后立即收集胎盘。优选地，将胎盘灌注足够的时间以除掉残余细胞(例如血液）。 [00 64]如本文使用的术语"灌注(perfuse)"或"灌注(perfusion)"是指将流体倾倒在胎 盘上或使流体流经胎盘的操作，或者在本方法的后期，将流体倾倒在培养的细胞上或使流 体流经培养的细胞的操作。胎盘组织可以来自任意哺乳动物；例如，胎盘组织是人胎盘组 织。胎盘组织的方便的来源是产后胎盘(例如1-6小时），但是，胎盘组织或细胞的来源或胎 盘组织的分离方法对本发明而言不是关键性的。
[0065] 源自胎盘的粘附细胞可以获自胎盘的胎儿部分(即胎盘的羊膜、绒毛膜、绒毛膜绒 毛或内部部分，见实施例1)和母体部分（即基蜕膜和壁蜕膜）。将组织样本在生理缓冲液[例 如，磷酸盐缓冲的盐水(PBS)或Hank缓冲液]中清洗。通过以消化酶(见下文)处理组织或/和 通过粉碎并经由尼龙滤器冲洗组织部分或通过以清洗介质轻轻吸液（Fal con ,Becton， Dickinson，San Jose ,CA)来制备单细胞悬浮液。
[0066] 将认识到，可以从脂肪组织获得粘附细胞。可以通过本领域技术人员已知的多种 方法分离源自脂肪组织的粘附细胞。例如，此类方法描述于美国专利号6,153,432。脂肪组 织可以源自网膜/内脏的、乳腺的、性腺的或其它的脂肪组织位点。脂肪组织的一个来源是 网膜的脂肪。在人类中，通常通过抽脂术分离脂肪。
[0067] 来自胎盘或脂肪组织的分离的粘附细胞可以这样获得:使用消化酶例如胶原酶、 胰蛋白酶和/或分散酶、和/或有效浓度的透明质酸酶或DNA酶、和乙二胺四乙酸(EDTA)处理 组织，温度为25-50°C，处理时间为10分钟至3小时。然后可以使细胞通过20微米至1毫米的 尼龙或粗棉布网滤器。在4_50°C的温度，100-3000X g的速度将细胞离心1分钟至1小时（见 美国专利号7,078,230)。
[0068]从胎盘或脂肪组织中获取细胞优选在无菌条件下进行。一旦获得分离的细胞，允 许其粘附至粘附材料(例如配置为表面)从而分离粘附细胞。
[0069] 如本文使用的"粘附材料"是指合成的、天然存在的无细胞毒性(例如生物相容性） 材料或其组合，所述材料具有可以将细胞保持在表面上的化学结构（例如带电的表面暴露 的基团）。
[0070] 可用于本发明的此方面的粘附材料的实例包括但不限于，聚酯、聚丙烯、聚烯烃、 聚氯氟乙烯、聚氯乙稀、聚苯乙烯、聚砜、醋酸纤维素、玻璃纤维、陶瓷颗粒、基质胶、细胞外 基质成分(例如，纤连蛋白、玻连蛋白、软骨粘连蛋白、层粘连蛋白）、胶原、聚L型乳酸、葡聚 糖和惰性金属纤维。
[0071] 纯化或富集基质干细胞的其它步骤可以通过本领域熟知的方法进行(例如使用基 质干细胞标志物表达通过FACS进行，如下文进一步描述）。
[0072]可用于根据本发明的培养的基础培养基的非限制性实例包括：最简必需Eagle培 养基、ADC-I、LPM(不含牛血清白蛋白）、F10(HAM)、F12(HAM)、DCCM1、DCCM2、RPMI 1640、BGJ 培养基(经过和不经过Fitton-Jackson改良）、基础Eagle培养基（添加 Eagle的盐基（salt base)的BME)、Dulbecco改良的Eagle培养基（无血清的DMEM)、Yamane、IMEM-20、Glasgow改 良的Eagle培养基（GMEM)、LeibovitzL-15培养基、McCoy氏5A培养基、培养基M199(具有 Eagle的盐基的M199E)、培养基M199(具有Hank的盐基的M199H)、最简必需Eagle培养基（具 有Eagle的盐基的MEM-E)、最简必需Eagle培养基（具有Hank的盐基的MEM-H)和最简必需 Eagle培养基（具有非必需氨基酸的MEM-NAA)，以及很多其它的，包括培养基199、CMRL 1415、CMRL 1969、CMRL 1066、NCTC 135、MB 75261、MAB 8713、DM 145、Williams氏G、 Neuman&Tytell、Higuchi、MCDB 301、MCDB 202、MCDB 501、MCDB 401、MCDB 411、MDBC 153。 用于本发明的优选培养基是DMEM。这些和其它的有用的培养基可以从GIB⑶，Grand Island，N.Y. ,USA和Biological Industries ,Bet HaEmek, Israel等获得。很多这些培养基 总结于 Methods in Enzymology, Volume LVIII, ^Cell Culture",第62 72 页,William B.Jakoby和Ira H.Pastan编，Academic Press, Inc出版。
