一种制备胎盘造血干细胞制剂的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，具体地，涉及一种制备胎盘造血干细胞制剂的方 法。
【背景技术】
[0002] 胎盘干细胞是来源于新生儿胎盘组织的干细胞，其中包括胎盘亚全能干细胞、胎 盘造血干细胞、胎盘间充质干细胞、胎盘母亲干细胞等。胎盘造血干细胞是存在于胎盘组织 中的一群原始造血细胞造血干细胞，是血细胞（红细胞、白细胞、血小板等）的祖细胞，是高 度未分化细胞。
[0003] 对人类胎盘的研宄发现，胎盘是一个造血器官。从怀孕第三周开始直至出生，胎盘 在发挥物质交换、免疫调控、活性因子分泌等功能的同时，也承担着造血功能。胎盘组织来 源造血干细胞数量丰富。研宄表明胎盘⑶34+细胞百分率是脐带血的8. 8倍，⑶34+CD381田 胞和⑶34+⑶38+细胞百分率分别是脐带血的4. 6倍和11. 9倍，说明胎盘组织中含有比脐带 血更丰富的造血干细胞。另外胎盘中的淋巴细胞总数、T细胞（⑶3+⑶2+)、B细胞（⑶19_)、 Th (⑶3+CD4+)细胞及Th/Ts比值均明显低于脐带血，而⑶8+CD28_I^^制细胞则明显高于脐 带血。说明胎盘组织来源的造血干细胞的免疫原性要低于脐血和外周血造血干细胞。
[0004] 骨髓和外周血造血干细胞移植技术都存在HLA配型要求严格的缺陷，很大程度上 限制了其临床应用；新生儿脐血作为造血干细胞的采集不具有侵入性，HLA配型的严格性 标准较低，但其中所含的CD34+细胞数目较低，约为每骨髓单位中造血干细胞的十分之一， 会导致较高的移植失败风险。人胎盘是更为丰富的造血干细胞来源，平均每个胎盘可以分 离出（1-4) X IO9单个核细胞，完全可以满足100公斤体重以下的病人血液造血干细胞重 建的需要，为其临床应用开辟了广阔前景。在建立成熟且高效的分离技术的基础上，将胎盘 中获取的高纯度、高活率干细胞/组细胞制成可直接冻存的临床用细胞制剂，以密闭袋装 的方式长期储存于液氮中，这样便可在移植前及时复苏而省去繁琐的细胞洗涤过程，易于 质控。
[0005] 已经出现了多种分离和培养胎盘造血干细胞的技术，例如CN102660499A公开了 一种胎盘造血干细胞及其制备方法和胎盘造血干细胞注射剂，该制备方法联合多种胶原酶 消化胎盘组织以提高细胞得率，同时提供造血干细胞注射剂制备方法；CN103789262A公布 了一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法及保存方法，该方法通过灌注法从绒毛血管 中提取细胞。
[0006] 但是，实验证实，上述方法中，胎盘的细胞分离效率较低，并且胎盘造血干细胞在 冻存后必须经过复苏和培养，无法直接使用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种胎盘细胞分离效率较高，并且胎盘造血干细胞在冻存后 可以直接使用的制备胎盘造血干细胞制剂的方法。
[0008] 本发明的发明人出乎意料地发现，通过选择特定组成的酶溶液来消化胎盘组织， 并选择特定组成的冻存液来冻存细胞，能够在提高胎盘细胞分离效率的同时，还能使胎盘 造血干细胞在冻存后可以直接使用，由此得到了本发明。
[0009] 为了实现上述目的，本发明提供了一种制备胎盘造血干细胞制剂的方法，其特征 在于，该方法包括如下步骤：（1)用酶溶液消化胎盘组织，得到消化产物并去除所述消化产 物中的组织残渣，得到酶解液；(2)将所述酶解液与羟乙基淀粉溶液混合并使混合得到的 物料分层，得到上层的有核细胞悬液；（3)将所述有核细胞悬液与冻存液混合；其中，所述 酶溶液含有100_400IU/mL的I型胶原酶、20-80IU/mL的DNA酶I、l-4IU/mL的分散酶和 400-1000IU/mL的透明质酸酶；所述冻存液中含有20-65mL/L的二甲基亚砜、3-30g/L的羟 乙基淀粉、30_130g/L的人血白蛋白、5-40g/L的右旋糖酐、4-6. 5g/L的氯化钠、3. 5-6g/L的 葡萄糖酸钠、3-4. 5g/L的醋酸钠、0. 2-0. 6g/L的氯化钾和0. 1-0. 5g/L的氯化镁。
[0010] 通过上述技术方案，本发明能够在提高胎盘造血干细胞分离效率的同时，还能使 冻存的胎盘造血干细胞在升温至常温后直接用于例如异体注射的临床干细胞治疗。
[0011] 本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【具体实施方式】
[0012] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0013] 在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的物料的体积数值均为1个标准大 气压的压力和20°C的温度下的数值。
[0014] 本发明提供了一种制备胎盘造血干细胞制剂的方法，其特征在于，该方法包括 如下步骤：（1)用酶溶液消化胎盘组织，得到消化产物并去除所述消化产物中的组织残 渣，得到酶解液；（2)将所述酶解液与羟乙基淀粉溶液混合并使混合得到的物料分层，得 到上层的有核细胞悬液；(3)将所述有核细胞悬液与冻存液混合；其中，所述酶溶液含有 100-400IU/mL 的I型胶原酶、20-80IU/mL 的 DNA 酶 I、l-4IU/mL 的分散酶和 400-1000IU/ mL的透明质酸酶；所述冻存液中含有20-65mL/L的二甲基亚砜、3-30g/L的羟乙基淀粉、 30-130g/L的人血白蛋白、5-40g/L的右旋糖酐、4-6. 5g/L的氯化钠、3. 5-6g/L的葡萄糖酸 钠、3-4. 5g/L的醋酸钠、0. 2-0. 6g/L的氯化钾和0. 1-0. 5g/L的氯化镁。
