来自胎盘组织的粘附细胞及其在治疗中的用图
【专利说明】来自胎盘组织的粘附细胞及其在治疗中的用途
[0001] 本申请是2010年7月1日提交的题为"长效凝固因子及产生其的方法"的中国专利 申请201080040296. X的分案申请。
[0002] 相关申请
[0003] 本申请要求2009年1月23日提交的临时专利申请61/202，050和2008年9月2日提交 的临时专利申请61 /136，375的优先权的益处。
[0004] 所有以上文献的内容通过引用并入，如同在本文中完整呈现。
[0005] 发明领域和背景
[0006] 在本发明的一些实施方式中，本发明涉及胎盘组织的粘附细胞，更具体而言但不 排除其它的，本发明涉及培养胎盘组织的粘附细胞和将其用于治疗的方法。
[0007] 近些年以来，相当多的工作集中于间充质基质细胞(MSC)在多个医学应用包括受 损器官例如脑、心脏、骨和肝脏的组织修复以及在支持骨髓移植(BMT)中的治疗潜力。MSC是 获自例如骨髓、脂肪组织、胎盘和血液的异质细胞群体，其能够分化为不同类型的细胞(例 如网状内皮细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、骨生成性祖细胞），这取决于来自多个生物活性因 子的影响。因此，在再生医学中已经广泛研究了 MSC，作为建立新组织例如骨、软骨和脂肪的 基础，以修复损伤或替换病理性组织并作为遗传性和获得性疾病的治疗[Fibbe和Noort， Ann N Y Acad Sci(2003)996:235-44;Horwitz等人，Cytotherapy(2005)7(5):393-5; 21_6七和他代，8&8化1^8031(1丨01(2005)100(6):471-81]。此外，]\^(：的多潜能的能力、其 易于分离和培养以及其高度的离体扩增潜力，使其成为吸引人的治疗工具[Fibbe和Noort， 见上;Minguell等人Exp Biol Med(Maywood)(2001 )226(6):507-20]。
[0008] 越来越多的数据表明MSC逃脱同种异体反应性细胞的识别并被认为具有免疫豁免 特权（immune-privileged) [Le Blanc等人，Exp Hematol (2003)31 (10): 890-6]。由于具有 低免疫原性，所以MSC不被患者的免疫系统排斥，因此被认为不需要HLA匹配。
[0009] 源自胎盘的MSC显示出具有与分离自其它组织的MSC的很多共同的标志物，例如 CD105、CD73、⑶90和⑶29，并且显示出缺乏造血、内皮和滋养层特异性细胞标志物的表达。 在适当的条件下培养源自胎盘的MSC之后，实现了脂肪生成性、骨生成性和神经生成性分化 [Yen等人，Stem Cells(2005)23(l):3-9]。此外，已经证明分离自胎盘并在体外培养的MSC 具有类似于MSC的免疫豁免特权[Li等人，Ce 11 Res (2005) 15 (7): 539-47 ]。因此，胎盘提供 了伦理上无争议的和容易获得的MSC来源，以用于实验和临床应用[Zhang等人，Exp Hematol(2004)32(7):657-64]。另外，本发明人以前发明了适合于扩增源自胎盘的MSC的三 维（3D)培养条件(W0/2007/108003)。
[0010] 发明概述
[0011] 根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了培养来自胎盘或脂肪组织的粘附 细胞的方法，所述方法包括在允许细胞扩增的三维(3D)培养条件下培养来自胎盘或脂肪组 织的粘附细胞，所述条件包括灌注。
[0012] 根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了根据以上方法产生的细胞的群 体。
[0013] 根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了包含基本上如本文描述的基因表 达模式的细胞的群体。
