专利名称：提高纤维素酶水解木质纤维素的萃取方法
技术领域：
本发明涉及一种生化技术领域的萃取方法，具体是一种提高纤维素酶水解木质纤 维素的萃取方法。
背景技术：
利用生物质制备生物能源(乙醇、丁醇等)等的基本工艺过程为生物质的预处理、 预处理后木质纤维素的酶水解、酶水解液中葡萄糖的发酵、和发酵液中产品的分离与纯化 等四个步骤，其中预处理生物质和木质纤维素的酶解是制约其工业化成本的关键。生物质 预处理技术直接影响着下一步酶解木质纤维素中木质素的含量，现有技术去除木质纤维素 中的木质素存在资源耗费大、环境污染严重、成本高等缺点。一般地，酶解工艺是直接水解 含有木质素的木质纤维素以降低整个工艺的成本。酶解木质纤维素的纤维素酶是一种复合酶，包括了内切纤维素酶、外切纤维素酶 和葡萄糖苷酶等多种组分，而且纤维素酶与纤维素的反应是固相反应，很难采用常规的固 定化酶技术回收酶组分。酶原料的消耗成为整个生物能源工业高成本的主要瓶颈之一。木质素在酶解木质纤维素的过程中降低了纤维素酶的效率，经对现有技术 文献的检索发现，《Zhilong Wang, Hao Feng, Fractal kinetic analysis of the enzymatic saccharificationof cellulose under different conditions. Biorecourse technology. 2010，101 :7995_8000》(王志龙，冯浩，“分形动力学解析不同条件下酶法糖化 纤维素”，《生物资源技术》)报道，添加多聚物或非离子表面活性剂可以提高纤维素酶水解 木质纤维素的水解效率。但添加多聚物或非离子表面活性剂同时也增加了添加物本身的成 本、酶解液中添加物分离成本以及水解葡萄糖液中残留添加物对下一步糖发酵的影响以及 纤维素酶的回收利用、水解木质纤维素后木质素的综合利用等问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种提高纤维素酶水解木质纤维 素的萃取方法。本发明在酶解木质纤维素的过程中添加可以相分离的多聚物或非离子表面 活性剂以选择性地萃取木质素而提高纤维素酶水解木质纤维素的效率，进一步相分离实现 添加物多聚物或非离子表面活性剂的回收与重复利用，并获得副产物木质素；同时水解的 葡萄糖溶液可为下一步糖发酵工艺直接利用。本发明是通过以下技术方案实现的本发明包括如下步骤步骤一，添加非离子表面活性剂或多聚物，在纤维素酶的催化下进行木质纤维素 的水解；步骤二，酶法水解后添加新鲜的木质纤维素吸附纤维素酶，并静置水解液分离纤 维素和纤维素酶；步骤三，分离的纤维素酶和纤维素在添加新鲜的多聚物或非离子表面活性剂的条件下重新进行酶催化的水解反应而实现纤维素酶的重复利用；步骤四，静置水解液分离纤维素和纤维素酶后，其上清液通过加热升温后实现相 分离，获得富含葡萄糖的上清液直接进行酒精发酵；步骤五，静置水解液分离纤维素和纤维素酶后，其上清液加热升温后相分离获得 的富含多聚物或非离子表面活性剂相，加酸调节PH至酸性沉淀分离木质素；步骤六，富含多聚物或非离子表面活性剂相加酸调节pH至酸性沉淀分离木质素 后，上清液通过蒸发至干、加有机溶剂(如乙醇)重新溶解，再蒸发回收多聚物或非离子表 面活性剂。步骤一中所述的多聚物为聚氧乙烯醇类多聚物、聚氧丙烯醇类多聚物、和聚氧乙 烯醇与聚氧丙烯醇共聚合物。步骤一中所述的非离子表面活性剂为山梨醇类非离子表面活性剂、脂肪醇聚氧 乙烯醚类非离子表面活性剂、Triton X系列非离子表面活性剂、Tergitol类非离子表面活 性剂中的一种。步骤一中所述的添加非离子表面活性剂或多聚物后，能选择性萃取水解过程中所 产生的副产物木质素而新添加的木质纤维素和纤维素酶富集于沉淀相。步骤三中所述的纤维素酶和纤维素沉淀相能重复利用水解生产葡萄糖。步骤四中所述的静置水解液分离纤维素和纤维素酶后，其上清液通过加热升温后 实现相分离，获得富含葡萄糖的上清液中多聚物或非离子表面活性剂不抑制酒精发酵微生 物的生长而可以直接进行酒精发酵。