一种人毛囊干细胞库的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种人类毛囊来源的成体干细胞库，即人毛囊干细胞库的构建方法。
【背景技术】
[0002]干细胞(stem cell, SC)是指具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的原始细胞，根据分化能力可分为胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)和成体干细胞(adultstem cells, ASCs)。胚胎干细胞即全能型干细胞，在分化能力上最具研宄价值，但其来源于胚胎，势必存在着伦理方面和安全性方面(潜在致瘤性)的问题，所以胚胎干细胞在应用上受到了限制。成体干细胞虽在分化能力上弱于胚胎干细胞，但其避开了伦理方面和安全性方面的问题，且自体成体干细胞移植，还可解决免疫排斥问题，避免了长期应用免疫抑制剂所造成的伤害，所以从临床应用上成体干细胞优于胚胎干细胞。
[0003]成体干细胞主要存在于能自我更新的组织和器官中，皮肤组织更新和再生能力强，而毛囊作为其附属器官，终身保持着周期性生长和自我更新的能力。研宄表明，毛囊是目前为止存在于胚胎组织之外唯一类胚胎组织，兼有胚胎干细胞和成体干细胞的优点。毛囊中存在着大量多潜能干细胞，可经体外诱导分化为平滑肌细胞、神经元细胞、神经胶质细胞和黑色素细胞等。所以毛囊干细胞(hair follicle stem cells, HFSC)的研宄越来越受到人们的关注。
[0004]毛囊是皮肤的一种附属成分，是由表皮下陷形成的，由上皮性毛根鞘及结缔组织鞘所构成，位于毛发的下段并且包围着毛根。毛囊上附有立毛肌，并与皮脂腺相连，同时汗腺也开口于毛囊。上皮性毛根鞘的细胞起源于表皮，结缔组织鞘起源于真皮。上皮性毛根鞘是由皮肤的表皮层下凹深入真皮、皮下脂肪层而成，作为表皮的延续部分而包绕毛发，由内向外依次分为鞘小皮、内根鞘和外根鞘，外根鞘相当于表皮的基底层和棘细胞层。在毛干上部外毛根鞘细胞增殖，并且形成隆起，成为毛发上段的标记。Cotsarelis等(1990)认为该隆突部位可环绕整个毛干上部或仅限于单侧即立毛肌附着处，目前被认为是毛囊干细胞存在的主要部位。
[0005]Bickenbach等(1981)在皮肤表皮基底层中发现了标记滞留细胞(labelretaining cell, LRC),即后来的表皮干细胞。此后，Cotsarelis 等(1990)、Taylor等(2000)研宄结果发现，在位于表皮之下的毛囊侧部的隆突处也有干细胞的存在，它们具有更大的增殖潜能和克隆形成能力，这些干细胞不仅能够向下转移到毛囊根部生成毛囊，而且还能从毛囊外根鞘向上迀移，生成表皮和皮脂腺。他们把这一细胞定义为毛囊干细胞，认为这一多能干细胞可能是表皮细胞的祖细胞，对各种皮肤疾病的细胞代替治疗和基因治疗方面的研宄有重要意义。
[0006]为了将获得的人类不同来源的干细胞应用于未来的研宄及细胞治疗，目前在世界不同国家及地区内，人类已经建立了多个干细胞库，例如脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐血干细胞等。所谓的干细胞库即将干细胞在特殊的冻存保护液中储存于_196°C的液氮以及集中存放干细胞资源相关资料的场所。一个完善的干细胞库应具备长期保存干细胞，维持其干细胞的基本特性，并且能够随时随地将储存的健康干细胞提供临床使用的能力。到目前为止，已经成熟的其他成体干细胞都已发展为库，而由于人毛囊干细胞发现较晚，所以尚无相关的人毛囊干细胞库，因此，成功构建人毛囊干细胞库，将健康的人毛囊干细胞通过本发明建立的系统工程技术储存建库，是将现有的资源充分利用的有效方法，为储存本人、家属和他人在需要采用人毛囊干细胞移植及相关技术治疗各种疾病时，提供临床适用型人毛囊干细胞，具有十分广阔的应用前景。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种人毛囊干细胞库的构建方法，上述方法具有原料来源广泛、获取便捷、成本低、应用前景广阔，可为临床和研宄提供大量干细胞资源的优点。
[0008]本发明提供的一种人毛囊干细胞库的构建方法，包括以下步骤:
1)供者毛发的采集:采集供者毛发之前，进行采集至少包括供者身份识别信息的信息；然后对供者进行包括ABO/Rh血型检测、HLA分型的检测以及HIV、HBV、HCV的检测，然后在无菌条件下采集供者的毛发；
2)获取和分离人毛囊干细胞:优选地，在无菌条件下，挑取毛乳头完整的毛发，剪取毛囊根部，用含有双抗的平衡磷酸盐缓冲溶液反复冲洗3-5次；接着用无菌的眼科镊子夹取毛囊放入6孔板中，添加毛囊干细胞培养液600 μ L/孔，370C，5%C02的培养箱中培养，次日补液至3mL/孔继续培养，2-3天更换新鲜的毛囊干细胞培养液，每天观察细胞生长情况，待长至密度为80-90%时即得到原代人毛囊干细胞；
