专利名称：一种胎盘间充质干细胞的规模化制备方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，具体涉及一种胎盘间充质干细胞的制备方法。
背景技术：
间充质干细胞在发育生物学研究和临床治疗，如组织和器官修复等方面具有广阔 的应用前景，间充质干细胞最先在骨髓中确认存在，随后在成人外周血、骨膜、肌肉和脂肪 组织等处均发现有间充质干细胞的存在。间充质干细胞属于多能干细胞，在相应的诱导条 件下能分化为骨、脂肪、软骨、肌肉和肝细胞等不同类型的细胞。目前成人骨髓是间充质干 细胞临床应用的主要来源，但存在明显的缺陷，如成人骨髓中的间充质干细胞含量非常少 (约0. 001%-0. 01% )。此外，在衰老和疾病状态下，骨髓间充质干细胞的数量和分化潜能 下降，且采集骨髓为创伤过程。所以寻找其他的间充质干细胞来源迫在眉睫。研究表明，胎盘间充质干细胞具有多向分化潜能及造血支持和免疫抑制效应，其 扩增能力优于成人骨髓间充质干细胞。胎盘来源丰富、取材方便是间充质干细胞又一新来 源。现有技术的胎盘间充质干细胞的制备方法是利用胎盘特殊的解剖结构，采用灌流 法，用灌流液孵育胎盘；从灌流液中分离单个核细胞，洗涤后用间充质干细胞培养基悬浮所 获细胞，进行培养。取胎盘母体侧蜕膜，剪碎小块胎儿蜕膜侧胎盘组织，0. 1% IV型胶原酶 消化后收集细胞，以细胞培养基(含DMEM、10%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺)进行贴壁培养。从胎盘组织中提取间充质干细胞，胎盘中血液含量非常多，冲洗时消耗试剂多，且 易冲洗不彻底；现在多采用将整个胎盘组织剪切，胎盘组织体积大且厚，剪切时耗时耗力； 使用消化酶进行消化时需酶量大，耗材多；组织接种时由于组织块体积大及数量多，所耗试 剂及器材多，工作量大易污染。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明人在现有制备技术的基础上，改进制备方法。 将制备过程程序化，简化操作步骤，缩短操作时间，减少工作量，从而也可在很大程度上避 免污染，减少制备过程所需试剂和耗材，并且在做到以上所述之后，增加间充质干细胞的产量。本发明采用如下技术方案一种胎盘羊膜源间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤1)用含青霉素、链霉素和肝素钠的PBS缓冲液冲洗胎盘，沿胎盘边缘将胎儿面羊 膜慢慢剥离；2)再次冲洗胎盘源羊膜，将羊膜剪成l_5mm3小块；3)将羊膜组织块用含青霉素和链霉素的DMEM培养基混勻，在850g条件下离心 IOmin ；4)弃上清，每管加含体积比0. 25 %胰蛋白酶的DMEM培养基于37°C消化IOmin，在850g条件下离心IOmin ；5)弃上清，每管加完全培养基后，在2200rpm条件下离心IOmin ；所述完全培养基 为含体积比10%的胎牛血清+100kU/L青霉素+100mg/L链霉素的DMEM培养基；6)弃上清，羊膜组织块接种于培养皿中，加完全培养基，在培养箱培养；每3天进 行半量换液；7)至10-12天有细胞贴壁生长，细胞克隆形成后，弃掉组织块，加完全培养基进行
培养；8)至15-17天细胞克隆融合至80-90%，进行细胞传代。
图1 羊膜源间充质干细胞原代细胞图2 羊膜源间充质干细胞P1、P2代图3 羊膜源间充质干细胞流式细胞仪检测结果技术效果1、选择用胎盘中的羊膜来制备间充质干细胞。羊膜中含有较多的间充质干细胞， 且质薄，取材简便易行，剪切省时省力；2、羊膜剪切成小块后用消化酶消化时，需酶量非常少，消化时间短；3、接种时组织量少，所需耗材少，占用空间少；4、整个程序操作简单，将制备过程由传统的5-6小时缩短至40分钟即可完成。5、所获取的间充质干细胞产量大，细胞生物学特征同常规制备方法无明显差异。
