Vegf165基因修饰的毛囊干细胞及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及VEGF165基因修饰的毛囊干细胞及其制备方法，该方法包括以下的步骤：1）收集形态完好且处于生长期的毛囊，显微镜下将毛囊切成三等份，取中间部分，PBS漂洗后放入50mL培养瓶中，加入DMEM/F12补充培养基；2)毛囊干细胞的纯化；3）毛囊干细胞的鉴定；4）包装慢病毒；5）慢病毒感染毛囊干细胞；6）获得的VEGF165基因修饰毛囊干细胞。本发明以毛囊干细胞为种子细胞，具有体外培养时能快速大量扩增，来源非常丰富，减小免疫排斥反应；同时利用VEGF165基因转染修饰毛囊干细胞，能够形成具有扩张和收缩功能的新的工程血管系统，将很好的解决移植人工皮肤容易坏死，成活率低的问题。
【专利说明】VEGF165基因修饰的毛囊干细胞及其制备方法【技术领域】
[0001]本发明涉及皮肤组织工程学领域，尤其涉及一种毛囊干细胞基因修饰的方法和该方法获得的毛囊干细胞。
[0002]【技术领域】
[0003]皮肤作为人体最大的器官，具有感觉、调节体温、分泌与排泄、防止水分蒸发等多种作用，其中最主要的功能是作为人体与外界环境的屏障以维持内环境的稳定，同时其也是免疫系统的重要组成部分。随着社会经济的发展，特别是作为“世界工厂”的我国制造业和手工业的繁荣发展，各种涉及皮肤缺损的外伤特别是烧伤、压轧伤、切割伤等也越来越多。其中，外伤导致的皮肤大面积缺损常常导致非常严重的肢体残疾，甚至死亡。目前临床上治疗皮肤缺损的标准治疗方法是自体皮肤移植，由于具有无免疫排斥反应，成活率高等特点，其在临床上应用极为广泛，并取得了很好的疗效。但自体皮肤移植的缺点也非常明显，由于是自体取材，其本身就是对患者的再次损伤,极大增加了患者痛苦,而且有发生供皮区感染，不愈合等并发症的风险。更为严重的是，对于上述的大面积皮肤缺损，常由于缺乏足够可供移植的自体皮肤而导致创面修复困难，严重影响了治疗进程，甚至导致死亡。
[0004]正因如此，科学家们一直试图寻找一种外源性的皮肤替代物。早在公元前1500年，异种皮肤移植就被用于临时覆盖皮肤缺损创面。而随着组织工程学的创立和发展，皮肤组织工程学迅速兴起，并成为近十年来研究的热点。组织工程学是应用工程学及生命科学的原理与方法，研究生物替代物，以用于重建、保持或提高组织功能的一门学科。目前，国外应用皮肤组织工程学构建人工皮肤的研究已取得了实质性进展，Apligraf, OrCel,Suprathel> Biobrane、OASIS、Integra、Lyphoder等产品已先后被美国药品与食品管理局(FDA)批准上市并已应用于临床皮肤缺损的治疗中。
[0005]然而，虽然目前已有以上数种人工皮肤产品可供临床选择，也确实促进了对大面积皮肤缺损患者的临床治疗 。但是，根据我们多年临床应用过程中遇到的问题，结合文献报道，我们认为目前人工皮肤移植还存在着许多问题，其中甚至包括可能导致治疗最终失败的“硬伤”:①由于以上人工皮肤产品都没有血管生成能力，导致移植的人工皮肤没有血管系统供给营养，从而使人工皮肤容易发生坏死，使移植失败。②人工皮肤产品中所含的各种异体细胞容易引起免疫排斥反应，临床上常出现移植的皮肤坏死、脱落，严重的甚至出现全身免疫反应等严重并发症，并且有可能传播疾病。③目前所有的人工皮肤产品都只能恢复正常皮肤的部分解剖结构和生理功能，而无法再生具有重要功能的皮肤附属器结构，例如:血管、毛发、汗腺等。
