r> 4)人毛囊干细胞的检测与冻存:
人毛囊干细胞的检测:待传代后的人毛囊细胞长至密度为80-90%融合时，去除旧的培养液，加入无菌的PBS清洗后去除，接着加入0.25%含EDTA的胰酶，在37°C条件下消化5分钟，然后在显微镜下观察细胞的消化情况，用手轻轻的拍打培养皿，以帮助细胞脱落，待细胞全部脱落后，加入等体积的毛囊干细胞培养液，吹打均匀，以终止消化。将终止消化后的人毛囊干细胞悬液转移至离心管中，1000转/分钟离心5分钟，结束后去除上清。将收获的一部分人毛囊干细胞进行质量检测，包括无菌检测、支原体检测、细胞活性检测、分化能力检测以及流式细胞检测等，以确定细胞是否达到合格标准，其中本实施例所得细胞的流式细胞检测的结果如图6所示，图6中可以观察到，检测的流式表面抗体结果满足间充质干细胞的基本标准，将未进行质量检测的其余同批次人毛囊干细胞进行细胞冻存；
人毛囊干细胞的冻存:将上述获得的同批次的人毛囊干细胞利用人毛囊干细胞冻存液重悬，调整细胞密度为I X 17个/mL，分装入冻存管中，封盖，并做好编号，立即进行程序式降温，之后放入到_196°C的液氮中长期保存。细胞冻存时做好所有的冻存记录，符合干细胞冷冻保存的标准，储存环境定期检测。其中，上述的人毛囊干细胞冻存液含有细胞冷冻保护剂，一般常用DMSO此类渗透性保护剂，可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤，同时也含有血清以及干细胞基本培养基，包括DMEM、a -MEM等，其中冷冻保护剂(如DMS0)，血清和干细胞基本培养基的配比为1:2:7。此外，上述的程序式降温方法例如可以为:4°C保存40-60min, _20°C保存l_2h，-80°C过夜，最后存入到_196°C液氮；或者也可以为，直接置于程序性降温盒中，放入-80°C冰箱过夜，第二天转到_196°C的液氮中。
[0026]其中，人毛囊干细胞的检测与冻存同时进行，即当检测结果出来之后，细胞已经冻存，这时将检测不合格的细胞按照其编号将相应的冻存细胞连同冻存管一同废弃，做好记录，之后有专门人员进行处理；
5)建库:在储存入库的容器载体上建立相关信息，将前述所采集的供者的基本信息和相应人毛囊干细胞制备及其细胞库构建过程的相关信息录入计算机数据库，并按检索编码调出相关记录与供者资料进行核实，纳入人毛囊干细胞库管理，即完成人毛囊干细胞库的构建。
[0027]本发明具有以下优点:
第一，利用本发明方法建立的储存人毛囊干细胞的干细胞库可向临床及科研应用提供大量干细胞资源；
第二，利用本发明方法构建的干细胞库，其来源丰富，细胞获取便捷，可以获得大量并有活性的人毛囊干细胞，并且能够进行长时间保存而不失去活性，具有良好的应用前景；该干细胞库储存的是健康成年人的毛囊干细胞，为储存者在特殊情况下需要采用干细胞移植及相关技术治疗时，提供临床适用型的人毛囊干细胞，并且在取得允许后，将所储存的干细胞用于其他各种干细胞制剂的生产；
第三.本发明的方法，可有效的分离、纯化和扩增人毛囊干细胞，解决此类资源得不到充分利用的现状，并建立出长期储存人毛囊干细胞的干细胞库以便向临床及科研应用提供大量的干细胞资源。根据获取的人毛囊干细胞构建干细胞库，该库为健康成人储存毛囊干细胞，为其本人在患病需要采用干细胞治疗时，提供临床适用型人毛囊干细胞，并且在取得许可后，可将所储存的人毛囊干细胞用于干细胞制剂生产。
[0028]在本发明及上述实施例的教导下，本领域技术人员很容易预见到，本发明所列举或例举的各原料或其等同替换物、各加工方法或其等同替换物都能实现本发明，以及各原料和加工方法的参数上下限取值、区间值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。
【主权项】
1.一种人毛囊干细胞库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)供者毛发的采集:采集供者毛发之前，进行采集至少包括供者身份识别信息的信息；然后对供者进行包括ABO/Rh血型检测、HLA分型的检测以及HIV、HBV、HCV的检测，然后在无菌条件下采集供者的毛发； 2)获取和分离人毛囊干细胞:在无菌条件下，挑取毛乳头完整的毛发，获取毛囊根部，用含有双抗的平衡磷酸盐缓冲溶液反复冲洗3-5次得到毛囊；接着在无菌状态下将毛囊放入6孔板中，添加毛囊干细胞培养液600 μ L/孔，在37°C，5%C02的培养箱中培养，次日补液至3mL/孔继续培养，每2-3天更换新鲜的毛囊干细胞培养液，待长至密度为80-90%时即得到原代人毛囊干细胞； 3)人毛囊干细胞的培养:将步骤2)获得的原代人毛囊干细胞以0.1 X 15-L OX 