些处于不同发育阶段的干细胞在人体组织器官的发育生长、损伤修复过程中发挥着决定性的作用，因此干细胞可以用来新陈代谢、修复组织器官，使机体活力旺盛而保持健康状况。
[0003]迄今为止，人们对造血干细胞等专能干细胞的了解和临床使用比较深入，对胚胎干细胞的了解也有长足的进展，但对亚全能干细胞，即在发育阶段及分化能力上与胚胎干细胞接近，表达胚胎干细胞的许多特征，又具备多能干细胞的许多生物学特征，移植到体内不产生畸胎瘤，这样一类干细胞了解甚少。
[0004]但是，亚全能干细胞属于成体干细胞范畴，避免了类似胚胎干细胞的医学伦理问题，其在临床上具有广阔现实的应用前景。因此，亚全能干细胞已经成为干细胞研究的一个热点。
[0005]近年来研究表明，在成体胎盘组织中，富含着一种具有多向分化能力的亚全能干细胞。胎盘是哺乳动物妊娠期间母子间交换物质的过渡性器官，其生理功能已被广泛研究，但是胎盘作为一种细胞资源，其研究还处在起步阶段。也就是说，上皮层的形成早于内、中、外三个胚层的发生，因此，胎盘亚全能细胞的分化能力强于其他起源于三个胚层的多能干细胞。根据已有的研究显示，胎盘亚全能细胞可以向内、中、外三个胚层的细胞进行分化，例如，胎盘亚全能细胞可以诱导分化成为心肌细胞、神经细胞、肝脏细胞、胰岛细胞等等。此夕卜，多项动物实验表明，胎盘亚全能细胞可以有效治疗肺纤维化、肝硬化、帕金森和多发性硬化等病症。
[0006]胎盘亚全能干细胞是一种重要的细胞资源。因此人胎盘亚全能干细胞属于成体干细胞范畴，避免了胚胎干细胞的伦理争议，而且胎盘的获取容易，不会对产妇造成二次伤害，具有非常广阔的市场前景。
[0007]现有技术已有诸多关于亚全能干细胞提取制备方法。例如，CN101748096B(200810240040.8)公开了一种新的亚全能干细胞制剂生产工艺技术及其用途，该干细胞制剂特征是:从人胎盘或脐带分离提取⑶151+⑶31-SOX-2+的亚全能干细胞，在特定培养条件下贴壁生长，传代扩增至20代仍然基因稳定，注射至动物体内不产生畸胎瘤。这些亚全能干细胞高表达⑶151和胚胎干细胞标志0ct4和Sox-2，以及间叶组织、神经、血管、肝、肌组织细胞的一些特异性标志，不表达⑶31、⑶34、⑶45、HLA-1I。在体外培养和动物体内向人体三个胚层的组织细胞分化，并能修复相应组织的损伤，改善其功能。本发明建立了 PSC的组织分离和培养以及规模化制备工艺技术，制备出高纯度注射制剂。该亚全能干细胞制剂的有益效果是在动物和人体临床试验中，对许多组织器官损伤或衰老导致的疾病有良好的疗效，且无毒副作用，异体使用不产生免疫排斥反应。
[0008]CN102703380B (201210166714.0)公开了一种亚全能干细胞，其来源于剪断的人类脐带或胎盘，细胞标志是⑶151+0CT4+⑶184-，其在培养容器中贴壁生长，能向人体内、中、外胚层组织分化。本发明也公开了该亚全能干细胞的制备方法，及其用于制备治疗细胞损伤或细胞衰老疾病的药物中的用途，以及其用作基因治疗药物的载体细胞的用途。
[0009]CN103275926B(201310170574.9)公开了一种从胎盘小叶组织中提取亚全能干细胞的方法，特点是包括胎盘预处理后，利用胎盘小叶组织制备细胞悬液，再利用细胞悬液制备得到亚全能干细胞分离液的步骤；然后将亚全能干细胞分离液进行原代培养和二代培养，收集二代培养过程中完全脱落细胞即得到亚全能干细胞的步骤；最后进行程序降温冻存，将温度降至-80?-90.(TC后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存即可，优点是传代能力可达20代，不仅具有向成骨、软骨、脂肪和神经细胞分化的能力，还具有向胰岛细胞和表皮细胞分化的能力，亚全能干细胞均一、稳定、生长周期短，操作简单，成本低。
[0010]CN103966159AB (201410050051.5)公开了一种人胎盘亚全能干细胞，其来源于剥离的人类胎盘羊膜，针对羊膜的上皮层和间充质层所含有的细胞特点，采用了逐步分离的方法，最大限度地减少了羊膜间充质层细胞对胎盘亚全能细胞的污染，有效地提高了人胎盘亚全能细胞的干性。该方法具有成本低、应用前景广阔、可为临床和研究提供大量干细胞资源的特点。本发明还提供了一种从胎盘羊膜制备人胎盘亚全能干细胞并建立干细胞库的方法。
[0011]CN104152408A(201410400235.X)公开了亚全能干细胞的制备方法，包括如下步骤:组织的获得，消毒处理，组织的分离、洗涤和剪碎，胶原酶消化，亚全能干细胞的获得。本发明公开了一种从脐带、胎盘羊膜、绒毛膜或基蜕膜组织中分离亚全能干细胞的方法，获得的亚全能干细胞均一、稳定、生长周期短。
