专利名称：干细胞因子纯化方法
技术领域：
本发明涉及新的干细胞因子纯化方法。
背景技术：
干细胞因子SCF(Stem Cell Factor)是1990年分别由William，DW，Zsebo，KM，Huang，EW为首的三个不同实验小组几乎同时发现的[1-3]，([1]Williams DE，Eisenman J，Baird A et al.Identification of a ligand for the c-kit proto-oncogene.Cell，1990；63(2)167-174.[2]Zsebo KM，Wypych J，McNiece IK et al.Identification，purification，and biological characterization of hematopoietic stem cell factorfrom buffalo rat liver-conditioned medium.Cell，1990；63(2)195-201.[3]Huang E，Nocka K，Beier DR et al.The hematopoietic growth factor KL is encoded by the S1 locus and isthe ligand of the c-kit receptor，the gene product of the W locus.Cell 1990；63(2)225-233.)它是原癌基因c-kit产物的一个胞外配体。根据其刺激细胞生长、结合受体特性又被称为肥大细胞生长因子(Mast Cell Growth Factor)、Steel因子(Steel factor)、kit配体(KitLigand)等。
SCF在体内是一种糖蛋白，含N-连，O-连糖基，由于糖基化程度不同，分子量呈多形性。来源于E.coli的非糖基化的重组SCF具有生物活性，这说明糖基化对生物活性影响不大。SCF是一种对造血细胞、神经细胞、原始生殖细胞、肠上皮干细胞等都有重要作用的因子，其中它对造血细胞的作用最为明显。它主要作用于早期多能干细胞、祖细胞，同时对晚期成熟血细胞也有作用。它与IL-1β、IL-3、IL-6、IL-11、G-CSF、GM-CSF及EPO等联合应用具有明显的协同作用，能刺激来源于骨髓、外周血、脐血的CD34+祖细胞的扩增。SCF在抗放射、肿瘤放疗化疗的辅助治疗、造血前体细胞移植，贫血和其它血液病的治疗上具有良好的应用前景。
人SCF已在原核表达系统中克隆表达，原核表达的人SCF以包涵体形式存在。要得到活性形式的SCF，必需先将包涵体变性和复性，然后从复性液中纯化SCF。但复性液中除含低浓度构型正确的SCF外，还含有宿主蛋白、核酸、SCF异构体和变性剂等，其中SCF异构体包括未形成正确的分子内二硫键的SCF。而作为药用或研究用，非常希望SCF是一种基本去除宿主蛋白、核酸、SCF异构体和变性剂等杂质的高纯状态。因此需要一种完成这一目标的纯化SCF的方法。同时，为了适应生产的需要，还要求该方法个有以下特点中的一个或多个(1)回收率较高；(2)成本较低；(3)工艺稳定。
发明概要本发明通过提供一种纯化溶液中人干细胞因子(SCF)的方法来填补这一需要。该方法包括(a)将含人干细胞因子的溶液进行阴离子交换，由此得含SCF的级份；(b)将含SCF级份进行疏水色谱分离，由此得纯化的SCF的级份。该方法可用于原核表达体系表达的SCF。
本发明还提供一种用阴离子交换色谱从含变性剂的人干细胞因子(SCF)稀溶液中快速浓缩，分离SCF的方法，其中变性剂可以为0.2-8mol/L的尿素，或0.1-10％非离子型表面活性剂，如吐温、曲拉通等。
本发明还提供一种用疏水色谱从含SCF异构体的溶液中分离具有天然构型SCF的方法。
附图详述
