蛋白印迹法检测毛囊干细胞vegf165蛋白表达的方法
【专利摘要】本发明涉及蛋白印迹法检测毛囊干细胞VEGF165蛋白表达的方法，该方法包括以下的步骤：1）毛囊干细胞裂解备用；2）聚丙烯酰胺凝胶电泳包括a）制备8%分离胶；b）制备5%积层胶；c）30%聚丙烯酰胺0.33ml，10%SDS20μl，10%过硫酸胺20μl，TEMED2μl，加入后混匀，快速制胶；1.4ml上述混合液快速注入两层玻璃板间隙，迅速插入梳子，聚合完全后小心取出梳子；d）电泳；e）电转移；f）检测硝酸纤维上的蛋白质；g）免疫学检测。本发明由于采用了上述的技术方案，实现了转染后毛囊干细胞VEGF165蛋白表达的检测。
【专利说明】蛋白印迹法检测毛囊干细胞VEGF165蛋白表达的方法【技术领域】
[0001]本发明涉及皮肤组织工程学领域，尤其涉及一种蛋白印迹法检测毛囊干细胞VEGF165蛋白表达的方法。
[0002]【技术领域】
[0003]皮肤作为人体最大的器官，具有感觉、调节体温、分泌与排泄、防止水分蒸发等多种作用，其中最主要的功能是作为人体与外界环境的屏障以维持内环境的稳定，同时其也是免疫系统的重要组成部分。随着社会经济的发展，特别是作为“世界工厂”的我国制造业和手工业的繁荣发展，各种涉及皮肤缺损的外伤特别是烧伤、压轧伤、切割伤等也越来越多。其中，外伤导致的皮肤大面积缺损常常导致非常严重的肢体残疾，甚至死亡。目前临床上治疗皮肤缺损的标准治疗方法是自体皮肤移植，由于具有无免疫排斥反应，成活率高等特点，其在临床上应用极为广泛，并取得了很好的疗效。但自体皮肤移植的缺点也非常明显，由于是自体取材，其本身就是对患者的再次损伤，极大增加了患者痛苦，而且有发生供皮区感染，不愈合等并发症的风险。更为严重的是，对于上述的大面积皮肤缺损，常由于缺乏足够可供移植的自体皮肤而导致创面修复困难，严重影响了治疗进程，甚至导致死亡。
[0004]正因如此，科学家们一直试图寻找一种外源性的皮肤替代物。早在公元前1500年，异种皮肤移植就被用于临时覆盖皮肤缺损创面。而随着组织工程学的创立和发展，皮肤组织工程学迅速兴起，并成为近十年来研究的热点。组织工程学是应用工程学及生命科学的原理与方法，研究生物替代物，以用于重建、保持或提高组织功能的一门学科。目前，国外应用皮肤组织工程学构建人工皮肤的研究已取得了实质性进展，Apligraf, OrCel,Suprathel> Biobrane、OASIS、Integra、Lyphoder等产品已先后被美国药品与食品管理局(FDA)批准上市并已应用于临床皮肤缺损的治疗中。
[0005]然而，虽然目前已`有以上数种人工皮肤产品可供临床选择，也确实促进了对大面积皮肤缺损患者的临床治疗。但是，根据我们多年临床应用过程中遇到的问题，结合文献报道，我们认为目前人工皮肤移植还存在着许多问题，其中甚至包括可能导致治疗最终失败的“硬伤”:①由于以上人工皮肤产品都没有血管生成能力，导致移植的人工皮肤没有血管系统供给营养，从而使人工皮肤容易发生坏死，使移植失败。②人工皮肤产品中所含的各种异体细胞容易引起免疫排斥反应，临床上常出现移植的皮肤坏死、脱落，严重的甚至出现全身免疫反应等严重并发症，并且有可能传播疾病。③目前所有的人工皮肤产品都只能恢复正常皮肤的部分解剖结构和生理功能，而无法再生具有重要功能的皮肤附属器结构，例如:血管、毛发、汗腺等。
[0006]毛囊干细胞是一类存在于毛囊外根鞘隆突部的干细胞，具有未分化性、自我更新和体外增殖能力强等特点。体外培养研究中的毛囊干细胞表现出了高克隆形成能力，具有很高的再生潜能。由于毛囊干细胞来源于毛发，可以直接从患者自身取得，数量极其丰富，且没有任何并发症，对患者完全无创，现已成为皮肤组织工程学研究的焦点。Taylor等(Taylor G，Lehrer MS, Jensen PJ，et al.1nvolvement of follicular stem cells informing not only the follicle but also the epidermis.Cell, 2000, 102(4):451-461.)研究发现毛囊干细胞不仅能够分化形成毛囊，而且还参与了表皮组织的形成过程。Stelios等发表的最新研究结果证明，头发毛囊中含有大量的干细胞，是最容易获得的干细胞来源之一，并已成功将毛囊干细胞分化发育生成新的脉管系统。血管内皮细胞生长因子165 (VEGF165)是血管内皮细胞生长因子5种亚型之一，其活性最强，分布范围最广，是VEGF体内发挥作用的主要亚型。近年来围绕VEGF165为中心的血管再生性基因治疗研究成为国内外研究热点。