[0006]毛囊干细胞是一类存在于毛囊外根鞘隆突部的干细胞，具有未分化性、自我更新和体外增殖能力强等特点。体外培养研究中的毛囊干细胞表现出了高克隆形成能力，具有很高的再生潜能。由于毛囊干细胞来源于毛发，可以直接从患者自身取得，数量极其丰富，且没有任何并发症，对患者完全无创，现已成为皮肤组织工程学研究的焦点。Taylor等(Taylor G，Lehrer MS, Jensen PJj et al.1nvolvement of follicular stem cells informing not only the follicle but also the epidermis.Cell, 2000, 102(4):451-461.)研究发现毛囊干细胞不仅能够分化形成毛囊，而且还参与了表皮组织的形成过程。Stelios等发表的最新研究结果证明，头发毛囊中含有大量的干细胞，是最容易获得的干细胞来源之一，并已成功将毛囊干细胞分化发育生成新的脉管系统。血管内皮细胞生长因子165 (VEGF165)是血管内皮细胞生长因子5种亚型之一，其活性最强，分布范围最广，是VEGF体内发挥作用的主要亚型。近年来围绕VEGF165为中心的血管再生性基因治疗研究成为国内外研究热点。
【发明内容】
[0007] 为了解决目前人工皮肤产品存在的可能影响临床应用效果的诸多问题，本发明的一个目的是提供VEGF165基因修饰毛囊干细胞的方法，本发明的另外一个目的是提供上述的方法获得的VEGF165基因修饰毛囊干细胞。本发明以毛囊干细胞为种子细胞，具有体外培养时能快速大量扩增，来源非常丰富，减小免疫排斥反应；同时利用VEGF165基因转染修饰毛囊干细胞，能够形成具有扩张和收缩功能的新的工程血管系统，将很好的解决移植人工皮肤容易坏死，成活率低的问题。
[0008]为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案:
[0009]VEGF165基因修饰毛囊干细胞的方法，该方法包括以下的步骤:
[0010]I)选用一周龄SD大鼠触须部皮肤，置入0.25%Dispase酶37°C消化2h ;用镊子和一次性注射器针头从皮下组织端拉出毛囊，收集形态完好且处于生长期的毛囊，显微镜下将毛囊切成三等份，取中间部分，PBS漂洗后放入50mL培养瓶中，加入DMEM/F12补充培养基，置于37°C、5%C02培养箱中，每2d换液一次；所述的DMEM/F12补充培养基成分为:44mlDMEM/F12培养液、5mlKSR血清替代物、500 μ I青链霉素混合液、500 μ I L-谷氨酰胺、500 μ I非必需氨基酸、20ng/ml重组人表皮细胞生长因子、10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、50 μ I羟基乙醇、10ng/ml氢化可的松；
[0011]2)毛囊干细胞的纯化:将100 μ g/ml的IV型胶原按照3ml/100mm dish的量包被在培养皿中，室温静置Ih ;将IOOmm培养皿的原代细胞用胰蛋白酶消化，离心收集细胞后，吹打成单细胞悬液接种于培养皿中，20min后，将未贴壁的细胞连同培养液一起吸出；贴壁的细胞用完全培养基培养，每3天换液；P2代再纯化一次；
[0012]3)毛囊干细胞的鉴定:
[0013]a、采用Q-PCR法:分选纯化后的P3代毛囊干细胞进行Q-PCR检测，用ΛΛ Ct法进行各基因表达的相对定量；
[0014]b、细胞免疫荧光染色法:将P3代细胞培养到对数生长期，消化后接种在玻片上，贴壁培养2d后，吸掉培养液，用PBST漂洗，加入4%PFA固定后，再用5%BSA室温封闭。分别加入一抗整合素β I抗鼠多克隆抗体、整合素a6多克隆抗体以及角蛋白15多克隆抗体，室温孵育，PBST洗漆后,再加标记二抗避光30min,加DAPI染核5min,避光晾干,用mountingsolution封片，观察；
