鱼用儿茶素制剂的制备方法
【技术领域】
[0001] 儿茶素为茶叶中最主要的天然活性成分，具有多种药理和保健活性。本发明涉及 一种新型、高生物利用度的鱼用儿茶素保健制剂的制备方法及其评价。
【背景技术】
[0002] 目前，由于工农业的快速发展和人类对自然界的不断索取导致的环境污染、气候 变化等对我国水域环境、水产渔业养殖的影响也已逐渐显现，尤其在我国一些经济相对较 发达的地区，由于化工厂、印染厂等高污染企业的大量污染物排放，已经对当地养殖和天然 水源产生了严重污染。近年来，加之水产养殖集约化技术的不断深入，随后产生的由养殖水 环境饲料残留、富营养化以及随之产生的水污染等因素引起的鱼类疾病日趋严重，尤其是 饲料中高营养素引起的疾病逐渐突出。目前，养殖人员为了加快鱼类的生长，缩短饲养周 期，在饲料中加入大量的营养素，从而导致肝脂质、营养素代谢紊乱导致的肝性疾病，虽然 此类疾病无传染性，但危害可能远远超过传染病。
[0003] 茶多酚（TeaPolyphenols，TP)是茶叶中多酚类及其衍生物的总称，主要有儿茶 素、黄酮类、花青素和酚酸等物质组成，其中儿茶素类占茶多酚总量的60% -90%。儿茶 素具有很强的生物活性，大量研究均表明儿茶素具有抗氧化清除自由基、抗心血管疾病、降 "三高"（高血脂、高血压和高血糖）、抑菌消炎等多种药理保健作用。加之儿茶素类化合物 具有排除体内有毒、有害物质（如清除重金属、自由基等）的能力，因此开发新型鱼用儿茶 素类水生动物保健品对于发展我国绿色水产养殖、保证鱼类健康、降低渔药使用和水产品 药物残留具有良好的研发前景。
[0004] 同时由于我国是世界上最大的茶叶种植国和茶叶加工出口国，每年有大量尚品质 茶叶采摘、加工和生产，在这些高品质茶叶加工过程，大量次品、茶叶下脚料等被废弃，而其 中仍含有大量的儿茶素类等天然活性成分，如果直接将这些次品、下脚料丢弃，不但大量资 源被浪费，而且还对环境造成重大污染。因此，通过各种萃取技术将其中的大量的儿茶素制 备纯化，然后应用于水产养殖领域，不仅减少了资源浪费，而且对发展茶产业循环经济具有 重要影响。所以研发制备新型鱼用儿茶素类动物保健品，从而提高儿茶素稳定性和鱼体内 的生物利用度，必将为儿茶素的开发利用与我国渔业生产的结合奠定坚实的基础。
[0005] 结合本实验室前期研究积累和大量文献资料可知，由于儿茶素类化合物极性较 大、水溶性较高，生物膜渗透性较差，加之小肠上皮细胞膜中转运蛋白（P-糖蛋白、多药耐 药相关蛋白等）可能对儿茶素发挥"外排"作用，从而使得该类化合物口服后难以通过小肠 上皮细胞进入全身血液循环，以致儿茶素类化合物在机体内的生物利用度较低，大部分在 肠道中被各种酶或微生物所代谢和降解，或随粪便排泄到体外，从而使得该类化合物难以 在体内发挥有效作用。因此，如何提高儿茶素类化合物生物膜转运速率，从而提高其生物利 用度和增强儿茶素类化合物在作用靶部位的富集，是解决限制儿茶素大规模应用这一重要 "瓶颈"的关键共性问题。目前在提高儿茶素生物膜转运方面的研究主要集中在儿茶素衍生 化物的制备和应用上，近来年也有学者开展了儿茶素/茶多酚纳米粒制剂或注射用纳米乳 剂的研究，但此类研究主要是针对人类保健品开发进行的有益探索，此类研究并不适合水 产养殖上的应用。
[0006] 具体而言，目前为了提高儿茶素类天然成分的生物膜转运速率或生物利用度，主 要有如下几种剂型和制剂：