[0007]为此 申请人:申请了一种VEGF165基因修饰毛囊干细胞的方法，该方法以毛囊干细胞为种子细胞，具有体外培养时能快速大量扩增，来源非常丰富，减小免疫排斥反应；同时利用VEGF165基因转染修饰毛囊干细胞，能够形成具有扩张和收缩功能的新的工程血管系统，将很好的解决移植人工皮肤容易坏死，成活率低的问题。但是如何检测毛囊干细胞VEGF165蛋白表达是一个难题。
【发明内容】
[0008]为了解决上述的问题，本发明的目的是提供一种蛋白印迹法检测毛囊干细胞VEGF165蛋白表达的方法。
[0009]为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案:
[0010]蛋白印迹法检测毛囊干细胞VEGF165蛋白表达的方法，该方法包括以下的步骤:
[0011]I)毛囊干细胞裂解
[0012]a)用预冷的PBS洗毛囊干细胞3遍；
[0013]b)加预冷的 lysing buffer, 6 孔板:80 U 1/well ;60mm 培养皿:300 U 1/disk, 4°C孵育20min ；
[0014]c)用细胞刮棒把细胞碎片连同lysing buffer集中于一侧，4°C孵育40min并转移至预冷的 Eppendorf 管中；12000g, 4°C离心 5min ；
[0015]d)将上清移入另一 Eppendorf管中，除部分用来测蛋白浓度外，其余直接用于实验或_70°C冷冻备用；
[0016]2)聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0017]a)制备 8% 分离胶:1.5mM Tris-HCl (pH8.8) 1.3ml,dddH20 2.3ml, 30% 聚丙烯酰胺1.3ml，10%SDS 50 ill，10%过硫酸胺50u I, TEMED 3u I,加入后混匀，快速制胶；3ml上述混合液快速注入两层玻璃板间隙，随即以少量三蒸水封胶面，室温聚合30min，吸去上层三蒸水；
[0018]b)制备 5% 积层胶:1mM Tris-HCl (pH6.8)0.25ml, ddH20 1.4ml ；
[0019]c) 30% 聚丙烯酰胺 0.33ml, 10%SDS20 u 1，10% 过硫酸胺 20 u I, TEMED 2 u 1，加入后混匀，快速制胶；1.4ml上述混合液快速注入两层玻璃板间隙，迅速插入梳子，聚合完全后小心取出梳子；
[0020]d)电泳:取含同等蛋白量的样本稀释至等体积,和5 X sample buffer按4:1体积混勻，100°C水浴5min，乘热加样，每孔道30 yl，加样后凝胶放置于装有电泳缓冲液的电泳槽进行电泳；电泳条件:积层胶内95VX15min，分离胶内165VX 50min，待样品中的溴酚蓝迁移至胶的前沿时，结束电泳；
[0021 ] e)电转移:SDS-PAGE后，将聚丙烯酰胺胶卸下，取与凝胶相同大小的6张滤纸和一张硝酸纤维膜，在半干转移缓冲液中平衡15min，依次从下到上放好3张滤纸、凝胶、NC膜、另3张滤纸，然后夹于半干转膜装置中，膜朝正极，胶向负极，根据膜面积大小，以1.25mA/cm2的恒流,转膜90min ；
[0022]f)检测硝酸纤维上的蛋白质:将膜浸在丽春红染色液中染色，约3min可见红色蛋白质色带出现，然后将膜浸在蒸馏水中脱色，轻轻摇动数分钟，然后更换脱色液数次，直至背景色很淡；