[0015]4)包装慢病毒:取对数生长期的293T细胞，提前24h接种于IOOmm培养皿中，待次日细胞长至50%-70%即可；病毒包装采用钙转法进行:转染前将293T细胞培养基更换为不含双抗的培养基，包括10 % FBS+DMEM高糖；接着，目的质粒pLent1-1RES-VEGF165-EGFP10ug 和 3 种包装质粒 VSVG、RSV-REV, RRE 各 5ug 加入 50ulHBS液中轻轻混匀，然后补充ddH20至500 μ I作为B液，另准备500 μ ICaCl2A液，接着将B液加入A液中，打出气泡，室温放置2min ;逐滴加入细胞培养皿中，十字水平摇晃多次；待孵育培养10-12h，更换为培养液为含10% FBS+DMEM高糖+1%双抗；48h后细胞出现融合并有强绿色荧光表达时，收集培养上清，用0.45 μ m孔径滤膜过滤后，用超速离心机4°C，55000rpm/min离心3h，除去上清后，然后加100 μ I培养基吹打分装成2管，-80°C保存病毒液；
[0016]5)慢病毒感染毛囊干细胞:取培养的毛囊干细胞，提前I天按照I X IO5/孔的浓度将生长状态良好的P3代的毛囊干细胞消化、离心后用50 μ I病毒原液和50 μ I补充培养基混匀的吹打后接种在预舖胶的24孔板，在37°C、5%C02培养箱静置30min，再补加400 μ I补充培养基继续培养，24h后换液，48h、72h后荧光倒置显微镜下观察绿色荧光，获得VEGF165基因修饰毛囊干细胞；
[0017]6)获得的VEGF165基因修饰毛囊干细胞。分别检测该细胞的增殖能力、RT-PCR检测VEGF165mRNA的表达以及Western-Blot检测VEGF165蛋白表达情况。
[0018]为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案:
[0019]VEGF165基因修饰毛囊干细胞，该毛囊干细胞采用上述的方法获得。
[0020]本发明由于采用了上述的技术方案，以毛囊干细胞为种子细胞，利用VEGF165基因转染制得毛囊干细胞，可以将该毛囊干细胞种植于三维明胶海绵组织支架，构成成具有新的血管系统的新型复合人工皮肤模型。该模型具有以下独特的优点:
[0021]①作为干细胞，毛囊干细胞具有体外培养时能快速大量扩增，长期体外传代培养，细胞功能旺盛等特点，并且具有很高的再生和分化能力，这将极大缩短体外培养扩增时间，提闻临床治疗效率；
[0022]②由于能够形成 的问题；
[0023]③本研究中所用的种子细胞一毛囊干细胞取自自体毛发，来源非常丰富，也非常容易获得，且不会对患者造成任何损伤和痛苦；
[0024]④由于种子细胞取自自体组织，免疫排斥反应和传播疾病等问题将迎刃而解；
[0025]⑤相对于目前的人工皮肤产品，此新型人工皮肤将更大程度的恢复和再生正常皮肤组织的解剖结构和生理功能。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1、图2为原代毛囊干细胞从毛囊隆突部爬出，呈鸟巢状、上皮样细胞，排列紧40 X。
[0027]图3为IV型胶原筛选纯化后的P3代毛囊干细胞，呈典型的铺路石状100X。
[0028]表1为分选纯化后的P3代毛囊干细胞进行Q-PCR检测，用ΛΛ Ct法进行各基因表达的相对定量。
[0029]图4-图6为P3代毛囊干细胞的免疫荧光染色，分别为整合素β 1、整合素a6、角蛋白 15，100X。
[0030]图7-图9为喷金显示明胶海绵三维支架扫描电镜，分别为SEM50X、200X、400X。
[0031]图10、图11分别为倒置荧光显微镜下，P3代毛囊干细胞用慢病毒感染完72h的GFP 图和 PH 图 100X。[0032]图12为VEGF165基因修饰后的毛囊干细胞的生长曲线图。
[0033]图13为VEGF165基因修饰后的毛囊干细的mRNA的RT-PCR结果图。