步骤五中所述的静置水解液分离纤维素和纤维素酶后，其上清液加热升温产生相 分离获得的富含多聚物或非离子表面活性剂的相加酸调节PH < 2后可沉淀分离木质素。步骤六中所述的富含多聚物或非离子表面活性剂相加酸调节pH至酸性沉淀分离 木质素后，蒸发至干后加有机溶剂重新溶解，溶解的有机溶液相经蒸发回收的多聚物或非 离子表面活性剂重复利用于酶法水解木质纤维素。本发明涉及纤维素酶Accellerase 1500可通过公开市售的商业渠道得到，例如 Genencor公司的销售产品。木质纤维素为可通过公开市售的商业渠道得到的木质素(上海 试剂公司)和纤维素Avicel PH IOl(Sigma)的混合物或者稀酸预处理玉米秸秆得到的木 质纤维素。多聚物为聚氧乙烯醇(如市售的商业渠道得到PEG 4000,PEG 10000等)、聚氧 丙烯醇(如市售的商业渠道得到PPG 2000等；共多聚物L61、L62、L64(浙江皇马化学品公 司)、F68(Sigma))。非离子表面活性剂为(山梨醇类(如span 20,Tween 80 (上海试剂公 司)；脂肪醇聚氧乙烯醚类(Brij 30、Bri j92v (Fluka) ；Triton X 系列(如 Triton X-45， Triton X-114, Triton X-IOO(Fluka) ；Teritgol 系列(如 Tergitol TMN-3 (Fulka))等。本发明利用纤维素酶的生物催化功能将木质纤维素的葡萄糖苷转化为葡萄糖和 副产物木质素。本发明具有如下的有益效果本发明采用添加非离子表面活性剂或多聚物，通过 筛选获得了高产物葡萄糖浓度的共多聚物L64，选择性地萃取酶水解木质纤维素过程中产 生的副产物木质素强化了酶法水解木质纤维素的效率。一方面，添加共聚合物L64水解木 质纤维素得到葡萄糖水解液后通过在水解体系中添加新鲜的木质纤维素重新吸附纤维素 酶可以部分回收纤维素酶以进行下一循环的木质纤维素水解。另一方面，采用添加共多聚
4物L64在酶水解木质纤维素后不但实现了选择性地萃取了木质素，而且升高温度后共多聚 物L64和木质素从葡萄糖水解液中实现了相分离。相分离的L64和木质素相在调节pH后 实现了木质素的沉淀，从而得到了副产物木质素。且共聚合物经蒸发、有机溶剂(如乙醇) 重新溶解后通过蒸发可以回收共聚合物L64并循环利用。
图1为本发明流程图；
具体实施例方式以下结合附图对本发明的实施例作详细说明以下实施例在以本发明技术方案为 前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所 建议的条件。如酶法水解木质纤维素的实验条件为pH = 4. 8的柠檬酸缓冲液、反应温度为 50°C在110转/分钟的往复式水浴摇床中进行，产物葡萄糖浓度按标准的3，5- 二硝基水杨 酸比色方法测定。实施例1在纤维素Avicel PH 101添加量为5g/100ml，纤维素酶浓度为2ml/100ml的条件 下按常规条件反应72小时后得到葡萄糖浓度3g/100ml。实施例2在纤维素Avicel PH 101添加量为5g/100ml，木质素添加量为lg/100ml，纤维素 酶浓度为2ml/100ml的条件下按常规条件反应72小时后得到葡萄糖浓度2. 3g/100ml。实施例3在稀酸预处理木质纤维素添加量为5g/100ml，纤维素酶浓度为2ml/100ml的条件 下按常规条件反应72小时后得到葡萄糖浓度1. 3g/100ml。实施例4在纤维素Avicel PH 101添加量为5g/100ml，木质素添加量为lg/100ml，添加多 聚物PEG 4000浓度为2g/100ml，纤维素酶浓度为2ml/100ml的条件下按常规条件反应72 小时后得到葡萄糖浓度3. 3g/100ml。实施例5在稀酸预处理木质纤维素添加量为5g/100ml，添加多聚物PEG 4000浓度为 2g/100ml，纤维素酶浓度为2ml/100ml的条件下按常规条件反应72小时后得到葡萄糖浓度 1.9g/100ml。实施例6在纤维素Avicel PH 101添加量为5g/100ml，木质素添加量为lg/100ml，添加多 聚物PEG 10000浓度为2g/100ml，纤维素酶浓度为2ml/100ml的条件下按常规条件反应72 小时后得到葡萄糖浓度3. 4g/100ml。实施例7在纤维素Avicel PH 101添加量为5g/100ml，木质素添加量为lg/100ml，添加多