[0023]g)免疫学检测:1、封闭:转膜后，将硝纤膜置TTBS中，缓摇lOmin，然后膜于封闭液中37°C摇床缓慢平摇2h ;2、结合一抗:封闭后将硝纤膜移入一抗(1:1000)，4°C过夜或室温平摇3h ;回收一抗，硝酸纤维浸入TTBS 20ml中，急摇lOmin，连续3次，清洗膜上残余一抗；3、结合二抗:将硝纤膜移入马抗兔二抗反应液(I:2000)中，室温平摇2h后，硝酸纤维膜浸入TTBS 30ml中，急摇15min，连续3次，清洗膜上残余二抗；4、免疫复合物的检测:GEImageQuant LAS 4000化学发光成像分析仪显影拍照。
[0024]本发明由于采用了上述的技术方案，实现了转染后毛囊干细胞VEGF165蛋白表达的检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1、图2为原代毛囊干细胞从毛囊隆突部爬出，呈鸟巢状、上皮样细胞，排列紧40 X。
[0026]图3为IV型胶原筛选纯化后的P3代毛囊干细胞，呈典型的铺路石状IOOX。
[0027]表I为分选纯化后的P3代毛囊干细胞进行Q-PCR检测，用AA Ct法进行各基因表达的相对定量。
[0028]图4-图6为P3代毛囊干细胞的免疫荧光染色，分别为整合素P 1、整合素a6、角蛋白 15，IOOX。
[0029]图7-图9为喷金显示明胶海绵三维支架扫描电镜，分别为SEM50X、200X、400X。
[0030]图10、图11分别为倒置荧光显微镜下，P3代毛囊干细胞用慢病毒感染完72h的GFP 图和 PH 图1OOX。
[0031]图12为VEGF165基因修饰后的毛囊干细胞的生长曲线图。
[0032]图13为VEGF165基因修饰后的毛囊干细的mRNA的RT-PCR结果图。
[0033]图14为VEGF165基因修饰后的毛囊干细的VEGF165蛋白的表达结果。
[0034]图15?图17分别为复合人工皮肤的HE染色，分别为注射浓度IX 106、5X 106、I X 107/cm2, bar:200 X。
[0035]图18-19为做大鼠背部移植时创面图。
[0036]图20-23为7d移植术后的四个创面愈合情况。依次为VEGF165组、空质粒组、无细胞组、纱布组。
[0037]图24-27为14d移植术后的四个创面愈合情况。依次为VEGF165组、空质粒组、无细胞组、纱布组。
[0038]图28-31为21d移植术后的四个创面愈合情况。依次为VEGF165组、空质粒组、无细胞组、纱布组。
图32为7d、14d、21d四个组的创面愈合率。图33-35为21d后对取材组织做的HE染色，观察血管形成情况。依次为VEGF165组、空质粒组、无细胞组。IOOX
【具体实施方式】
[0039]实施例1大鼠毛囊干细胞的分离、培养，鉴定
[0040]1.1)选用一周龄SD大鼠触须部皮肤，置入0.25%Dispase酶37°C消化2h ;用镊子和一次性注射器针头从皮下组织端拉出毛囊，收集形态完好且处于生长期的毛囊，显微镜下将毛囊切成三等份，取中间部分，PBS漂洗后放入50mL培养瓶中，加入DMEM/F12补充培养基，置于37°C、5%C02培养箱中，每2d换液一次；所述的DMEM/F12补充培养基成分为:44mlDMEM/F12培养液、5mlKSR血清替代物、500 U I青链霉素混合液、500 u I L-谷氨酰胺、500 u I非必需氨基酸、20ng/ml重组人表皮细胞生长因子、10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、50 Ul羟基乙醇、10ng/ml氢化可的松。图1、图2为原代毛囊干细胞从毛囊隆突部爬出，呈鸟巢状、上皮样细胞，排列紧密。
[0041]1.2)毛囊干细胞的纯化:将IOOii g/ml的IV型胶原按照3ml/100mm dish的量包被在培养皿中，室温静置Ih ;将IOOmm培养皿的原代细胞用胰蛋白酶消化，离心收集细胞后，吹打成单细胞悬液接种于培养皿中，20min后，将未贴壁的细胞连同培养液一起吸出；贴壁的细胞用完全培养基培养，每3天换液；P2代再纯化一次。如图3为IV型胶原筛选纯化后的P3代毛囊干细胞，呈典型的铺路石状。