图1是色谱图，SCF稀溶液，经阴离子交换色谱吸附后，用含氯化钠的缓冲液洗脱，用紫外检测器280nm波长检测洗脱液，获得的色谱图，第一峰为经浓缩和初纯化的SCF。图2是色谱图，经阴离子交换色谱浓缩和纯化SCF级分，经Phenyle-Sepharose HighPerformance柱疏水色谱纯化，用紫外检测器280nm波长检测洗脱液，获得的色谱图，保留时间64-95min的吸收峰对应的级分为纯化的SCF。图3是色谱图，经阴离子交换色谱浓缩和纯化SCF级分，经Superdx200柱凝胶过滤色谱纯化，用紫外检测器280nm波长检测洗脱液，获得的色谱图，保留时间225-260min的吸收峰对应的级分为纯化的SCF。图4是曲线图，表明不同浓度的SCF对TF-1细胞的刺激活性，A为英国国立生物标准与控制研究所(NIBSC)提供的SCF国际参考品；B为用本方法纯化的SCF。图5是色谱图，显示纯化的SCF的纯度，纯化的SCF用C8反相高压液相色谱(RP-HPLC)分析，280nm紫外检测器检测获得的色谱图。
发明描述本文中引述的参考文献合并于此作为参考。
如本文中所用的“干细胞因子”或“SCF”可以是人SCF(hSCF)或鼠SCF。人SCF定义为这样的一种蛋白，它(a)具有已知成熟(即没有前导序列)可溶型(相对于膜型而言)hSCF基本相同的氨基酸序列，如欧洲专利，EP0423980中所公开的，和(b)具有与天然hSCF相同或相似的生物活性。
SCF可以通过编码SCF多肽的核酸的重组技术获得。通常的分子生物学方法描述于，例如，Sambrook，et al.Molecular Cloning，A Laboratory Manual.Cold Spring HarborPublish.，Cold Spring Harbor，New York，2nded.1989。适合的序列可以从基因组库或cDNA库得到。可以采用聚合酶链式反应(PCR)技术。参见，例如，PCR ProtocolsA Guide toMethods and Applications，1990，Innis et al.(Ed.)，Academic Press，New York。如EP0423980A1公开的从肝癌细胞株HepG2(ATCC HB8065)采用聚合酶链式反应(PCR)技术建立的cDNA得到。EP0423980A1公开了该cDNA序列。可以根据该序列合成寡核苷酸探针，用于从上述cDNA库中筛选SCF的cDNA。也可用基因合成的方法合成编码SCF多肽的基因。
多种表达载体可用于表达编码SCF多肽的基因，优选的载体包括pBV220。宿主细胞可用多种大肠杆菌，优选的宿主细胞包括大肠杆菌DH5α。在上述基础上构建表达SCF的工程菌是本领域已熟知的。许多表达载体和宿主细胞可从市场或ATCC得到。
本发明的方法包括顺序使用阴离子交换色谱、疏水色谱纯化溶液中人干细胞因子(SCF)。本发明的方法还包括一种用阴离子交换色谱从含变性剂的人干细胞因子(SCF)稀溶液中快速浓缩，分离SCF的方法，和一种用疏水色谱从含SCF异构体的溶液中分离天然构型SCF的方法。为获取高产率，每一步都在pH、缓冲组合物、流速等方面进行了优化。为了进一步提高纯度，可选的使用凝胶色谱。凝胶色谱步骤可以在阴离子交换色谱之后，也可以在疏水色谱之后，优选的为在阴离子交换色谱之后，原因是由于此处的阴离子交换色谱是用于浓缩和初纯化SCF的，因而获得的SCF级分浓度高，体积小，有利于凝胶色谱分离。
再则，为有效和有利于大规模操作，以及考虑产品纯度和产率，对色谱步骤的次序作了优化。此包括1.第一步骤(阴离子交换色谱)期间产品浓缩以减小体积，有利于下一步凝胶色谱，并除去大部分核酸和一些杂蛋白，尤其是碱性蛋白等。2.第二步骤(凝胶色谱)期间除去部分杂蛋白和一些SCF异构体。3.第三步骤(疏水色谱)期间除去大部分SCF异构体和少量的杂蛋白，从而获得高纯度的SCF。