5聚物PPG 2000浓度为2g/100ml，纤维素酶浓度为2ml/100ml的条件下按常规条件反应72 小时后得到葡萄糖浓度2. 6g/100ml。实施例8在纤维素Avicel PH 101添加量为5g/100ml，木质素添加量为lg/100ml，添加共 多聚物L61浓度为2g/100ml，纤维素酶浓度为2ml/100ml的条件下按常规条件反应72小时 后得到葡萄糖浓度2. 8g/100ml。实施例9在纤维素Avicel PH 101添加量为5g/100ml，木质素添加量为lg/100ml，添加共 多聚物L62浓度为2g/100ml，纤维素酶浓度为2ml/100ml的条件下按常规条件反应72小时 后得到葡萄糖浓度2. 7g/100ml。实施例10在纤维素Avicel PH 101添加量为5g/100ml，木质素添加量为lg/100ml，添加共 多聚物L64浓度为2g/100ml，纤维素酶浓度为2ml/100ml的条件下按常规条件反应72小时 后得到葡萄糖浓度3. 3g/100ml。实施例11在纤维素Avicel PH 101添加量为5g/100ml，木质素添加量为lg/100ml，添加共 多聚物F68浓度为2g/100ml，纤维素酶浓度为2ml/100ml的条件下按常规条件反应72小时 后得到葡萄糖浓度3. 5g/100ml。实施例12在纤维素Avicel PH 101添加量为5g/100ml，木质素添加量为lg/100ml，添加非 离子表面活性剂Span 20浓度为2g/100ml，纤维素酶浓度为2ml/100ml的条件下按常规条 件反应72小时后得到葡萄糖浓度2. 2g/100ml。实施例13在纤维素Avicel PH 101添加量为5g/100ml，木质素添加量为lg/100ml，添加非 离子表面活性剂Tween 80浓度为2g/100ml，纤维素酶浓度为2ml/100ml的条件下按常规条 件反应72小时后得到葡萄糖浓度3g/100ml。实施例14在纤维素Avicel PH 101添加量为5g/100ml，木质素添加量为lg/100ml，添加非 离子表面活性剂Brij 30浓度为2g/100ml，纤维素酶浓度为2ml/100ml的条件下按常规条 件反应72小时后得到葡萄糖浓度2. 7g/100ml。实施例15在纤维素Avicel PH 101添加量为5g/100ml，木质素添加量为lg/100ml，添加非 离子表面活性剂Brij 92v浓度为2g/100ml，纤维素酶浓度为2ml/100ml的条件下按常规条 件反应72小时后得到葡萄糖浓度3. 2g/100ml。实施例16在纤维素Avicel PH 101添加量为5g/100ml，木质素添加量为lg/100ml，添加非 离子表面活性剂Triton X-45浓度为2g/100ml，纤维素酶浓度为2ml/100ml的条件下按常 规条件反应72小时后得到葡萄糖浓度2. 8g/100ml。实施例17
在纤维素Avicel PH 101添加量为5g/100ml，木质素添加量为lg/100ml，添加非 离子表面活性剂Triton 乂_114浓度为28/1001111，纤维素酶浓度为21111/1001111的条件下按常 规条件反应72小时后得到葡萄糖浓度3g/100ml。实施例18在纤维素Avicel PH 101添加量为5g/100ml，木质素添加量为lg/100ml，添加非 离子表面活性剂Triton X-100浓度为2g/100ml，纤维素酶浓度为2ml/100ml的条件下按常 规条件反应72小时后得到葡萄糖浓度3. 3g/100ml。实施例19在纤维素Avicel PH 101添加量为5g/100ml，木质素添加量为lg/100ml，添加非 离子表面活性剂Tergitol TMN-3浓度为2g/100ml，纤维素酶浓度为2ml/100ml的条件下按 常规条件反应72小时后得到葡萄糖浓度2. 