[0042]1.3)毛囊干细胞的鉴定:
[0043]a、采用Q-PCR法:分选纯化后的P3代毛囊干细胞进行Q-PCR检测，用AA Ct法进行各基因表达的相对定量。
[0044]表1为分选纯化后 的P3代毛囊干细胞进行Q-PCR检测，用AA Ct法进行各基因表达的相对定量。
[0045]
【权利要求】
1.蛋白印迹法检测毛囊干细胞VEGF165蛋白表达的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤: 1)毛囊干细胞裂解 a)用预冷的PBS洗毛囊干细胞3遍； b)加预冷的lysing buffer, 6 孔板:80 u 1/well ；60mm 培养皿:300 u 1/disk, 4°C孵育20min ； c)用细胞刮棒把细胞碎片连同lysingbuffer集中于一侧，4°C孵育40min并转移至预冷的 Eppendorf 管中；12000g, 4°C离心 5min ； d)将上清移入另一Eppendorf管中，除部分用来测蛋白浓度外，其余直接用于实验或-70°C冷冻备用； 2)聚丙烯酰胺凝胶电泳 a)制备 8% 分离胶:1.5mM Tris-HCl (pH8.8) 1.3ml, dddH202.3ml, 30% 聚丙烯酰胺1.3ml，10%SDS50 u I，10%过硫酸胺50u I, TEMED3 u I，加入后混匀，快速制胶；3ml上述混合液快速注入两层玻璃板间隙，随即以少量三蒸水封胶面，室温聚合30min，吸去上层三蒸水；b)制备 5% 积层胶:ImM Tris-HCl (pH6.8) 0.25ml, ddH201.4ml ； c )30%聚丙烯酰胺0.33ml，10%SDS20 u I，10%过硫酸胺20u I, TEMED2 u I，加入后混匀，快速制胶；1.4ml上述混合液快速注入两层玻璃板间隙，迅速插入梳子，聚合完全后小心取出梳子； d)电泳:取含同等蛋白量的样本稀释至等体积，和5Xsample buffer按4:1体积混匀，100°C水浴5min，乘热加样，每孔道30 yl，加样后凝胶放置于装有电泳缓冲液的电泳槽进行电泳；电泳条件:积层胶内95VX15min，分离胶内165VX 50min，待样品中的溴酚蓝迁移至胶的前沿时，结束电泳； e)电转移:SDS-PAGE后，将聚丙烯酰胺胶卸下，取与凝胶相同大小的6张滤纸和一张硝酸纤维膜，在半干转移缓冲液中平衡15min，依次从下到上放好3张滤纸、凝胶、NC膜、另3张滤纸，然后夹于半干转膜装置中，膜朝正极，胶向负极，根据膜面积大小，以1.25mA/cm2的恒流，转膜90min ； f)检测硝酸纤维上的蛋白质:将膜浸在丽春红染色液中染色，约3min可见红色蛋白质色带出现，然后将膜浸在蒸馏水中脱色，轻轻摇动数分钟，然后更换脱色液数次，直至背景色很淡； g)免疫学检测:1、封闭:转膜后，将硝纤膜置TTBS中，缓摇IOmin,然后膜于封闭液中37°C摇床缓慢平摇2h ;2、结合一抗:封闭后将硝纤膜移入一抗(1:1000)，4°C过夜或室温平摇3h ;回收一抗，硝酸纤维浸入TTBS20ml中，急摇lOmin，连续3次，清洗膜上残余一抗；3、结合二抗:将硝纤膜移入马抗兔二抗反应液(I:2000)中，室温平摇2h后，硝酸纤维膜浸入TTBS30ml中，急摇15min，连续3次，清洗膜上残余二抗；4、免疫复合物的检测:GEImageQuant LAS4000化学发光成像分析仪显影拍照。
【文档编号】G01N33/68GK103487585SQ201310290261
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年7月10日 优先权日:2013年7月10日
【发明者】全仁夫, 黄忠名, 郑宣, 许世超 申请人:杭州市萧山区中医院