[0073] 培养基中可以补充例如血清，例如牛或人或其它物种的胎儿血清，以及任选或可 替代地，补充生长因子、维生素（例如抗坏血酸）、细胞因子、盐(例如B-甘油磷酸盐）、甾类 (例如地塞米松)和激素，例如生长激素、红细胞生成素、血小板生成素、白细胞介素3、白细 胞介素6、白细胞介素7、巨噬细胞集落刺激因子、c-kit配体/干细胞因子、护骨蛋白配体、胰 岛素、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、睫状神经营 养因子、血小板衍生的生长因子和骨形态发生蛋白，它们的浓度为pg/ml至mg/ml的水平。
[0074] 进一步认识到，可以向培养基中添加另外的成分。此类成分可以是抗生素、抗真菌 剂、白蛋白、氨基酸和本领域已知用于细胞培养的其它成分。另外，当需要时，可以添加增强 分化过程的成分(进一步参见下文）。
[0075]如上所述，一旦获得了粘附细胞，可以使其传代至二维或三维环境(见以下的实施 例部分的实施例1和2)。但是将认识到，虽然可以在分离后立即将细胞转移至3D配置的基 质，但可替代地也可以在二维(2D)条件之后将其传代至三维环境(如上文所述）。
[0076]将认识到，在2D培养条件下，粘附细胞可以持续传代。根据本发明的实施方式，细 胞可以传代至少4次，至少5次，至少6次，至少7次，或至少8次。将认识到，通常是当培养物达 到大约70%-90%的汇合度时，通常为3-7天(例如3-5天，加倍1-3次)之后，将细胞传代。此 外，在2D培养条件下，细胞从至少第2代、至少第3代或至少第4代可以在没有补充抗生素的 培养基中生长。
[0077]因此，本发明的这个方面的粘附材料针对3D培养来配置，从而提供生长基质，所述 生长基质实质上增加用于细胞粘附的可利用的附着表面，从而模拟组织(例如胎盘)的基础 结构。
[0078]对于大规模生产，可以在3D生物反应器中进行培养。
[0079] 此类生物反应器的实例包括但不限于，推流式生物反应器、持续搅拌槽式生物反 应器、静止-床生物反应器(填充床生物反应器)和流化床生物反应器。
[0080] 如实施例部分的实施例2所示，Celligen生物反应器能够在受控条件(例如pH、温 度和氧水平）下并且以恒定的细胞培养基灌注进行粘附细胞的3D扩增。此外，可以就葡萄 糖、乳酸盐、谷氨酰胺、谷氨酸和铵的浓度水平监视细胞培养物。粘附细胞的葡萄糖消耗速 率和乳酸盐形成速率允许测定细胞生长速率并确定收获时间。
[0081 ]可以用于本发明的其它3D生物反应器包括但不限于，持续搅拌槽式生物反应器， 其中将培养基持续加入生物反应器中并且将用过的培养基持续排出，以维持生物反应器内 的时间恒定的稳定态。搅拌槽式生物反应器可以与下述一起使用:流化床(悬浮的载体)或 纤维床篮(可以从例如New Brunswick Scientific Co. ,Edison,NJ获得）、静止-床生物反 应器、气升式生物反应器(其中通常将空气加至中央气流管的底部，气体向上流动同时形成 泡沫，并且在柱的顶部释放废气）、具有PoIyactive泡沫的生物反应器[如Wendt，D.等人， Biotechnol Bioeng 84:205-214,（2003)中所描述]、径向流灌注生物反应器中的多孔支架 [如Kitagawa等人，Biotechnology and Bioengineering 93(5) :947-954(2006)中所描 述]、具有支架或载体的径向流生物反应器、中空纤维生物反应器以及微载体。可用于本发 明的其它生物反应器描述于美国专利号6,277，151、6，197,575、6，139,578、6，132,463、5， 902,741和5,629,186。