首先采用阴离子交换步骤是由于SCF复性液体积较大，蛋白浓度较低，肯含有较多杂蛋白、核酸和尿素，需要对其先进行浓缩和初纯化。用阴离子柱直接吸附复性液中的SCF，而不需要先进行透析或超滤来去除复性液中的尿素和更换缓冲组合物，简化了操作，更重要的是避免了透析或超滤中蛋白堵膜引起的回收率下降，操作费用增加等问题。可以采用任一种阴离子交换基如季铵盐(Quaternary ammonium)交换基、乙基季铵盐(Quaternaryaminoethyl)交换基、二乙氨乙基(Diethylaminoethyl)交换基。阴离子交换基可以固定在任何固相载体上，包括但不限于琼脂、纤维素、葡聚糖、聚苯乙烯。优选的阴离子交换基为固定在琼脂载体底物上的二乙氨乙基，如DEAE-SEPHAROSE Fast FlowR(瑞士Pharmacia公司产品)。为在SCF上产生足够的负电荷，平衡缓冲液的pH应高于5.6，对DEAE-SEPHAROSE Fast FlowR优选pH为6.0-9.0，更优选pH为8.4。
如果从原核表达体系包涵体中纯化SCF，该SCF变性而后复性后，将含复性SCF的溶液用如上所述的阴离子交换介质，使SCF结合在介质上，将要装载的蛋白量可参考厂家提供的信息，经实验测定。采用一个1.6×15cm的DEAE-SEPHAROSE Fast FlowR柱，可以3cm/min的流速加入大约5mg蛋白/ml填充体积。装载后，将柱用分段洗脱或线性梯度盐溶液洗脱，对DEAE-SEPHAROSE Fast FlowR优选200mmol/L的NaCl溶液洗脱，收集含SCF的级分，优选条件可使SCF的浓度从复性后溶液中的0.05-0.3mg/ml，浓缩到5-10mg/ml。
将含SCF的级分进行疏水色谱分离。可以分离去除大部分杂蛋白和SCF异构体，这些异构体包括未能形成正确分子内二硫键的SCF，从而得到纯化的SCF。可以采用任一种疏水交换基如苯基(Phenyl)交换基、叔丁基(Butyl)交换基。疏水交换基可以固定在任何固相载体上，包括但不限于琼脂、纤维素、葡聚糖、聚苯乙烯。优选的疏水交换基为固定在琼脂载体底物上的苯基，如Phenyl-SEPHAROSE High Performancer(瑞士Pharmacia公司产品)。为了实现上述分离，试验了并优化了许多条件，包括所用的盐的种类、洗脱梯度、pH等。
为了提高SCF的纯度，可将来自阴离子交换色谱的含SCF的级分先进行凝胶色谱分离，去除部分杂蛋白和SCF异构体，然后再进行疏水色谱分离。凝胶可用在约1KD至600KD的蛋白质级份范围的凝胶。其中优选的为Superdex200R、Superdex75R、SEPHACRYL S-200R、SEPHACRYL S-100R(均为瑞士Pharmacia公司产品)。其中更优选的是SEPHACRYL S-200R。
下列实例用来说明但不限定本发明。
实例1用阴离子交换色谱从复性液中浓缩、分离SCF工程菌培养将大肠杆菌(E.Coli)用含有编码和表达人干细胞因子(rhSCF)基因的表达质粒转化，该质粒载有转录rhSCF的PLPR启动子，载有抗氨苄青霉素基因，rhSCF以不溶的包涵体形式在转化菌内生产，转化菌种在含酵母抽提物5g/L，胰蛋白胨10g/L，Nacl 10g/L，氨苄青霉素100mg/L，的种子培养基中，摇床30℃ 150r/min活化培养12h，按0.2％(v/v)接种量将上述活化菌种接6个含100ml上述种子培养基的500ml三角瓶中，摇床30℃150r/min活化培养10-12h，合并6个三角瓶中的培养物接种装有20L培养基的30L发酵罐(UD30型德国B.Brun Biotech International CO.)，培养基组成为酵母抽提物5g/L，胰蛋白胨10g/L，磷酸盐缓冲液50mmol/L，硫酸镁4mmol/L，用前加50％葡萄糖8ml/L。罐内溶氧由溶氧电极在线(on line)检测，调节搅拌转速和通气流量，控制溶氧始终大于30％饱和氧浓度。pH也由pH电级在线检测，通过蠕动泵补入5N氨水控制pH值不低于6.2。接种后30±1℃培养6-8h后补加50％葡萄糖200ml升温至42±1℃诱导5-6h，收获培养物，用JA-2型离心机(Backman公司产品，JA-10离心转头)8000r/min离心分离，收到大约300-400g菌体沉淀物。