[0014] 根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了细胞群体在制备鉴定为用于治疗 可以从细胞或器官移植中获益的病况的药物中的用途。
[0015] 根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了在有此需要的受试者中诱导耐受 和/或免疫抑制的方法，所述方法包括向所述受试者给予治疗上有效量的粘附细胞，从而在 所述受试者中诱导耐受和/或免疫抑制。
[0016] 根据本发明的一些实施方式，根据培养基的葡萄糖浓度调整灌注。
[0017] 根据本发明的一些实施方式，将培养基维持在大约550mg/L的葡萄糖浓度。
[0018]根据本发明的一些实施方式，所述3D培养条件包括3D生物反应器。
[0019]根据本发明的一些实施方式，所述3D培养条件包含选自玻璃和塑料；聚酯、聚丙 烯、聚苯乙烯、葡聚糖和胶原的粘附材料。
[0020] 根据本发明的一些实施方式，进行所述3D培养条件至少3天。
[0021] 根据本发明的一些实施方式，进行细胞培养直至至少10%的细胞处于增殖中。
[0022] 根据本发明的一些实施方式，至少10%的粘附细胞处于增殖期。
[0023] 根据本发明的一些实施方式，粘附细胞能够抑制免疫反应。
[0024] 根据本发明的一些实施方式，粘附细胞包含选自CD73、CD90、CD29、CD105和D7-fib 的阳性标志物表达。
[0025] 根据本发明的一些实施方式，粘附细胞包含选自⑶11b、⑶34、HLA-DR、⑶14、⑶19、 ⑶45、⑶31、⑶200和KDR的阴性标志物表达。
[0026] 根据本发明的一些实施方式，粘附细胞包含基本上如本文描述的基因表达模式。
[0027] 根据本发明的一些实施方式，与来自骨髓并在相同条件下生长和分化的粘附细胞 相比，所述粘附细胞向骨生成性谱系的定向较差。
[0028] 根据本发明的一些实施方式，与来自骨髓并在相同条件下生长和分化的粘附细胞 相比，所述粘附细胞向脂肪生成性谱系的定向较差。
[0029] 根据本发明的一些实施方式，所述病况选自局部缺血、外周动脉疾病(PAD)、临界 性肢体缺血(critical limb ischemia) (CLI)、下肢远端缺血、缺血性血管疾病、肾脏的血 管疾病、缺血性心脏病、心肌缺血、冠状动脉疾病(CAD)、动脉粥样硬化心血管病、冠状动脉 左总干病、动脉阻塞性疾病、外周缺血、外周血管病、动脉硬化、缺血性脑部疾病、中风、脑缺 血、脑血管疾病、视网膜病、视网膜修复、重塑性病症、希佩尔-林道综合征、遗传性出血性毛 细血管扩张性缺血性血管病、Buerger氏病、缺血性肾病、缺血性胎盘、生殖相关的病症、移 植物抗宿主病、实体器官移植、造血干细胞移植、糖尿病、结缔组织损伤、癌症、癌前、骨癌、 骨肉瘤、骨转移瘤、骨折、烧伤、关节软骨缺损、创伤愈合、深伤、创伤愈合延迟、溃疡愈合延 迟、软骨下骨囊肿、骨质疏松症、骨关节炎、骨退化、软骨损伤、关节软骨缺损、腱受损、自身 免疫疾病、代谢病、牛皮癣、神经痛、外周神经损伤、肾移植的支撑物和炎性疾病。
[0030] 根据本发明的一些实施方式，所述病况选自炎性肠病（IBD)和克罗恩病。
[0031]除非另有指明，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有本发明相关技术领 域普通技术人员通常理解的相同含义。虽然相似于或等同于本文描述的那些的方法和材料 可用于实施或测试本发明的实施方式，但是以下描述了示例性方法和/或材料。在出现冲突 的情况下，以专利说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例仅为解释目的，不是意 在必要性的限制。
【附图说明】
[0032] 仅通过举例的方式，通过参考以下附图，本文描述了本发明的一些实施方式。现在 通过详细地特别参考附图，旨在说明所显示的详细内容仅是举例方式并且是为了解释性讨 论本发明的实施方式的目的。在此意义上，说明书以及附图使本领域技术人员明白可以如 何实施本发明的实施方式。
[0033] 在附图中：