3)人毛囊干细胞的培养:优选地，将获得的原代人毛囊干细胞以ο.ιχιο5-ι.οχιο5个细胞/cm2的密度接种在细胞培养皿中，加入新鲜的毛囊干细胞培养液，置于37°C、5%C02的条件下培养，每2-3天更换一次新培养液，待细胞长至密度为80-90%融合时，去除之前的培养液，加入无菌的平衡磷酸盐缓冲溶液清洗后去除，接着加入0.25%-0.5%含EDTA的胰酶，在37°C条件下消化3-5分钟，然后在显微镜下观察细胞的消化情况，用手轻轻的拍打培养皿，以帮助细胞脱落，待细胞全部脱落后，加入等体积的毛囊干细胞培养液，吹打均匀，以终止消化；然后将终止消化后的人毛囊干细胞悬液转移至离心管中，800-1000转/分钟离心5-6分钟，结束后去除上清液，加入新鲜的毛囊干细胞培养液重悬，最后1:3或者1:4传代，获得更多的人毛囊干细胞；
4)人毛囊干细胞的检测与冻存:
人毛囊干细胞的检测:优选地，待人毛囊细胞长至密度为80-90%融合时，去除之前的培养液，加入无菌的平衡磷酸盐缓冲溶液清洗后去除，接着加入0.25%-0.5%含EDTA的胰酶，在37°C条件下消化3-5分钟，然后在显微镜下观察细胞的消化情况，用手轻轻的拍打培养皿，以帮助细胞脱落，待细胞全部脱落后，加入等体积的毛囊干细胞培养液，吹打均匀，以终止消化；然后将终止消化后的人毛囊干细胞悬液转移至离心管中，800-1000转/分钟离心5分钟，结束后去除上清；将收获的一部分人毛囊干细胞进行质量检测，所述质量检测包括无菌检测、支原体检测、细胞活性检测、分化能力检测以及流式细胞检测，以确定细胞是否达到合格标准；其余同批次人毛囊干细胞进行细胞冻存；
人毛囊干细胞的冻存:优选地，将上述获得的同批次的人毛囊干细胞利用人毛囊干细胞冻存液重悬，调整细胞密度为I X 16-1 X 17个/mL，分装入冻存管中，封盖，并做好编号，立即进行程序式降温，之后放入到-196°C的液氮中长期保存；细胞冻存时做好所有的冻存记录，符合干细胞冷冻保存的标准，储存环境定期检测；
其中，人毛囊干细胞的检测与冻存同时进行，即当检测结果出来之后，细胞已经冻存，这时将检测不合格的细胞按照其编号将相应的冻存细胞连同冻存管一同废弃，做好记录，之后有专门人员进行处理；
5)建库:在储存入库的容器载体上建立相关信息，将前述所采集的供者的基本信息和相应人毛囊干细胞制备及其细胞库构建过程的相关信息录入计算机数据库，并按检索编码调出相关记录与供者资料进行核实，纳入人毛囊干细胞库管理，即完成人毛囊干细胞库的构建。
[0009]其中，细胞培养皿还可以用其它同类细胞培养装置替代，冻存管还可以用其它非管类的同类容器来代替。上述的具体的体积数值，处理时间、次数等数值仅为举例，而不是唯一确定的。
[0010]其中，所述的毛囊干细胞培养液是含有支持干细胞生长的糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素的商业产品化的DMEM/F12培养液，含有10%胎牛血清、bFGF 10ng/mL、双抗(100u/mL)o
[0011]所述的平衡磷酸盐缓冲溶液主要是含有无机盐的水溶液，可为PBS盐缓冲溶液，D-Hanks盐缓冲溶液，或SPB盐缓冲溶液等，其能够维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定。
[0012]所述的人毛囊干细胞冻存液为含有细胞冷冻保护剂，一般常用DMSO类渗透性保护剂，可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤，同时也含有血清以及干细胞基本培养基，包括DMEM、a-MEM等，其中冷冻保护剂(如DMS0)，血清和干细胞基本培养基的配比为1:2:7。
[0013]所述的程序式降温方法包括4°C保存40-60min，_20°C保存l_2h，_80°C过夜，最后存入到-196 0C液氮，也可以直接置于程序性降温盒中，放入-80 0C冰箱过夜，第二天转到-196 °C的液氮中。
[0014]与现有技术相比，本发明的有益效果如下:
第一，利用本发明方法建立储存人毛囊干细胞的干细胞库，这种干细胞库可向临床及科研应用提供大量干细胞资源；
第二，利用本发明方法获取的人毛囊干细胞构建成的干细胞库，其来源丰富，细胞获取便捷，可以获得大量并有活性的人毛囊干细胞，并且能够进行长时间保存而不失去活性，具有良好的应用前景；该库为健康的成年人毛囊干细胞，为储存者在特殊情况下需要采用干细胞移植及相关技术治疗时，提供临床适用型的人毛囊干细胞，并且在取得