15个细胞/cm2的密度接种在细胞培养装置中，加入新鲜的毛囊干细胞培养液，置于37°C、5%C02的条件下培养，每2-3天更换新鲜的毛囊干细胞培养液，待细胞长至密度为80-90%融合时，去除之前的培养液，用无菌的平衡磷酸盐缓冲溶液清洗，接着加入0.25%-0.5%含EDTA的胰酶，在37°C条件下消化3-5分钟，待细胞全部脱落后，加入等体积的毛囊干细胞培养液，吹打均匀，以终止消化；然后将终止消化后的人毛囊干细胞悬液转移至离心管中，800-1000转/分钟离心5-6分钟，结束后去除上清液，加入新鲜的毛囊干细胞培养液重悬，之后1:3或者1:4传代，获得更多的人毛囊干细胞； 4)人毛囊干细胞的检测与冻存: 人毛囊干细胞的检测:待人毛囊细胞长至密度为80-90%融合时，去除之前的培养液，用无菌的平衡磷酸盐缓冲溶液清洗，接着加入0.25%-0.5%含EDTA的胰酶，在37°C条件下消化3-5分钟，待细胞全部脱落后，加入等体积的毛囊干细胞培养液，吹打均匀，以终止消化；然后将终止消化后的人毛囊干细胞悬液转移至离心管中，800-1000转/分钟离心5-6分钟，结束后去除上清；将收获的一部分人毛囊干细胞进行确定细胞是否达到合格标准的质量检测，所述质量检测至少包括无菌检测、支原体检测、细胞活性检测、分化能力检测以及流式细胞检测；其余同批次人毛囊干细胞进行细胞冻存； 人毛囊干细胞的冻存:将上述获得的同批次的人毛囊干细胞利用人毛囊干细胞冻存液重悬，调整细胞密度为I X 16-1 X 17个/mL,分装入冻存管中，封盖，并做好编号，立即进行程序式降温，之后放入到-196°C的液氮中长期保存；细胞冻存时做好所有的冻存记录，符合干细胞冷冻保存的标准，储存环境定期检测； 其中，人毛囊干细胞的检测与冻存同时进行，即当检测结果出来之后，细胞已经冻存，这时将检测不合格的细胞按照其编号将相应的冻存细胞连同冻存管一同废弃，做好记录，之后由专门人员进行处理； 5)建库:在储存入库的容器载体上建立人毛囊干细胞的相关信息，将前述所采集的供者的基本信息和相应人毛囊干细胞制备及其细胞库构建过程的相关信息录入计算机数据库，并按检索编码调出相关记录与供者资料进行核实，纳入人毛囊干细胞库管理，即完成人毛囊干细胞库的构建。
2.如权利要求1中所述的人毛囊干细胞库的构建方法，其特征在于，所述毛囊干细胞培养液为含有支持干细胞生长的糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素的商业产品化的DMEM/F12培养液，所述DMEM/F12培养液含有10%胎牛血清、10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子bFGF、100u/mL双抗。
3.如权利要求1所述的人毛囊干细胞库的构建方法，其特征在于，所述平衡磷酸盐缓冲溶液主要是含有无机盐的水溶液，选自PBS盐缓冲溶液，D-Hanks盐缓冲溶液，或SPB盐缓冲溶液。
4.如权利要求1所述的人毛囊干细胞库的构建方法，其特征在于，所述干细胞冻存液含有细胞冷冻保护剂，血清以及干细胞基本培养基，其中细胞冷冻保护剂，血清和干细胞基本培养基的配比为1:2:7。
5.如权利要求1所述的人毛囊干细胞库的构建方法，其特征在于，所述程序式降温的方法为:4°C保存40-60min，_20°C保存l_2h，_80°C过夜，最后存入到_196°C液氮；或者为，直接置于程序性降温盒中，放入_80°C冰箱过夜，第二天转到_196°C的液氮中。
6.如权利要求1所述的人毛囊干细胞库的构建方法，其特征在于，所述步骤2)和步骤3)的消化过程还包括:在37°C条件下消化3-5分钟后，在显微镜下观察细胞的消化情况，用手轻轻的拍打细胞培养装置以帮助细胞脱落。
【专利摘要】本发明公开了一种人毛囊干细胞库的构建方法，包括供者毛发的采集、获取和分离人毛囊干细胞、人毛囊干细胞的培养、人毛囊干细胞的检测与冻存、建库等步骤。本发明的方法，可有效的分离、纯化和扩增人毛囊干细胞，解决此类资源得不到充分利用的现状，并建立出长期储存人毛囊干细胞的干细胞库以便向临床及科研应用提供大量的干细胞资源。根据获取的人毛囊干细胞构建干细胞库，该库为健康成人储存毛囊干细胞，为其本人在患病需要采用干细胞治疗时，提供临床适用型人毛囊干细胞，并且在取得许可后，可将所储存的人毛囊干细胞用于干细胞制剂生产。
【IPC分类】C12N5-074, A01N1-02
【公开号】CN104789522
【申请号】CN201510199001
【发明人】齐念民, 高剑
【申请人】上海坤爱生物科技有限公司
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月23日