[0034]图1是流程图，其显示了根据本文教导从胎盘产生3D粘附细胞(称作PLX-C细胞）。 [0035] 图2是从The New Brunswick Scientific网站改编而来的示例性的生物反应器的 管和端口的示意图。
[0036] 图3A-B显示了通过Plurix制备的3D粘附细胞(称作PLX，图3B)和通过本文教导制 备的3D粘附细胞(称作PLX-C，图3A)的细胞周期分析。将细胞固定于70 %的EtOH 0. N，离心 并重悬于碘化丙啶(PI)溶液，然后通过FACS分析。
[0037]图4A-D显示:在PLX-C上存在成纤维细胞典型性的标志物的表达，但没有内皮细胞 典型性的标志物的表达。图4A显示了内皮细胞标志物⑶31的阴性表达；图4B显示了内皮细 胞标志物KDR的阴性表达；图4C显示了人成纤维细胞标志物(D7-FIB)的阳性表达，其中同种 型IgGl(FITC)的红色柱状图代表阴性对照；蓝色柱状图代表阳性染色的细胞；图4D显示了 人⑶200标志物的阴性表达(同种型IgGl(PE)的粉红色柱状图代表阴性对照;绿色柱状图代 表阳性染色的细胞）。
[0038]图5A-D显示了PLX-C细胞上的刺激性和共刺激分子的表达。图5A显示了PLX-C的 ⑶80的表达；图5B显示了PLX-C的⑶86的表达；图5C显示了PLX-C的⑶40的表达；图显示了 PLX-C的HLA-A/B/C的表达。以相关的同种型荧光分子制备阴性对照。值得注意的是，红色柱 状图代表表达PLX-C标志物的细胞群体，蓝色柱状图代表表达骨髓(BM)标志物的细胞群体， 绿色柱状图代表表达单核细胞(MNC)标志物的细胞群体。
[0039] 图6A-B显示了PLX-C对于淋巴细胞增殖的抑制。图6A显示了以2xl05个源自外周血 (PB)的单核细胞(丽C，供体A)(其经过等量的经辐射的（3000Rad)源自I3B的MNC(供体B)的刺 激，然后向培养物中加入数量渐增的PLX-C细胞)进行的混合淋巴细胞反应(MLR)测试。每组 一式三份接种于96孔平板。通过[ 3H]胸苷掺入测定增殖速率；图6B显示了以ConA(1.5mg/ ml)刺激的源自外周血(PB)的MNC。向培养物中加入数量渐增的PLX-C细胞。每组一式三份接 种于96孔平板。通过[ 3H ]胸苷掺入测定增殖速率。
[0040]图7A-C显示了与外周血细胞共培养之后，PLX-C对于促炎性和抗炎性细胞因子分 泌的调节。图7A-B显示了源自人的MNC(分离自外周血，经过ConA刺激)与PLX-C共培养之后， IFN γ (图7A)和TNFa(图7B)的分泌；图7C显示了源自人的MNC(分离自外周血，经过LPS刺激） 与PLX-C共培养之后，IFNγ、TNFa和IL-10的分泌。收集上清液并通过ELISA分析细胞因子。 [0041]图8A-F是照片，其显示了在骨生成或脂肪生成的分化条件下，骨髓和胎盘细胞的 生长。将源自骨髓的细胞（图8A-C)或源自胎盘的细胞（图8D-F)植板于包被了玻连蛋白 (vitronection)和胶原的24孔板中的生长培养基（图8A和8D)、骨生成分化培养基（图8B和 8E)或脂肪生成分化培养基（图8C和8F)。每3-4天更换培养基。在生长期末尾，按照以下实施 例部分的详细描述将细胞固定、染色并照相。
[0042]图9A-F是照片，其显示了在修改的骨生成或脂肪生成的分化条件下，骨髓和胎盘 细胞的生长。将源自骨髓的细胞（图9A-C)或源自胎盘的细胞（图9D-F)植板于包被了玻连蛋 白和胶原的24孔板中的生长培养基（图9A和9D)、骨生成分化培养基（图9B和9E)或脂肪生成 分化培养基（图9C和9F)。每3-4天更换培养基。在生长期末尾，按照以下实施例部分的详细 描述将细胞固定、染色并照相。
[0043]图10显示了用于感染PLX-C细胞的萤光素酶表达载体。在本文中使用的是来自 OmicsLink的表达载体Lv33。将萤光素酶基因克隆进入0RF。
[0044]图11显示了经感染的PLX-C细胞中萤光素酶的高度表达。以萤光素酶表达载体感 染细胞，在感染后48小时通过IVIS系统显示。值得注意的是:细胞显示出高水平的萤光素酶 表达。
