专利名称：以毛囊干细胞为种子细胞的复合皮及其构建方法
技术领域：
本发明涉及医学创面修复技术领域，特别是一种能修复全层皮肤缺 损创面的以毛囊干细胞为种子细胞的复合皮及其构建方法，该毛囊干细 胞转染突变型0 -连环蛋白基因。
背景技术：
为解决大面积深度烧伤患者皮源不足的问题，体外构建含自体表皮 细胞的复合皮用于移植已成为创面修复领域中的研究热点。目前常规的
制备复合皮的方法是取小块皮肤标本(2cm^4cm2)，分离自体表皮细胞， 体外培养、扩增，然后按一定密度接种于真皮替代物(如脱细胞真皮、 海绵状胶原膜、透明质酸膜、聚乳酸/聚羟基乙酸膜等)表面，继续培养 后形成含单层或复层表皮细胞的复合皮，将复合皮移植于经手术处理的 深度烧伤创面，即可形成新的皮肤组织，从而修复创面。
在复合皮的体外构建和移植中，研究者经长期的实践发现，体外培 养、扩增表皮细胞存在以下难以克服的缺陷①培养条件苛刻,培养周期 长，扩增倍数不稳定。②尽管在培养早期，表皮细胞中的一部分细胞仍 具有表皮干细胞特性，但经长时间培养和传代后，表皮细胞逐渐失去增 殖潜能，成为终未分化细胞，移植后因过度角化而脱落、存活率低。③ 对于特大面积烧伤患者，皮源严重不足，表皮细胞的来源受到极大限制。 因此，含自体表皮细胞的复合皮的临床应用受到了较大的限制。
最近研究表明，毛囊干细胞可望成为复合皮构建中新的种子细胞(参 见张群，丛笑倩，张文杰等.利用中性蛋白酶消化法扩增毛囊干细胞的实 验研究.上海交通大学学报，2007,27(4):387-391 )。毛囊干细胞主要位于毛
囊外根鞘的隆突部，是更原始的干细胞群，具有永久的增殖潜能。毛囊 干细胞具有双向分化潜能，不仅能够再生出毛囊，而且可向表皮干细胞、 表皮细胞分化。因此，利用毛囊干细胞无限增殖和双向分化的特点，可 提供表皮细胞来源。但毛囊干细胞的显著特点是慢增殖周期，而作为种
子细胞需要一定的增殖速度和数量。因此如何在体外扩增毛囊干细胞,数 量，并防止分化是需要解决的难题。 '
发明内容
本发明的目的在于提供一种不是以自体表皮细胞直接构建的复合 皮，而是以毛囊干细胞作为种子细胞构建的复合皮，并且该毛囊干细 胞转染了突变型e-连环蛋白基因，可在体外保持一定的增殖速度和数
本发明是对目前构建的复合皮进行了明显的改进。即将毛囊干细胞 分离培养后，经质粒载体转染突变型P-连环蛋白基因，然后将这种转基 因的毛囊干细胞接种在真皮替代物表面，经体外培养后形成复合皮。将 突变型的P -连环蛋白基因转染到毛囊干细胞，可使毛囊干细胞内游离的
p —连环蛋白逐渐在胞质内积聚，这些积聚起来的P —连环蛋白与T细 胞因子/淋巴样增强因子(Tcf/Lef)结合形成复合体，进而启动细胞增殖相 关的基因转录，使毛囊干细胞大量增殖，从而縮短毛囊干细胞体外培养、 扩增时间，提高复合皮应用的灵活性。
本发明提供了一种以毛囊干细胞作为种子细胞的复合皮的构建方 法，包括如下步骤
A) 分离、培养毛囊干细胞该步骤采用文献记载之常规方法，如 张群，丛笑倩，张文杰等.利用中性蛋白酶消化法扩增毛囊干细胞的实验 研究.上海交通大学学报，2007，27(4):387-391 。
B) 构建突变型P-连环蛋白基因质粒表达载体该步骤采用文献记 载之常规方法，如张瑞，鄢和新，陈磊等.连环蛋白基因功能区截短突变 体的构建及其功能.细胞与分子免疫学杂志2004,20(4)385-389。
C) 将质粒表达载体与毛囊干细胞共培养，转染毛囊干细胞；
D) 将转染了突变型e-连环蛋白基因的毛囊干细胞按1-5乂105个 /cr^的密度接种于真皮替代物表面，体外培养l-2周，形成含单层或复 层细胞膜片的复合皮。
本发明的以毛囊干细胞作为种子细胞的复合皮的构建方法，其具体 步骤如下
A) 分离、培养毛囊干细胞