[0007] 1、茶多酚的微囊制剂：该剂型以乙基纤维素为囊材，采用溶剂挥发技术制备茶多 酚（TP)缓释微囊，该剂型可以提高TP稳定性和缓释作用，且包封率较高，但TP主要活性成 分儿茶素的含量降低了，可能是乙基纤维素结构中含有多酚羟基，与儿茶素酚羟基结合使 之难以溶出。
[0008] 2、茶多酚的微球制剂：该剂型以生物可降解高分子材料羟丙基甲基纤维素邻苯二 甲酸酯（HPMCP)为骨架材料，制备了TP微球，结果显示加入少量乳化剂可提高TP的包封 率，具有一定的缓释效果。
[0009] 3、茶多酚的脂质体：采用逆相蒸发法制备TP-维生素E脂质体，包封后可增加TP 的稳定性，并具有长效特点，同时也可以显著提高其生物膜转运和生物利用度。
[0010] 然而，上述这些能够显著提高儿茶素类化合物生物膜转运速率或生物利用度的制 剂，均为针对人类的使用方式所制备，这些制剂难以用于鱼类动物。
【发明内容】
[0011] 本发明要解决的技术问题是提供一种能提高儿茶素生物利用度的鱼用半固体胶 囊制剂---鱼用儿茶素制剂的制备方法。
[0012] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种鱼用儿茶素制剂的制备方法，包括以下 步骤：
[0013] 1)、儿茶素溶液的配制：
[0014] 将儿茶素溶解于超纯水，配制成浓度为9~llmg/mL(较佳为10mg/mL)的儿茶素 EGCG液体；
[0015]2)、在儿茶素EGCG液体中加入PEG1000 (聚乙二醇1000,作为吸收促进剂），直至 PEG1000 的终质量浓度为10%~30%;
[0016] 然后再加入抗氧化剂和混合氨基酸，最后加入PEG4000 (作为半固体胶凝剂）直至 PEG4000 的终质量浓度为10%~20%;
[0017] 所述抗氧化剂与儿茶素EGCG液体的质量比为0. 25~0. 5%，混合氨基酸与儿茶素 EGCG液体的质量比为0. 5~1. 0%;
[0018] 3)、液体灌装胶囊的制备：
[0019] 将步骤2)所得液体灌入胶囊中，得鱼用儿茶素制剂。
[0020] 备注说明：上述液体在胶囊中会自然凝固形成半固体状态。
[0021] 作为本发明的鱼用儿茶素制剂的制备方法的改进：
[0022] 所述抗氧化剂为亚硫酸钠；
[0023] 所述混合氨基酸由茶氨酸和甘氨酸组成，所述茶氨酸的重量含量为8~12% (较 佳重量含量为10%，即，混合氨基酸由茶氨酸和甘氨酸按照1 :9的重量比例混合而得）。
[0024] 作为本发明的鱼用儿茶素制剂的制备方法的进一步改进：所述步骤2)在100~ 200转/分的搅拌转速下进行（磁力搅拌）。
[0025] 作为本发明的鱼用儿茶素制剂的制备方法的进一步改进：
[0026] 所述步骤1)中：儿茶素EGCG液体的浓度为10mg/mL;
[0027]所述步骤2)中：PEG1000的终质量浓度为20%，亚硫酸钠与儿茶素EGCG液体的质 量比为0. 4%，混合氨基酸与儿茶素EGCG液体的质量比为1. 0%，所述混合氨基酸由茶氨酸 和甘氨酸按照1 :9的重量比例混合而得，PEG4000的终质量浓度为20%。
[0028] 在本发明中：
[0029] 步骤1)可利用超声振动，从而使儿茶素溶解于超纯水中；
[0030] 步骤2)在100~200转/分的搅拌条件下进行（例如为磁力搅拌），步骤2)所得 液体为磁力搅拌下呈低粘度的儿茶素混合溶液；
[0031 ] 步骤3)中，一般每粒胶囊灌装0. 5-1.OmL的液体。