[0015] 根据本发明，其中，根据本发明特别优选的一种实施方式，所述酶溶液含 有 200-300IU/mL 的I型胶原酶、30-50IU/mL 的 DNA 酶I、l.5-3. 5IU/mL 的分散酶和 600-800IU/mL的透明质酸酶；所述冻存液中含有35-50mL/L的二甲基亚砜、10-20g/L的羟 乙基淀粉、50-100g/L的人血白蛋白、10-20g/L的右旋糖酐、5-5. 5g/L的氯化钠、4. 5-5g/L 的葡萄糖酸钠、3. 4-3. 9g/L的醋酸钠、0. 3-0. 45g/L的氯化钾和0. 2-0. 4g/L的氯化镁。在 该优选实施方式中，本发明能够进一步提尚胎盘细胞分尚效率，并且提尚冻存后的胎盘造 血干细胞在恢复常温后的造血定植能力。
[0016] 根据本发明，其中，所述胎盘组织与所述酶溶液的重量比可以为1 :(0.5-5)，优选 为1 : (1-4);所述酶解液与所述羟乙基淀粉溶液的体积比可以为1 : (0. 1-0. 5)，优选为1 : (0. 2-0. 4);所述有核细胞悬液与所述冻存液的体积比为1 : (6-10)，优选为1 : (7-9)。
[0017] 根据本发明，其中，所述羟乙基淀粉溶液可以为沉淀红细胞所用的常规的所述羟 乙基淀粉溶液，例如所述羟乙基淀粉溶液可以含有10_90g/mL的羟乙基淀粉，优选含有 20-80g/mL的羟乙基淀粉。
[0018] 根据本发明，其中，所述羟乙基淀粉的分子量可以为450000-700000，优选为 480000-600000,取代度可以为0. 4-0. 7,优选为0. 5-0. 6 ;所述右旋糖酐的分子量可以为 32000-42000,优选为 38000-41000。
[0019] 根据本发明，其中，所述I型胶原酶是指EC编号为3. 4. 24. 3的酶，可以通过商购 获得，例如可以为购自SIGM公司的商品号为C0130的产品；所述DNA酶I是指EC编号为 3. 1. 21. 1的酶，可以通过商购获得，例如可以为购自SIGM公司的商品号为D5025的产品； 所述分散酶是指EC编号为3. 4. 24. 4的酶，可以通过商购获得，例如可以为购自Roche公司 的商品号为04942078001的产品；所述透明质酸酶是指EC编号为3. 2. 1. 35的酶，可以通 过商购获得，例如可以为购自SIGM公司的商品号为H4272的产品。
[0020] 根据本发明，其中，所述酶溶液、所述羟乙基淀粉溶液和所述冻存液可以具有与血 浆渗透压相等的渗透压，以减少细胞的破裂。
[0021] 根据本发明，其中，用所述酶溶液消化所述胎盘组织的条件可以包括：温度可以为 35-38°C，时间可以为20-40分钟。
[0022] 根据本发明，其中，可以通过过滤和/或瞬时离心去除所述消化产物中的组织残 渣。其中，所述瞬时离心的条件可以包括：时间可以为30-60秒，速度可以为210-340Xg。
[0023] 根据本发明，其中，可以通过静置10-30分钟和/或450-750Xg的离心使混合得 到的物料分层。
[0024] 根据本发明，其中，将所述有核细胞悬液与冻存液混合后所得的物料可以进行冻 存。进行冻存的条件可以为细胞冻存领域常规的条件，例如，可以降温速度为〇. 5-5°C /分 钟的程序降温来是待冻存的物料的浓度降低至零下80°C至零下220°C。
[0025] 根据本发明，其中，所述有核细胞悬液与冻存液混合后所得的物料在冻存后即得 到本发明的胎盘造血干细胞制剂，该胎盘造血干细胞制剂可长期存放，例如可以存放3天 至30年；该胎盘造血干细胞制剂可以在从冻存状态升温至常温后直接进行异体注射。
[0026] 以下，通过实施例进一步详细说明本发明。以下实施例和对比例中，所用的I型 胶原酶、DNA酶I、分散酶、透明质酸酶、羟乙基淀粉、人血白蛋白、右旋糖酐及其它药品均为 商购获得的医药级的无菌药品。其中，I型胶原酶为购自SIGM公司的商品号为C0130的 产品；DNA酶I为购自SIGMA公司的商品号为D5025的产品；分散酶为购自Roche公司的 商品号为04942078001的产品；透明质酸酶为购自SIGMA公司的商品号为H4272的产品； 羟乙基淀粉为购自四川科瑞德凯华制药有限公司的商品号为9005-27-0的产品，分子量为 450000-700000,取代度为0. 7 ;人血白蛋白为购自SIGMA公司的商品号为A1653的产品；右 旋糖酐为购自上海华壹生物科技有限公司的商品号为140638的产品，分子量为40000。以 下实施例中，所用的胎盘均是在符合伦理道德规范下受到捐赠而获得的；并且，所用的胎盘 均是在分娩结束后24小时内用于制备胎盘造血干细胞制剂；其中，在用于制备胎盘造血干 细胞制剂之前，胎盘浸泡于含有青霉素200IU/mL、链霉素0. 2mg/mL、盐酸四环素0. 02mg/mL 和两性霉素B 0.0 lmg/mL的HBSS生理缓冲液中，并且在用于制备胎盘造血干细胞