切取小块头皮(如2-4cm2)，采用酶消化法分离毛囊外根鞘细胞群， 制备成单个毛囊干细胞悬液，按2.5-5 X10S个/cn^细胞密度接种于培养 瓶中，置于37'C培养箱中以完全型DMEM培养液进行培养，当细胞达 70% 80%融合时进行传代、扩增；
B) 构建突变型P-连环蛋白基因质粒表达载体
采用反转录PCR克隆全长野生型e-连环蛋白基因(参见Frank T， Kolligs， Gang Hu， et al. Neoplastic Transformation of RK3E by Mutant P -Catenin Requires Deregulation of Tcf/Lef Transcription but Not Activation of c-myc Expression. Molecular and Cellular Biology, 1999,19(8): 5696-5706)，以此为模板，采用PCR技术，扩增编码140 781位氨基 酸的N端功能区截短突变体基因，以质粒为载体，插入突变型P-连环
蛋白基因构建成表达载体；
C) 毛囊干细胞的基因转染
将1 P g质粒表达载体与毛囊干细胞共培养，转染毛囊干细胞，采用 Westemblot检测细胞浆内P -连环蛋白表达水平；
D) 复合皮的构建
将转染了突变型P-连环蛋白基因的毛囊干细胞按l-5X105个/cm2 的密度接种于真皮替代物表面，加入完全型DMEM培养液经体外培养 1-2周，每2 3天换液一次，形成含单层或复层细胞膜片的复合皮。
临床上常用的真皮替代物有脱细胞真皮、海绵状胶原膜、透明质酸 膜和聚乳酸/聚羟基乙酸膜等。
本发明还提供了根据上述方法构建的复合皮作为创面修复移植材 料的应用。
本发明复合皮与目前临床上常用的含自体表皮细胞或毛囊干细胞的 复合皮比较，具有显著的优点本发明的复合皮中的毛囊干细胞经转染 突变型P-连环蛋白基因，从而能控制毛囊干细胞的分化，并促进毛囊干 细胞增殖，使毛囊干细胞能在较短的时间内扩增较多的数量，满足应用 的需要。另一方面，毛囊干细胞具有较强的增殖性，能提高复合皮移植 后的抗感染能力。
本发明含转染突变型e-连环蛋白基因的毛囊干细胞的复合皮，主要
用途是修复全层皮肤缺损创面，为严重的大面积深度烧伤患者提供皮源。 另一方面，也可应用于慢性深度皮肤溃疡、皮肤撕脱伤等皮肤缺损创面 的修复。经大量动物(裸鼠)实验表明，将转染突变型P-连环蛋白基因 的人毛囊干细胞接种于海绵状胶原膜真皮替代物表面培养后形成复合
皮，然后以真皮替代物一面朝下，植入全层皮肤缺损创面，存活率达85%。 复合皮移植后，毛囊干细胞增殖分化，转化为表皮细胞，最终封闭创面。 新生皮肤可见基底层、基底上层和角化层，表皮与真皮连接结构正常， 真皮中胶原纤维排列规则有序。
具体实施例方式
现结合实施例，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。
实施例l本发明的复合皮的构建
毛囊干细胞的分离、培养取小块头皮(2cm2)经PBS(含青霉素 50 U / ml、链霉素50 u g / ml)清洗，小心刮除皮下脂肪组织，剪成0.5 cm X 1.0 cm大小，置于5 mg / ml Dispase II (Gibco公司)，4°C消化过夜(14 16 h)，无血清DMEM清洗，小心拔出毛发，剪除毛球部，加入0.125% 胰酶(Gibco公司)37。C消化10 min，上下吹打，加含10%的小牛血清 DMEM终止消化，过滤，以800转/分钟离心8 min， DMEM洗涤2次， 以完全型DMEM培养液稀释后计数，按2. 5 X 105个/^112细胞密度接种于培 养瓶中，置于37"C培养箱中以完全型DMEM培养液进行培养，当细胞达 70% 80%融合时进行传代、扩增。 .