[0034]图14为VEGF165基因修饰后的毛囊干细的VEGF165蛋白的表达结果。
[0035]图15~图17分别为复合人工皮肤的HE染色，分别为注射浓度1X106、5X106、
1X 107/cm2, bar:200 X。
[0036]图18-19为做大鼠背部移植时创面图。
[0037]图20-23为7d移植术后的四个创面愈合情况。依次为VEGF165组、空质粒组、无细胞组、纱布组。
[0038]图24-27为14d移植术后的四个创面愈合情况。依次为VEGF165组、空质粒组、无细胞组、纱布组。
[0039]图28-31为21d移植术后的四个创面愈合情况。依次为VEGF165组、空质粒组、无细胞组、纱布组。
[0040]图32为7d、14d、21d四个组的创面愈合率。
[0041]图33-35为21d后对取材组织做的HE染色，观察血管形成情况。依次为VEGF165组、空质粒组、无细胞组。100X
【具体实施方式】
[0042]实施例1大鼠毛囊干细胞的分离、培养，鉴定
[0043]1.1)选用一周龄SD大鼠触须部皮肤，置入0.25%Dispase酶37°C消化2h ;用镊子和一次性注射器针头从皮下组织端拉出毛囊，收集形态完好且处于生长期的毛囊，显微镜下将毛囊切成三等份，取中间部分，PBS漂洗后放入50mL培养瓶中，加入DMEM/F12补充培养基，置于37°C、5%C02培养箱中，每2d换液一次；所述的DMEM/F12补充培养基成分为:44mlDMEM/F12培养液、5mlKSR血清替代物、500 μ I青链霉素混合液、500 μ I L-谷氨酰胺、500 μ I非必需氨基酸、20ng/ml重组人表皮细胞生长因子、10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、50μ I羟基乙醇、10ng/ml氢化可的松。图1、图2为原代毛囊干细胞从毛囊隆突部爬出，呈鸟巢状、上皮样细胞，排列紧密。
[0044]1.2)毛囊干细胞的纯化:将100 μ g/ml的IV型胶原按照3ml/100mm dish的量包被在培养皿中，室温静置Ih ;将IOOmm培养皿的原代细胞用胰蛋白酶消化，离心收集细胞后，吹打成单细胞悬液接种于培养皿中，20min后，将未贴壁的细胞连同培养液一起吸出；贴壁的细胞用完全培养基培养，每3天换液；P2代再纯化一次。如图3为IV型胶原筛选纯化后的P3代毛囊干细胞，呈典型的铺路石状。
[0045]1.3)毛囊干细胞的鉴定:
[0046]a、采用Q-PCR法:分选纯化后的P3代毛囊干细胞进行Q-PCR检测，用ΛΛ Ct法进行各基因表达的相对定量。如表1
[0047]b、细胞免疫荧光染色法:将P3代细胞培养到对数生长期，消化后接种在玻片上，贴壁培养2d后，吸掉培养液，用PBST漂洗，加入4%PFA固定后，再用5%BSA室温封闭。分别加入一抗整合素β I (integrin-β I)抗鼠多克隆抗体(1:100)、整合素a6 (integrin_a6)多克隆抗体(1:50)以及角蛋白15 (keratin-15)多克隆抗体(1: 100)，室温孵育，PBST洗涤后，再加标记二抗避光30min,加DAPI( 1:2000)染核5min,避光晾干,用mounting solution封片。图4-图6为P3代毛囊干细胞的免疫荧光染色,分别为整合素@1、整合素&6、角蛋白15。
[0048]实施例2明胶海绵三维组织支架的制备
[0049]2.1)明胶海绵三维组织支架制备:
[0050]A.取含量为5%的明胶溶解于25°C的蒸馏水IOml，分别加入0.05%6_硫酸软骨素钠盐(C6S)和0.2%透明质酸钠盐(HA)；