[0032] 本发明的鱼用制剂（鱼用儿茶素制剂）属于一种生物利用度增强型儿茶素鱼用半 固体胶囊制剂。
[0033] 本发明在发明过程中，根据鱼肠道吸收模型，通过定量检测不同吸收促进剂对儿 茶素EGCG体内的吸收量，从而筛选出能够提高儿茶素生物利用度的吸收促进剂，并使之与 儿茶素以适当比例混合，从而制成半固体胶囊制剂。本发明的鱼用制剂能够提高鱼体内的 儿茶素生物利用度。即，本发明主要是考虑到鱼类肠道特点和生活习性，采用PEG1000 (为 吸收促进剂）和PEG4000(为半固体胶凝剂）作为制剂辅料，从而能够显著达到满足儿茶素 剂型的完整性和肠道中吸收的快速转运特点。
[0034] 本发明采用鱼血浆生物利用度方法评价，具体实施如下：
[0035] 1)、实验用鱼血浆样品中儿茶素EGCG的定量检测方法的建立：采用向0. 3mL空白 血浆中加入儿茶素EGCG标准品的方法，配制浓度范围为0. 5-500mg/L的儿茶素EGCG标准 样品，向其中加入30yL20%的抗坏血酸，混合后加入2-3mL乙酸乙酯，振荡lmin，6000r/ min高速离心5min，取出全部有机相，残渣用2mL乙酸乙酯重复萃取一次，合并两次萃取 有机相，于45°C水浴中氮气流吹干，残渣用0.lmL20%的乙腈水溶液溶解，超声振荡后， 12000r/min高速离心3min，取20μL上清液HPLC进样分析。
[0036] 根据HPLC检测结果，以峰面积（Υ)为纵坐标，质量浓度（X)为横坐标，绘制标准曲 线，求出曲线方程和相关系数（r)。同时制备含儿茶素EGCG曲线范围内高、中、低浓度血浆 样品0. 5, 5. 0, 50.Omg/L作为质控样品（QC)，分别按照上述样品处理方法处理后进样分析， 每个浓度样品重复5次，以样品中EGCG峰面积与直接溶于流动相下所测峰面积之比，计算 高、中、低3种浓度下方法回收率。比较以上样品于日内5次和日间5次测定的峰面积的变 化，计算日内精密度和日间精密度。
[0037]2)、实验用鱼的选择：实验用健康鲫鱼购于杭州萧山跃腾水产养殖有限公司，体重 150±20g，实验组200条健康鲫鱼随机分为4组，胶囊饲喂组（本发明）、普通儿茶素EGCG 颗粒料组、腹腔注射组和空白对照组，每组50只，每组均分别放入2个lmX lmX lm水族箱 中适应性养殖3天，循环水养殖。上述4个实验组正式实验饲喂前12h均禁食。胶囊饲喂 组、普通儿茶素颗粒料组剂量均为200mg/kg.天，腹腔注射组剂量为100mg/kg.天；备注说 明：上述200mg、100mg均指的是有效成分儿茶素的用量。
[0038] 3)、生物利用度的计算：将上述不同实验组和对照组，分别于处理后0.083、0. 17、 0. 5、1. 0、2. 0、4. 0、8. 0、12. 0、24. 0和48.Oh尾静脉取血，每个时间点采血5只，然后将所取 血液于肝素化离心管中，6000r/min离心后，取1. 5mL血浆于lOmL离心管中，同时按照1)项 下的处理方法处理后进HPLC分析。将所测血浆中儿茶素EGCG峰面积代入上述标准曲线方 程中，计算血浆中儿茶素EGCG浓度，绘制血药浓度--时间曲线，利用3P97药物动力学软 件计算药物浓度一时间曲线下面积（AUC)，将胶囊饲喂组和普通儿茶素EGCG颗粒饲料组分 别与腹腔注射组所得AUC数值进行比较，以此来评价新型制剂对儿茶素在小肠内吸收生物 利用度的影响。
[0039] 本发明在对儿茶素在鱼肠道吸收增强作用研究的基础上，筛选出良好的儿茶素保 健品新配方，从而制