[0082]在示例性实施方式中，接种总共150±50xl06个细胞，接种3-7xl06个细胞/gr载体， 或接种0.06-0.13xl06个细胞/毫升。根据示例性的实施方式，以1400-7000个细胞/cm2在 FibraCel盘中进行细胞接种。
[0083] 可以在至少大约10%的细胞正在增殖时收获细胞，同时避免不受控的分化和衰 老。
[0084] 培养持续至少大约2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、20天、1个月或更长。将 认识到，在生物反应器中的培养可以超过这些时间段。3D培养物中的粘附细胞的培养可以 在培养基的持续流中进行。也可以进行传代以增加细胞数目。将认识到，可以更换培养基以 便延长并改善培养条件。
[0085] 根据本发明的实施方式，在培养基的灌注下进行细胞培养。通常而言，灌注速率由 粘附细胞的培养基中的葡萄糖浓度决定。因此，根据本教导，可以当葡萄糖浓度是大约 500mg/L、大约550mg/L或大约600mg/L时更换培养基。
[0086] 本发明的一些实施方式的粘附细胞包括至少大约10%、28%、30%、50%、80%或 更多的增殖细胞(如可以通过FACS监视S和G2/M期而测定）。
[0087] 本发明的一些实施方式的粘附细胞可包含至少一种"基质干细胞表型"。
[0088] 如本文使用的"基质干细胞表型"是指源自骨髓的基质（即间充质）干细胞的典型 的结构或功能表型。
[0089] 如本文使用的词语"干细胞"是指不是终末分化的细胞。
[0090] 因此，例如，细胞可以具有纺锤形状。可替代地或另外，细胞可以表达基质干细胞 的典型的一种标志物或标志物(例如表面标志物）的集合。基质干细胞表面标志物（阳性和 阴性）的实例包括但不限于：CD105+、CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、D7-fib+、CD3-、CD4-、 CD34-、CD45-、CD80-、CD5-、CD20-、CDllB-、CD14-、CD19-、CD79-、HLA-DR-、CD31-、KDRjP FMC7-。其它基质干细胞标志物包括但不限于酪氨酸羟化酶、巢蛋白和H-NF。
[0091] 根据本文教导产生的胎盘组织的粘附细胞具有基本上如以下实施例部分的实施 例3所描述的基因表达模式。
[0092] 基质干细胞的典型的功能表型的实例包括但不限于，T细胞抑制活性(它们不刺激 T细胞，相反抑制T细胞）以及造血干细胞支持活性。
[0093] 根据示例性的实施方式，与来自骨髓并在相同条件下生长和分化的粘附细胞相 比，本发明的粘附细胞向骨生成性或脂肪生成性谱系的定向较差(分别见实施例4-5和实施 例6-7)。
[0094]如以下的实施例部分的实施例3所示，发现在混合淋巴细胞反应(MLR)测试中，本 发明的粘附细胞抑制人单核细胞的免疫反应，因此显示出可以有利地应用于临床的生物活 性(例如T细胞抑制活性、造血干细胞支持活性）。
[0095] 根据本发明的一个实施方式，本发明的粘附细胞能够抑制受试者中的免疫反应。
[0096] 如本文使用的词语"抑制受试者中的免疫反应"是指降低或抑制受试者中响应于 抗原(例如外来细胞或其一部分)而发生的免疫反应。可以被粘附细胞抑制的免疫应答包括 体液免疫应答和细胞免疫应答，其分别涉及通过抗体和T-淋巴细胞(T细胞的增殖）的对病 原体抗原的特异性识别。
[0097] 根据本文教导产生的细胞群体可用于治疗可以从细胞或器官移植中获益的病况。