[0012]然而，本领域仍然期待有新的提取制备亚全能干细胞的方法，并且期待这种方法具有优异的效能。
【发明内容】
[0013]本发明的目的在于提供一种新的提取制备亚全能干细胞的方法，并且期待这种方法具有优异的效能。本发明另一目的在于提供一种亚全能干细胞。本发明的再一目的在于提供亚全能干细胞的用途。
[0014]为此，本发明第一方面提供了一种从胎盘胎儿面绒毛膜中提取亚全能干细胞的方法，该方法包括以下步骤:
[0015](I)从采集盒中取出胎盘于白瓷盘中，去除羊膜和瘀血后，使用生理盐水反复冲洗胎盘表面，进行消毒处理；
[0016](2)转移至新白瓷盘中，剪取胎儿面绒毛膜于10mm玻璃皿中，尽量剔除表面残留的胎盘小叶组织，剪碎至0.5?1.5_3左右的小块；
[0017](3)使用300目筛网，用大量生理盐水冲洗组织小块，去除其中残留的血细胞；
[0018](4)组织消化:使用I?2倍组织体积的混合酶(0.lmg/ml的I型胶原酶，0.1mg/ml的II型胶原酶，0.lmg/ml透明质酸酶和0.05mg/ml中性蛋白酶)，在37度恒温摇床10rpm振荡消化10?30min ；
[0019](5)消化结束后加适量FBS终止，300目滤网过滤，加大量生理盐水冲洗滤渣，获得尽量多的细胞；
[0020](6)滤液经 1000 ?2000rpm(特别是 1500rpm)离心 5 ?15min(特别是 1min)后，弃上清，再加生理盐水洗涤，1000?1500rpm(特别是1200rpm)离心2?1min (特别是5min)，得单核细胞；
[0021 ] (7)磁珠分选(0CT-4阳性、Nanog阳性和STR0-1阴性)，获得目标细胞。
[0022]根据本发明第一方面的方法，其中还进一步包括如下步骤:
[0023](71)对所得目标细胞取样，细胞计数仪(例如Sysmex)计数，流式细胞仪(例如FC500)检测其活性。
[0024]根据本发明第一方面的方法，其中还进一步包括如下步骤:
[0025](72)采用程序降温仪冻存目标细胞，储备。
[0026]根据本发明第一方面的方法，其中还进一步包括如下扩增步骤:
[0027](73)将目标细胞接种至多个T25培养瓶(0.5?2 X 15细胞/瓶，特别是I X 10 5细胞/瓶)中，添加亚全能干细胞培养基(DMEM-F12培养基+10%FBS+10ng/ml成纤维细胞生长因子BFGF+10ng/mL人表皮细胞生长因子)，传至Pl代后，收获，冻存，储备，任选地进行流式鉴定。
[0028]根据本发明第一方面的方法，其中所用的生理盐水是无菌的。
[0029]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中将胎儿面绒毛膜剪碎至Imm3左右的小块。
[0030]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中使用1.5倍组织体积的混合酶。
[0031]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中的混合酶中还包含0.01?0.03mol/L枸橼酸。特别是包含0.02mol/L枸橼酸。
[0032]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，在37度恒温摇床10rpm振荡消化20mino
[0033]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(73)中，将亚全能干细胞接种到无菌培养瓶内，并加入培养液，然后置于37°C、饱和湿度、C02体积分数为5%的培养箱内开始原代培养3?4天后；将无菌培养瓶内培养液和未贴壁的细胞倒掉，并重新加入相同体积的培养液，置于上述培养箱内继续培养直至无菌培养瓶内细胞达到75?85%的融合度后，倒掉无菌培养瓶内培养液；将浓度为0.25%的胰蛋白酶溶液按20%培养液体积的添加量加入到无菌培养瓶内，37°C消化I?5分钟后，将无菌培养液倒入无菌培养瓶内终止消化，拍打晃动培养瓶，使细胞完全脱落，将完全脱落的细胞和培养液倒入离心管内，于1000?2000rpm离心5?10分钟，将离心所得的沉淀用含10%胎牛血清的培养液混匀沉淀，收集培养过程中完全脱落细胞即得到经扩增的亚全能干细胞。
[0034]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(72)和步骤(73)中所述的对亚全能干细胞进行的冻存是照如下方法进行的:
[0035]将