[0045] 图12A-D显示了将2xl06个表达萤光素酶的PLX-C细胞注射进入SCID/Beige小鼠。 一只小鼠通过IM方式注射，一只通过IV方式注射。使用IVIS系统监视经注射的小鼠，以测定 PLX-C的体内生物分布。显示了第1天（图12A)、第4天（图12B)、第6天（图12C)和第22天（图 12D)的IVIS结果。
[0046]本发明的【具体实施方式】的描述
[0047]在本发明的一些【具体实施方式】中，本发明涉及胎盘组织的粘附细胞，更具体而言 但不排除其它的，本发明涉及培养胎盘组织的粘附细胞和将其用于治疗的方法。
[0048]通过参考附图和随附的说明书可以更好地理解本发明的原理和操作。
[0049] 在详细解释本发明的至少一个实施方式之前，应该理解，本发明不是一定要限制 在如以下描述中记载或通过实施例例示的细节上的应用。本发明具有其它实施方式或者可 以以多种方式实施或进行。同样应该理解，本文使用的术语和命名是为了描述的目的，不应 该被认为是限制。
[0050] 在将本发明付诸实施时，本发明人发现:在包括灌注的三维（3D)培养条件下培养 源自胎盘的粘附细胞，产生了大量的具有以下特征的粘附细胞:独特的基因表达模式、能够 抑制免疫应答并且是高度增殖性的。因此，这些胎盘粘附细胞可用于治疗性应用。
[0051] 如下文和随后的实施例部分的实施例1-8所解释，本发明人能够在3D条件下扩增 源自胎盘的粘附细胞。本发明的3D条件包括生物反应器内的细胞培养基的灌注(见实施例 2)。如实施例3所示，本发明的胎盘粘附细胞具有基质干细胞特性，例如，它们表达基质干细 胞的典型性细胞标志物，并且具有免疫抑制特性。此外，这些细胞是高度增殖性的（28%的 细胞处于S和G2/M期)并且在施用之后在体内保持数周(见实施例3和8)，这说明这些细胞可 用于治疗。
[0052]另外，在其2D阶段，本发明的源自胎盘的粘附细胞不分化为骨细胞(实施例4-5)或 脂肪细胞(实施例6-7)，这与骨髓粘附细胞截然相反：当在相同条件下生长时，有高比例(超 过50 % )的骨髓粘附细胞进行分化。
[0053]因此，根据本发明的一个方面，提供了培养来自胎盘或脂肪组织的粘附细胞的方 法，所述方法包括在允许细胞扩增的三维(3D)培养条件下培养来自胎盘或脂肪组织的粘附 细胞，所述条件包括灌注。
[0054] 如本文使用的词语"粘附细胞"是指同质或异质的细胞群体，其是锚定依赖性的， 即需要附着至表面以在体外生长。
[0055] 如本文使用的词语"脂肪组织"是指包括脂肪细胞(脂细胞)的结缔组织。
[0056] 如本文使用的术语"胎盘组织"是指哺乳动物器官的任何部分，其沿着子宫壁并且 在妊娠过程中包被胎儿，与胎儿通过脐带连接。出生之后，胎盘被排出（其被称作产后胎 盘）。在示例性的实施方式中，胎盘是指整个胎盘。
[0057]根据本文的教导，使用三维(3D)培养条件繁殖源自胎盘或脂肪组织的粘附细胞。
[0058]如本文使用的词语"三维培养物"是指这样的培养物:其中细胞被置于与细胞生长 相容的条件下，所述条件包括支架，该支架允许细胞与细胞的三维接触。熟知的是，活的生 物体(或组织）中的细胞的原位环境是在三维架构中。细胞被其它细胞所环绕。它们被保持 在细胞外基质纳米级纤维的复杂网络中，这允许建立多个局部微环境。它们的细胞外配体 不仅介导与基底膜的连接，而且介导通向多个血管和淋巴管。氧气、激素和营养物被运送至 细胞;废物被排出。本发明的三维培养物的条件被设计为模拟此环境，如以下进一步所例 不。
[0059]将认识到，三维培养物的条件是能够扩增粘附细胞。
[0000]如本文使用的术语"扩增（expanding)"和"扩增（expans ion)"是指基本上无分化 的细胞维持和最终的(ultimately)细胞生长，即细胞群体的增长(例如至少2倍），此增长不 伴随分化。
[0061 ] 如本文使用的术语"维持(maintaining)"和"维持(maintenance)"是指基本上无 分化的细胞更新，即基本上稳态的细胞群体，此稳态不伴随分化。
[0062] 如上所述，本发明的这个方面的粘附细胞获自胎盘或脂肪组织。
[0063] 胎盘细胞可以获自足月的或不足月的胎盘。优选地，在胎盘完成出血（ex blooded)之