P -连环蛋白基因的克隆及突变型P -连环蛋白基因质粒表达载体的 构建用0. 125%的胰酶消化、离心、收集1X107个对数生长期的人 SW480结肠癌细胞，用TRIZOL提取细胞总RNA，以引物 P2(CGGGACCTACATCGTATCAAACC)反转录P-连环蛋白cDNA第1链。然 后，以引物P1(CGGGATCCATGGCTACTCAAGCTGATTTG)和P2进行PCR，将 扩增片段经BamH I和Kpn I双酶切后，克隆入pUC19的相应位点，并 转化E.coliDH5a菌种。挑取阳性菌落，经酶切鉴定和测序，命名为pUO P。以pUC-e为模板，以引物P3(CGCGTCGACTGGACMTGGCTACTCMG)和
p4 (CGGGATCCTTACAGGTCAGTATCMACC)进行PCR，扩增编码140 781位 氨基酸的N端功能区截短突变体基因。经Sal I和BaraH I双酶切后， 连入pCMV—myc(Clontech公司)中的相应位点，构建成含突变型P-连 环蛋白基因的质粒表达载体。
毛囊干细胞基因转染转染前24h用胰酶消化生长至对数期的毛囊 干细胞，以2X105接种于24孔板。待细胞达80%融合率时进行转染。 转染细胞换用200 uL无血清DMEM培养。将1 u g质粒DNA禾n 2 p L LipofectAmine 2000，分别加于25 y L无血清DMEM中，混匀，室温静 置30min。将转染液加入24孔板中，轻轻混匀后，于37oC孵育4h。弃去 转染液，加入含100 mL/L胎牛血清的DMEM继续培养。采用Westernblot 检测细胞浆内3 -连环蛋白表达水平。
复合皮的构建将真皮替代物海绵状胶原膜以DMEM培养液漂洗2 小时，然后将转染了突变型P-连环蛋白基因的毛囊干细胞按1X10S个 /cn^密度接种于海绵状胶原膜真皮替代物表面，加入完全型DMEM培 养液经体外培养l周，每2 3天换液一次，形成含单层细胞膜片的复合 皮。
实施例2本发明的复合皮的构建
制备复合皮时，将经基因转染的毛囊干细胞按lX10S个/cii^密度接 种于脱细胞真皮替代物表面，在完全型DMEM培养液中37X:下培养1 周，每2天换液1次，即形成含单层毛囊细胞的复合皮。其余同实施例 1。
实施例3本发明的复合皮的构建
制备复合皮时，将经基因转染的毛囊干细胞按lX10S个/cr^密度接 种于海绵状胶原膜真皮替代物表面，在完全型DMEM培养液中37t:下 培养2周，每2天换液1次，即形成含复层毛囊干细胞的复合皮。其余 同实施例1。
实施例4本发明的复合皮的构建
制备复合皮时，将经基因转染的毛囊干细胞按2X 105个/(^12密度接 种于海绵状胶原膜真皮替代物表面，培养l周即形成复合皮。其余同实 施例l。
实施例5本发明复合皮的动物移植试验
雄性Balb/c-nu小鼠(裸鼠，上海西普尔一必凯实验动物有限公司提 供)，体重18士2克，16只，共分为二组。分别为本发明复合皮组(即转 基因毛囊干细胞组)和含未进行基因转染的毛囊干细胞的复合皮组(即单 纯毛囊干细胞组)
裸鼠经氯胺酮腹腔麻醉后，剃除背部皮肤毛发，切除脊柱偏腹侧部 全层皮肤及深筋膜达肌肉层。将实施例1中所述的经体外培养1周的复 合皮移植于创面。为防止创周皮肤收縮及表皮爬行，影响移植结果的观 察，采用移植舱将创面与周边皮肤隔离。复合皮上覆盖含DMEM培养液的 胶原膜，定期更换敷料并观察创面愈合情况。复合皮移植后2周打开创 面观察存活率。并取材，制成厚约5ium的石蜡切片，行常规组织切片HE 染色观察。