取15g菌体沉淀物用135ml缓冲液A(10mmol/L Tris-HCl，pH7.0)悬浮，超声破菌仪(Sonicprep150，三洋公司)超声破菌40次(30秒/次，间隔30秒)，破菌液10000r/min，4℃离心30min(Backman JA-2型离心机，JA-14离心转头)，收集沉淀即为粗制包涵体，粗制包涵体用含1％TritonX-100的缓冲液A150ml搅拌洗涤1h，10000r/min离心30min(Backman JA-2型离心机，JA-14离心转头)，收集沉淀，用150ml不含Triton的缓冲液A重悬后10000r/min离心，收集沉淀为SCF包涵体。
包涵体的溶解和SCF复性上述制备的包涵体加150ml变性液B(含尿素8mol/L、Tris-HCl10mmol/L，pH8.4)搅拌溶解3h，加入到3L复性缓冲液(含尿素1.6mol/L、Tris-HCl50mmol/L，pH8.4、氧化型谷胱甘肽0.1mmol/L，还原型谷胱甘肽0.9mmol/L EDTA，0.1mmol/L)，搅拌混合后4-10℃复性12-24h。
阴离子交换色谱将上述复性液以6-8ml/min的流速加到DEAE-SepharoseFF柱(1.6×15cm，层析介质为Pharmacia公司产品)上，该柱已预先用300ml平衡缓冲液G(2mol/L尿素，10mmol/LTris-HCl，PH8.4)以6-8ml/min的流速预平衡过。然后，用含2mol/L尿素，10mmol/LTris-HCl，pH8.4的缓冲液以0.5ml/min冲洗柱2h，再用100ml洗脱液H(含2mol/L尿素，NaCl 0.2mol/L，Tris-HCl 10mmol/L，pH8.4)，以0.5ml/min的流速洗脱。紫外检测器，波长280nm，检测洗脱液，含SCF的级分在第一主峰(图1)，收集SCF的级分浓度达到6.3mg/ml，纯度达80％。
实例2用疏水色谱从含SCF异构体的溶液中分离天然构型SCF经阴离子交换色谱浓缩和纯化的级分中SCF纯度大于80％，除杂蛋白外，溶液中还含有少量，未正确复性的SCF，本方法建立了一种通过疏水色谱从含SCF异构体的溶液中分离天然构型SCF的方法。在Waters650中压层析仪(Waters公司产品)上，将经阴离子交换色谱浓缩和纯化SCF级分，加入硫酸钠至浓度为1mol/L后以流速为6ml/min加到Phenyle-Sepharose High Performance柱(2.6×12cm)上，该柱已预先用平衡液J(1mol/L Na2SO4，10mmol/L Tris-HCl，pH9.0)预平衡，然后用平衡液J以同一流速洗柱30min，然后Na2SO4在10min内从1mol/L降到0.6mol/L，100min从0.6mol/L降到0.4mol/L进行梯度洗脱，以8ml/管收集洗脱液，纯化的SCF级分在Na2SO4浓度为0.55-0.45mol/L时洗脱(图2，保留时间64-95min)。纯化的SCF级分纯度大于90％，除去了溶液中的，大部分杂质和异构体。
实例3含凝胶过滤色谱的SCF纯化工程菌培养、包涵体分离、SCF复性及用阴离子交换色谱浓缩和初纯化SCF的方法同实例1。
在Waters650中压层析仪(waters公司产品)上，将阴离子交换色谱浓缩和初纯化后的SCF溶液用Superdex200柱(5.0×120cm，层析介质为Pharmacia公司产品)层析，流速6ml/min，该柱已预先用平衡缓冲液I(含Tris-HCl 10mmol/L，pH7.0)以6ml/min的流速预平衡过。紫外检测器波长280nm检测洗脱液，20ml/管收集洗脱液(图3)，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)；分析各收集管溶液，合并SCF纯度较高的级分(保留时间225-260min)用于下一步疏水色谱分离。疏水色谱分离方法同实例2。高纯度的SCF级分在Na2SO4浓度为0.5-0.45mol/L时洗脱。收集该级分可选的，经凝胶层析或透析换溶剂后可用于制药或其它应用。