[0098] 如本文使用的术语"病况"是指任何可以从细胞(例如干细胞)或器官移植中获益 的病（疾病、病况、症状或病症）。实例包括局部缺血病况、心血管病况、神经系统病况、胃肠 道病况、整形外科病况、造血病况、肾病况和肝病况，例如但不限于，外周动脉疾病(PAD)，例 如肢体缺血和临界性肢体缺血(CLI )、下肢远端缺血、缺血性血管疾病、缺血性心脏病、心肌 缺血、急性心肌梗塞(MI)、冠状动脉疾病（CAD)、动脉粥样硬化心血管病、冠状动脉左总干 病、动脉阻塞性疾病、外周缺血、外周血管病、动脉硬化、缺血性脑部疾病、中风、脑缺血、脑 血管疾病、视网膜病、视网膜修复、重塑性病症、希佩尔-林道综合征、遗传性出血性毛细血 管扩张性缺血性血管病、Buerger氏病、糖尿病、肾脏的血管疾病、缺血性肾病、肝脏疾病、缺 血性胎盘、再生相关的病症、移植物抗宿主病（GVHD)、实体器官移植、造血干细胞移植 (HSCT )、代谢病症、胃肠(GI)道的炎性病况[例如炎性肠病（IBD )]、溃疡性大肠炎、创伤愈合 延迟、溃疡愈合延迟、癌症(例如乳腺癌）、癌前、特征在于结缔组织损伤的病况，例如骨癌、 骨肉瘤、骨转移瘤、骨折、退行性腰椎间盘疾病、成骨不全(OI)、烧伤（burn)、烧伤（burn wound)、关节软骨缺损、创伤愈合、深伤、创伤愈合延迟、溃疡愈合延迟、软骨下骨囊肿、骨质 疏松症、骨关节炎(0A)、骨退化、软骨损伤、关节软骨缺损、腱受损(例如过劳诱导的腱损伤） 和韧带损伤。
[0099]将认识到的是，本发明的粘附细胞能够诱导受试者中的免疫抑制和/或耐受。因 此，所述粘附细胞可用于治疗任何需要免疫抑制和/或耐受的病况。此类病况包括但不限 于，自身免疫疾病和炎性疾病(包括急性和慢性炎性疾病），包括但不限于，心血管疾病、风 湿性疾病、腺性疾病、胃肠疾病、皮肤病、肝病、神经疾病(例如神经痛、外周神经损伤）、肌肉 疾病、肾病、肾移植的支持物、与生殖相关的疾病、结缔组织疾病和全身性疾病。
[0100]自身免疫性心血管疾病的实例包括但不限于，动脉粥样硬化(Matsuura E.等人， Lupus.l998;7Suppl 2:S135)、心肌梗塞（Vaarala O.Lupus.l998;7Suppl 2:S132)、血检 (Tincani Α·等人，Lupus 1998;7Suppl 2:S107_9)、韦格纳肉芽肿、Takayasu动脉炎、川崎 综合征（Praprotnik S.等人,Wien Klin Wochenschr 2000Aug 25;112(15_16):660)、抗因 子 VIII 自身免疫疾病（Lacroix-Desmazes S.等人，Semin Thromb Hemost.2000;26(2): 157)、坏死性小血管炎、显微镜下多血管炎、Churg-Strauss综合征、少免疫病灶坏死性和新 月体性肾小球性肾炎(Noel LH.Ann Med Interne(Paris).2000May;151(3):178)、抗磷脂 综合征(Flamholz R.等人，J Clin Apheresis 1999;14(4):171)、抗体诱导的心脏衰竭 (Wallukat G.等人,Am J Cardiol.l999Jun 17;83(12A):75H)、血小板减少性紫療(Moccia F.Ann Ital Med Int.l999Apr-Jun;14(2):114;Semple JW.等人，Blood 1996May 15;87 (10) :4245)、自身免疫性溶血性贫血(Efremov DG.等人，Leuk Lymphoma 1998Jan;28(3_ 4):285;Sallah S.等人,Ann Hematol 1997Mar;74(3):139)、Chagas病中的心脏自身免疫 病(Cunha-Neto Ε·等人，J Clin Invest 19960ct 15;98(8) :1709)和抗辅助T淋巴细胞自 身免疫病（Caporossi AP.等人,Viral Tmmunol 1998； 11(1) :9) 〇
[0101] 自身免疫性风湿性疾病的实例包括但不限于，风湿性关节炎（Krenn V.等人， Histol Histopathol 2000Jul；15(3):791；Tisch R1McDevitt HO.Proc Natl Acad Sci units S A 1994Jan 18;91 (2) :437)和强直性脊柱炎（Jan Voswinke