[0051 ] B.室温下用磁力搅拌器搅拌60分钟后，将交联剂0.5%1-乙基_ (3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶液(EDC)和0.25%N-羟基琥珀酰亚胺溶液(N-Hydroxysuccinimide)滴入溶液中混匀5分钟后,再将溶液注入12控办孔板的模具中，水平摇晃均匀。
[0052]C.于_80°C下冷冻2小时
[0053]D.然后上冻干机，冻干24小时得到厚度为2mm的多孔海绵状的Gel-C6S-HA支架。
[0054]2.2)观察:取少量支架样品，扫描电镜观察并记录，图7-图9为喷金显示明胶海绵三维支架扫描电镜，分别为SEM50X、200Χ、400Χ.[0055]实施例3血管内皮生长因子165基因(VEGF165)修饰毛囊干细胞的制备
[0056]3.1包装慢病毒:取对数生长期的293Τ细胞，提前24h接种于IOOmm培养皿中，待次日细胞长至50%-70%即可；病毒包装采用钙转法进行:转染前将293T细胞培养基更换为不含双抗的培养基，包括10% FBS+DMEM高糖；接着，目的质粒pLent1-1RES-VEGF165-EGFP10ug 和 3 种包装质粒 VSVG、RSV-REV, RRE 各 5ug 加入 50ulHBS液中轻轻混匀，然后补充ddH20至500 μ I作为B液，另准备500 μ ICaCl2A液，接着将B液加入A液中，打出气泡，室温放 置2min ;逐滴加入细胞培养皿中，十字水平摇晃多次；待孵育培养10-12h，更换为培养液为含10% FBS+DMEM高糖+1%双抗；48h后细胞出现融合并有强绿色荧光表达时，收集培养上清，用0.45 μ m孔径滤膜过滤后，用超速离心机4°C，55000rpm/min离心3h，除去上清后，然后加100 μ I培养基吹打分装成2管，-80°C保存病毒液。
[0057]3.2慢病毒感染毛囊干细胞:取培养的毛囊干细胞，提前I天按照I X IO5/孔的浓度将生长状态良好的P3代的毛囊干细胞消化、离心后用50 μ I病毒原液和50 μ I补充培养基混匀的吹打后接种在预舖胶的24孔板，在37°C、5%C02培养箱静置30min，再补加400 μ I补充培养基继续培养，24h后换液，48h、72h后荧光倒置显微镜下观察绿色荧光，获得VEGF165基因修饰毛囊干细胞。图10、图11分别为倒置荧光显微镜下，P3代毛囊干细胞用慢病毒感染完72h的GFP图和PH图。
[0058]3.3生长曲线测定:将感染完72h的P3代毛囊干细胞，消化后以lX105/ml的细胞浓度接种在24孔板上，分别于l、2、3、4、5、6、7d进行细胞计数板计数，每天设置6个复孔，
[0059]取平均数。然后绘制细胞生长曲线。如图12为VEGF165基因修饰后的毛囊干细胞的生长曲线图。
[0060]3.4反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测转然后毛囊干细胞中VEGF165mRNA的表达。
[0061](I)提取总RNA:将接种了毛囊干细胞的六孔培养板置于冰上，吸去培养液；每孔加预冷的Trizol试剂1ml，反复吹打裂解充分后移入EP管中；加入0.2ml氯仿，剧烈震荡混匀后放置2-3min ；12000g, 4°C离心15min ;将上清液移入另一 EP管中，约0.5ml，加等体积异丙醇，颠倒混匀，静置lOmin，离心(12000g，4°C ) lOmin，弃上清；用0.5ml DEPC处理的75%酒精Iml洗涤沉淀，离心(7500g，4°C ) 5min ;倾去酒精，倒置EP管，干燥至酒精挥发；加适量的DEPC处理的水_70°C冷冻备用。
[0062](2)毛囊干细胞RNA的逆转录体系:
[0063]
【权利要求】