表1 rhSCF纯化步聚体积rhSCF浓度 纯度总rhSCF 回收率(ml)(mg/ml)(％)(mg) (％)菌体县液 150 2.535 375 100包涵体溶解液 75 4.160 307 82复性液1500ND ND NDND阴离子层析34 6.380 214 57凝胶过滤 360 0.590 180 48疏水层析 68 2.399 156 42ND未测经各步纯化，最终制品纯度可达98％以上，收率40％左右。制品浓度在2mg/mL左右。
纯化的rhSCF活性测定SCF样品用无血清培养基在96孔板上作倍比稀释，每孔加样100μl，TF-1细胞培养在含10％新生牛血清和2ng/mlGM-CSF的1640培养基中，使用前，先用不含血清和GM-CSF的1640培养基洗细胞四次，用无血清培养基稀释至浓度为4×104/ml，吸取100μl细胞加入上述96孔板，于37℃、5％ CO2条件下培养65h左右，每孔加20μl MTT，再培养5h后，加入20％ SDS 80μl，溶液后在酶联仪上测A570。结果表明在无血清培养基中，制备的人SCF对TF-1细胞的生长有明显的维持作用(图4)，其半数有效剂量为6-7ng/ml，以英国国立生物标准与控制研究所(NIBSC)提供的国际参考品为参考，比活达1×106U/mg。
纯化的rhSCF纯度分析反相高压液相色谱分析HP1050高效液相色谱仪(惠普公司)，C84.0×250mm色谱柱(中国科学院大连化学物理所)，UV检测器，波长280nm，流动相A0.1％TFA+超纯水B0.1％TFA+乙腈。洗脱程序为0→50min，A 100％→10％，B 0％→90％。RhSCF 20μl上样分析，纯度大于98％。(图5)
权利要求
1.一种纯化溶液中人干细胞因子(SCF)的方法，包括(a)将含人干细胞因子的溶液进行阴离子交换，由此得含SCF的级份；(b)将来含SCF级份进行疏水色谱分离，由此得高度纯化的SCF的级份。
2.权利要求的1的方法，进一步包括将含SCF的级份进行凝胶色谱分离，由此得含SCF纯度较高的级份。
3.权利要求1的方法，更进一步包括(a)将含人干细胞因子的溶液进行阴离子交换，由此得含SCF的级份；(b)将来源于(a)的含SCF级份进行凝胶色谱分离，由此得含SCF级份。(c)将来源于(b)的含SCF级份进行疏水色谱分离，由此得高度纯化的SCF的级份。
4.权利要求1、2、3的方法，其中SCF由原核表达体系生产，并由包涵体蛋白变性和复性获得。
5.一种用阴离子交换色谱从含变性剂的人干细胞因子(SCF)稀溶液中快速浓缩，分离SCF的方法，其中变性剂可以为0.2-8mol/L的尿素。
6.权利要求11的方法其中变性剂为0.5-3mol/L的尿素。
7.一种从含SCF异构体的溶液中分离天然构型SCF的方法，包括将含不同SCF异构体的溶液，进行疏水色谱分离，得到天然构型SCF的级份。
8.权利要求1、2、3、5的方法，其中的阴离子交换色谱由固定在载体底物上的二乙氨乙基(Diethylaminoethyl)交换基构成。
9.权利要求2、3的方法，其中的凝胶色谱具有1至600KD的极份范围。
10.权利要求2、3的方法其中的凝胶色谱介质为交联葡聚糖。
11.权利要求1、2、3、7的方法，其中的疏水色谱由固定在载体底物上的苯基(phenyl)交换基构成。
12.权利要求8、11的方法，其中载体底物为交联琼脂糖。
全文摘要
本发明涉及新的干细胞因子纯化方法,该方法包括:(a)将含人干细胞因子的溶液进行阴离子交换,由此得含SCF的级份;(b)将含SCF级份进行疏水色谱分离,由此得纯化的SCF的级份。还提供一种用阴离子交换色谱从含变性剂的人干细胞因子(SCF)稀溶液中快速浓缩,分离SCF的方法,用疏水色谱从含SCF异构体的溶液中分离具有天然构型SCF的方法。并对方法进行了优化。
文档编号C07K14/435GK1368507SQ01102478
公开日2002年9月11日 申请日期2001年2月7日 优先权日2001年2月7日
发明者吴军, 马清钧 申请人:深圳科兴生物工程股份有限公司, 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所