结果表明，本发明复合皮移植后存活率为83.5%，明显高于含单纯毛 囊干细胞的复合皮组(存活率为72.8%)。组织学观察可见，本发明复合 皮移植后4周表皮层增厚，明显角化。表皮与真皮连接区开始形成皮钉 与乳头，两者连接较紧密。而含单纯毛囊干细胞的复合皮移植后4周， 表皮与真皮连接区较平坦。
权利要求
1、一种以毛囊干细胞作为种子细胞的复合皮的构建方法，其特征在于该方法包括如下步骤A)分离、培养毛囊干细胞；B)构建突变型β-连环蛋白基因质粒表达载体；C)将质粒表达载体与毛囊干细胞共培养，转染毛囊干细胞；D)将转染了突变型β-连环蛋白基因的毛囊干细胞按1-5×105个/cm2的密度接种于真皮替代物表面，体外培养1-2周，形成含单层或复层细胞膜片的复合皮。
2、 根据权利要求1所述的一种以毛囊干细胞作为种子细胞的复合皮的构 建方法，其特征在于该方法的具体步骤如下A) 分离、培养毛囊干细胞切取小块头皮，采用酶消化法分离毛囊外根鞘细胞群，制备成单个毛囊干细胞悬液，按2.5-5Xl()S个/cn^细胞密度接种于培养瓶中，置于 37。C培养箱中以完全型DMEM培养液进行培养，当细胞达70% 80。％融 合时进行传代、扩增；B) 构建突变型e-连环蛋白基因质粒表达载体采用反转录PCR克隆全长野生型日-连环蛋白基因，以此为模板，采 用PCR技术，扩增编码140 781位氨基酸的N端功能区截短突变体 基因，以质粒为载体，插入突变型P-连环蛋白基因构建成表达载体；C) 毛囊干细胞的基因转染将1 P g质粒表达载体与毛囊干细胞共培养，转染毛囊干细胞，采用 Westemblot检测细胞浆内P-连环蛋白表达水平；D) 复合皮的构建将转染了突变型P-连环蛋白基因的毛囊干细胞按1-5X105个/cm2 的密度接种于真皮替代物表面，加入完全型DMEM培养液经体外培养 1-2周，每2 3天换液一次，形成含单层或复层细胞膜片的复合皮。
3、 根据权利要求1或2所述的一种以毛囊干细胞作为种子细胞的复合皮 的构建方法，其特征在于其中的真皮替代物是脱细胞真皮、海绵状胶原膜、透明质酸膜或聚乳酸/聚羟基乙酸膜。
4、 一种如权利要求1、 2或3所述的方法构建的复合皮。
5、 如权利要求4所述的方法构建的复合皮作为创面修复移植材料的应 用。
全文摘要
本发明涉及医学创面修复技术领域。体外构建含自体表皮细胞的复合皮用于移植已成为创面修复领域的研究热点，但体外培养扩增表皮细胞存在如培养条件苛刻、皮源严重不足等缺陷。本发明的目的在于提供一种以毛囊干细胞作为种子细胞构建的复合皮及其构建方法，本发明将毛囊干细胞分离培养后，经质粒载体转染突变型β-连环蛋白基因，然后将该毛囊干细胞接种在真皮替代物表面，经体外培养后形成复合皮。本发明不仅能控制毛囊干细胞的分化，促进毛囊干细胞增殖，使毛囊干细胞能在较短的时间内扩增较多的数量，满足应用的需要，而且毛囊干细胞具有较强的增殖性，能提高复合皮移植后的抗感染能力。
文档编号C12N15/85GK101182547SQ20071017204
公开日2008年5月21日 申请日期2007年12月11日 优先权日2007年12月11日
发明者夏照帆, 朱世辉, 杨晓妍, 田建广, 肖仕初 申请人:中国人民解放军第二军医大学