6g/100ml。实施例21在纤维素Avicel PH 101添加量为5g/100ml，木质素添加量为lg/100ml，添加共 多聚物L64浓度为2g/100ml，纤维素酶浓度为2ml/100ml的条件下按常规条件反应72小 时后得到葡萄糖浓度3. 5g/100ml。加入纤维素Avicel PH 101添加量为5g/100ml和木质 素添加量为lg/100ml吸附纤维素酶，混合均勻后静置2小时。移去上清液，在残留的木质 纤维素和纤维素酶中加入共多聚物L64浓度为2g/100ml的pH = 4. 8的柠檬酸缓冲液反应 72小时后得到葡萄糖浓度3. 9g/100ml实施例22在纤维素Avicel PH 101添加量为5g/100ml，木质素添加量为lg/100ml，添加共 多聚物L64浓度为2g/100ml，纤维素酶浓度为2ml/100ml的条件下按常规条件反应72小时 后得到葡萄糖浓度3. 5g/100ml。加入纤维素Avicel PH 101添加量为5g/100ml和木质素 添加量为lg/100ml吸附纤维素，混合均勻后静置2小时。转移上清液至另一试管，在恒温 水浴中加热至70°C后静置3小时。上清液发生相分离，一相为富含葡萄糖的溶液相，另一相 为富含共多聚物L64和木质素混合悬浮液相。富含葡萄糖的溶液相对酒精发酵菌面包酵母 没有明显毒性，可以直接用于乙醇发酵。实施例22在纤维素Avicel PH 101添加量为5g/100ml，木质素添加量为lg/100ml，添加共 多聚物L64浓度为2g/100ml，纤维素酶浓度为2ml/100ml的条件下按常规条件反应72小时 后得到葡萄糖浓度3. 5g/100ml。加入纤维素Avicel PH 101添加量为5g/100ml和木质素 添加量为lg/100ml吸附纤维素，混合均勻后静置2小时。转移上清液至另一试管，在恒温 水浴中加热至70°C后静置3小时。上清液发生相分离，一相为富含葡萄糖的溶液相，另一相 为富含共多聚物L64和木质素混合悬浮液相。富含共多聚物L64和木质素的混合悬浮液相 用2M浓度硫酸溶液调节pH < 2后静置12小时后沉淀出木质素后溶液颜色变透明。回收 沉淀洗涤后得到副产物木质素0. Sg。实施例23在纤维素Avicel PH 101添加量为5g/100ml，木质素添加量为lg/100ml，添加共 多聚物L64浓度为2g/100ml，纤维素酶浓度为2ml/100ml的条件下按常规条件反应72小 时后得到葡萄糖浓度3. 5g/100ml。加入纤维素Avicel PH 101添加量为5g/100ml和木质素添加量为lg/100ml吸附纤维素，混合均勻后静置2小时。转移上清液至另一试管，在恒 温水浴中加热至70°C后静置3小时。上清液发生相分离，一相为富含葡萄糖的溶液相，另 一相为富含共多聚物L64和木质素混合悬浮液相。富含共多聚物L64和木质素混合悬浮液 相用2M浓度硫酸溶液调节pH < 2后静置12小时后沉淀出木质素后溶液颜色变透明。离 心去除木质素后，上清液直接蒸发至干后加入等体积的乙醇重新溶解。溶解后的乙醇相在 100°C条件下蒸发得到L641. 94g。实施例24在纤维素Avicel PH 101添加量为5g/100ml，木质素添加量为lg/100ml，添加共 多聚物L64浓度为2g/100ml，纤维素酶浓度为2ml/100ml的条件下按常规条件反应72小 时后得到葡萄糖浓度3. 5g/100ml。加入纤维素Avicel PH 101添加量为5g/100ml和木质 素添加量为lg/100ml吸附纤维素，混合均勻后静置2小时。转移上清液至另一试管，在恒 温水浴中加热至700C后静置3小时。上清液发生相分离，一相为富含葡萄糖的溶液相，另 一相为富含共多聚物L64和木质素混合悬浮液相。富含共多聚物L64和木质素混合悬浮液 相用2M浓度硫酸溶液调节pH < 2后静置12小时后沉淀出木质素后溶液颜色变透明。离 心去除木质素后，上清液蒸发至干，加入等体积的乙醇重新溶解。上清乙醇相蒸发得到L64 1.94g。在纤维素Avicel PH 101添加量为5g/100ml，木质素添加量为lg/100ml，添加回收 的1. 94g L64，纤维素酶浓度为2ml/100ml的条件下按常规条件反应72小时后得到葡萄糖 浓度 3. 2g/100ml。