1.VEGF165基因修饰毛囊干细胞的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤: 1)选用一周龄SD大鼠触须部皮肤，置入0.25%Dispase酶37°C消化2h ;用镊子和一次性注射器针头从皮下组织端拉出毛囊，收集形态完好且处于生长期的毛囊，显微镜下将毛囊切成三等份，取中间部分，PBS漂洗后放入50mL培养瓶中，加入DMEM/F12补充培养基，置于37°C、5%C02培养箱中，每2d换液一次；所述的DMEM/F12补充培养基成分为:44mlDMEM/F12培养液、5mlKSR血清替代物、500 μ I青链霉素混合液、500 μ I L-谷氨酰胺、500 μ I非必需氨基酸、20ng/ml重组人表皮细胞生长因子、10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、50 μ I羟基乙醇、10ng/ml氢化可的松； 2)毛囊干细胞的纯化:将100μ g/ml的IV型胶原按照3ml/100mm dish的量包被在培养皿中，室温静置Ih ;将IOOmm培养皿的原代细胞用胰蛋白酶消化，离心收集细胞后，吹打成单细胞悬液接种于培养皿中，20min后，将未贴壁的细胞连同培养液一起吸出；贴壁的细胞用完全培养基培养，每3天换液；P2代再纯化一次； 3)毛囊干细胞的鉴定: a、采用Q-PCR法:分选纯化后的P3代毛囊干细胞进行Q-PCR检测； b、细胞免疫荧光染色法:将P3代细胞培养到对数生长期，消化后接种在玻片上，贴壁培养2d后，吸掉培养液，用PBST漂洗，加入4%PFA固定后，再用5%BSA室温封闭；分别加入一抗整合素β I抗鼠多克隆抗体、整合素a6多克隆抗体以及角蛋白15多克隆抗体，室温孵育，PBST洗漆后,再加标记二抗避光30min,加DAPI染核5min,避光晾干,用mountingsolution封片，观察； 4)包装慢病毒:取对数生长期的293T细胞，提前24h接种于IOOmm培养皿中，待次日细胞长至50%-70%即可；病毒包装采用钙转法进行:转染前将293T细胞培养基更换为不含双抗的培养基，包括10 % FBS+DMEM高糖；接着，目的质粒pLent1-1RES-VEGF165_EGFP10ug和3种包装质粒VSVG、RSV-REV, RRE各5ug加入50ulHBS液中轻轻混匀，然后补充ddH20至500 μ I作为B液，另准备500 μ ICaCl2A液，接着将B液加入A液中，打出气泡，室温放置2min ;逐滴加入细胞培养皿中，十字水平摇晃多次；待孵育培养10-12h，更换为培养液为含10% FBS+DMEM高糖+1%双抗；48h后细胞出现融合并有强绿色荧光表达时，收集培养上清，用0.45 μ m孔径滤膜过滤后,用超速离心机4°C, 55000rpm/min离心3h,除去上清后,然后加100 μ I培养基吹打分装成2管，-80°c保存病毒液； 5)慢病毒感染毛囊干细胞:取培养的毛囊干细胞，提前I天按照IXlO5/孔的浓度将生长状态良好的P3代的毛囊干细胞消化、离心后用50 μ I病毒原液和50 μ I补充培养基混匀的吹打后接种在预舖胶的24孔板，在37°C、5%C02培养箱静置30min，再补加400 μ I补充培养基继续培养，24h后换液，48h、72h后荧光倒置显微镜下观察绿色荧光，获得VEGF165基因修饰的毛囊干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法获得的VEGF165基因修饰的毛囊干细胞。
【文档编号】C12N5/10GK103468744SQ201310290239
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年7月10日 优先权日:2013年7月10日
【发明者】全仁夫, 黄忠名, 郑宣, 许世超 申请人:杭州市萧山区中医院