具体实施例方式胎盘羊膜源间充质干细胞的制备1.用含 100kU/L 青霉素 +100mg/L 链霉素 +2U/ml 肝素钠 Ofeparin Sodium,青岛 康原药业(集团)有限公司)的PBS缓冲液冲洗胎盘，沿胎盘边缘将胎儿面羊膜慢慢剥 离。所述的青霉素/链霉素溶液购自美国ScienCell公司，P/S (Penicillin/Sti^ptomycin Solution)ο2.再次冲洗胎盘源羊膜，将羊膜剪成l_5mm3小块。3.将羊膜组织块用含100kU/L青霉素及100mg/L链霉素的DMEM培养基混勻，在 850g条件下离心lOmin。4.弃上清，每管加消化液(含体积比0.25%胰蛋白酶的DMEM培养基)于37°C消 化lOmin，在850g条件下离心IOmin05.弃上清，每管加完全培养基(含体积比10%的FBS (胎牛血清)+100kU/L青霉 素+100mg/L链霉素的DMEM培养基)后，在2200rpm条件下离心IOmin。6.弃上清，羊膜组织块接种于培养皿中，加完全培养基，在37°C、5% CO2的培养箱 培养。每3天进行半量换液(弃一半培养基再加入等体积新培养基)。7.至10天左右可见细胞贴壁生长，细胞克隆形成后，弃掉组织块，加完全培养基 进行培养。8.至15天左右细胞克隆融合至80-90%，进行细胞传代。传代培养后，24h (小时)即可贴壁，细胞呈较均一的长梭形，3d (天)左右细胞可铺满整个培养瓶底面，可继续传代 扩增。传代后的细胞形态无明显变化，性质稳定。羊膜源间充质干细胞原代细胞以及P1、 P2代细胞(如图1、图2)。 9.细胞培养到第3代进行流式细胞仪鉴定。以FITC标记的⑶45、⑶90及HLA-DR， PE 标记的 CD105、CD34、CD146 (BD-Pharmigen 公司，美国)进行流式细胞仪(Fascalibur，BD 公司，美国)检测。结果显示，高表达⑶90、⑶105、⑶146，不表达⑶45、⑶34及HLA-DR(如 图3)。
权利要求
一种羊膜源胎盘间充质干细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)用含青霉素、链霉素和肝素钠的PBS缓冲液冲洗胎盘，沿胎盘边缘将胎儿面羊膜慢慢剥离；2)再次冲洗胎盘源羊膜，将羊膜剪成1 5mm3小块；3)将羊膜组织块用含青霉素和链霉素的DMEM培养基混匀，在850g条件下离心10min；4)弃上清，每管加含体积比0.25％胰蛋白酶的DMEM培养基于37℃消化10min，在850g条件下离心10min；5)弃上清，每管加完全培养基后，在2200rpm条件下离心10min；所述完全培养基为含体积比10％的胎牛血清+100kU/L青霉素+100mg/L链霉素的DMEM培养基；6)弃上清，羊膜组织块接种于培养皿中，加完全培养基，在培养箱培养；每3天进行半量换液；7)至10 12天有细胞贴壁生长，细胞克隆形成后，弃掉组织块，加完全培养基进行培养；8)至15 17天细胞克隆融合至80 90％，进行细胞传代。
全文摘要
本发明涉及一种胎盘间充质干细胞的制备方法。该方法将制备过程程序化，简化操作步骤，缩短操作时间，减少工作量，从而也可在很大程度上避免污染，减少制备过程所需试剂和耗材，并且在做到以上所述之后，增加间充质干细胞的产量。
文档编号C12N5/0735GK101921728SQ20101024639
公开日2010年12月22日 申请日期2010年8月6日 优先权日2010年8月6日
发明者张学峰, 张美荣, 王丽, 胡建霞, 高宏, 魏斯溧 申请人:青岛奥克生物开发有限公司