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权利要求
一种提高纤维素酶水解木质纤维素的萃取方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，添加非离子表面活性剂或多聚物，在纤维素酶的催化下进行木质纤维素的水解；步骤二，酶法水解后添加新鲜的木质纤维素吸附纤维素酶，并静置水解液分离纤维素和纤维素酶；步骤三，分离的纤维素酶和纤维素在添加新鲜的多聚物或非离子表面活性剂的条件下重新进行酶催化的水解反应而实现纤维素酶的重复利用；步骤四，静置水解液分离纤维素和纤维素酶后，其上清液通过加热升温后实现相分离，获得富含葡萄糖的上清液直接进行酒精发酵；步骤五，静置水解液分离纤维素和纤维素酶后，其上清液加热升温后相分离获得的富含多聚物或非离子表面活性剂相，加酸调节pH至酸性沉淀分离木质素；步骤六，富含多聚物或非离子表面活性剂相加酸调节pH至酸性沉淀分离木质素后，上清液通过蒸发至干、加有机溶剂重新溶解，再蒸发回收多聚物或非离子表面活性剂。
2.根据权利要求1所述的提高纤维素酶水解木质纤维素的萃取方法，其特征是，步骤 一中所述的多聚物为聚氧乙烯醇类多聚物、聚氧丙烯醇类多聚物、和聚氧乙烯醇与聚氧丙 烯醇共聚合物。
3.根据权利要求1所述的提高纤维素酶水解木质纤维素的萃取方法，其特征是，步骤 一中所述的非离子表面活性剂为山梨醇类非离子表面活性剂、脂肪醇聚氧乙烯醚类非离 子表面活性剂、Triton X系列非离子表面活性剂、Tergitol类非离子表面活性剂中的一种。
4.根据权利要求1所述的提高纤维素酶水解木质纤维素的萃取方法，其特征是，步骤 一中所述的添加非离子表面活性剂或多聚物后，能选择性萃取水解过程中所产生的副产物 木质素而新添加的木质纤维素和纤维素酶富集于沉淀相。
5.根据权利要求1所述的提高纤维素酶水解木质纤维素的萃取方法，其特征是，步骤 三中所述的纤维素酶和纤维素沉淀相能重复利用水解生产葡萄糖。
6.根据权利要求1所述的提高纤维素酶水解木质纤维素的萃取方法，其特征是，步骤 四中所述的静置水解液分离纤维素和纤维素酶后，其上清液通过加热升温后实现相分离， 获得富含葡萄糖的上清液中多聚物或非离子表面活性剂不抑制酒精发酵微生物的生长而 可以直接进行酒精发酵。
7.根据权利要求1所述的提高纤维素酶水解木质纤维素的萃取方法，其特征是，步骤 五中所述的静置水解液分离纤维素和纤维素酶后，其上清液加热升温产生相分离获得的富 含多聚物或非离子表面活性剂的相加酸调节PH < 2后可沉淀分离木质素。
8.根据权利要求1所述的提高纤维素酶水解木质纤维素的萃取方法，其特征是，步骤 六中所述的富含多聚物或非离子表面活性剂相加酸调节PH至酸性沉淀分离木质素后，蒸 发至干后加有机溶剂重新溶解，溶解的有机溶液相经蒸发回收的多聚物或非离子表面活性 剂重复利用于酶法水解木质纤维素。
9.根据权利要求1或者8所述的提高纤维素酶水解木质纤维素的萃取方法，其特征是， 所述的有机溶剂为乙醇。
全文摘要
一种生化技术领域的提高纤维素酶水解木质纤维素的萃取方法。本发明在酶解木质纤维素的过程中添加可以相分离的多聚物或非离子表面活性剂以选择性地萃取木质素而提高纤维素酶水解木质纤维素的效率，进一步相分离实现添加物多聚物或非离子表面活性剂的回收与重复利用，并获得副产物木质素；同时水解的葡萄糖溶液可为下一步糖发酵工艺直接利用。本发明实现了木质素的沉淀，得到了副产物木质素；且回收共聚合物L64并循环利用，回收纤维素酶以进行下一循环的木质纤维素水解。
文档编号C12P19/14GK101906450SQ201010246238
公开日2010年12月8日 申请日期2010年8月6日 优先权日2010年8月6日
发明者王志龙 申请人:上海交通大学