异戊二烯的生产菌以及生产异戊二烯的方法
【技术领域】
[0001] 本文涉及异戊二烯的生产菌以及利用异戊二烯生产菌生产异戊二烯的方法。
【背景技术】
[0002] 异戊二烯，即2-甲基-1，3- 丁二烯，是一种带有共轭双键的活泼烯烃（图1)。异 戊二烯不溶于水，但可与一般有机溶剂如乙醇、乙醚、丙酮和苯等互溶。异戊二烯在l〇〇kPa 下沸点仅为34°C，所以极易挥发。它还容易发生自身聚合，也易与别的不饱和化合物共 聚。在齐格勒-纳塔催化剂的作用下聚合，则会产生聚异戊二烯，即天然橡胶（http:// en.wikipedia. org/wiki/Isoprene)〇
[0003] 由于自然条件的限制，我国的天然橡胶资源一直处于供不应求的状态，进口依赖 度持续高于七成，进口地区集中于三大产胶国泰国、印尼和马来西亚，天然橡胶原料短缺已 成为制约我国橡胶产业发展的瓶颈。2010年我国天然橡胶总产量为68万吨，而进口量则高 达186万吨，天然橡胶的自给率仅为27%。而异戊橡胶因为其结构和性能和天然橡胶的相 似性，成为了面对当今国内天然橡胶资源短缺状态的最佳替代品。若以15%的异戊橡胶替 代进口天然橡胶，则可以估算出2010年国内异戊橡胶的理论需求量超过27万吨。可见我 国异戊橡胶的发展空间巨大（王启飞，于洋，张红兵，叶强.我国发展异戊二烯橡胶前景分 析[J].中外能源，2011，16(8) :68-71)，由此带动的对异戊橡胶单体异戊二烯的需求也将 十分可观。世界上异戊橡胶的主要生产国为俄罗斯、日本、美国。但是遗憾的是，中国直到 2010年4月才建立了 1. 5万吨/年的生产装置，是七大合成胶中中国量产最晚的品种。制 约我国异戊橡胶产业的主要因素在于其聚合单体--异戊二烯资源集中困难，难以达到产 业化规模。
[0004] 目前异戊二烯的生产方法主要有石油分离法和化学合成工艺（Nicolaou, K. C. et al.Total synthesis of eleutherobin.Angew. Chem. Int. Ed. 36, 2520 - 2524(1997).; 和 Avery, M. A. , Chong, W. K. M. &Jennings_White，C. Stereoselective total synthesis of (+)-artemisinin, the antimalarial constituent of Artemisia annua L. J. Amer. Chem. Soc. 114, 974 - 979 (1992))，以及近年来新兴起的生物合成法。其中主要有如下几种 方法：
[0005] (1)分离生产异戊二烯
[0006] 分离工艺主要是将裂解碳五馏分中的异戊二烯采用萃取精馏技术分离出来，裂解 碳五馏分是石脑油及其它重质裂解原料蒸汽裂解制乙烯过程中产生的副产物，其异戊二 烯质量分数约为15%~25%。分离工艺中的二甲基甲酰胺法（DMF法）、乙腈法（ACN法）、 N-甲基吡咯烷酮法（NMP法）均已实现工业化。随着科学技术的发展，研究者们进行了化学 吸附法和膜分离等方法生产异戊二烯的探讨。下面的表1列出了各种分离方法的原理与特 点。
[0007] 表1各分离方法原理与特点列表
[0008]
【主权项】
1. 一种用于以甲醇为原料生产异戊二烯的细菌，其中所述细菌属于甲基杆菌属 (Methylobacterium)，并且所述细菌经过修饰表达异戊二烯合成酶（IspS)。
2. 根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌经进一步修饰还表达异戊二烯基二磷酸 异构酶（IDI)。
3. 根据权利要求1或2所述的细菌，其中所述细菌经进一步修饰还表达： HMG-CoA合成酶（HMGS)、 HMG-CoA还原酶（HMGR)、 甲羟戊酸激酶（MK)、 二氧磷酸甲羟戊酸激酶（PMK)、以及 甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（MPD)。
4. 根据权利要求1~3中任一项所述的细菌，其中所述异戊二烯合成酶（IspS)的氨基 酸序列为SEQIDNO: 1所示的序列。
5. 根据权利要求2所述的细菌，其中所述异戊二烯基二磷酸异构酶（IDI)的氨基酸序 列为SEQIDN0:2所示的序列。
6. 根据权利要求3所述的细菌，其中所述HMG-CoA合成酶（HMGS)的氨基酸序列为SEQ IDNO:3所示的序列。
7. 根据权利要求3所述的细菌，其中所述HMG-CoA还原酶（HMGR)的氨基酸序列为SEQ IDNO:4所示的序列。
8. 根据权利要求3所述的细菌，其中所述甲羟戊酸激酶（MK)的氨基酸序列为SEQID NO:5所示的序列。
9. 根据权利要求3所述的细菌，其中所述二氧磷酸甲羟戊酸激酶（PMK)的氨基酸序列 为如SEQIDNo:6所示的序列。
10. 根据权利要求3所述的细菌，其中所述甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（MPD)的氨基酸序列 为如SEQIDNo:7所示的序列。
11. 根据权利要求1~10中任一项所述的细菌，其中所述细菌具有丝氨酸循环途径。
12. 根据权利要求1~11中任一项所述的细菌，其中所述细菌具有MEP途径。
13. 根据权利要求3所述的细菌，其中该细菌具有乙酰乙酰CoA硫解酶（phaA酶）。
14. 根据权利要求1~13中任一项所述的细菌，其中所述细菌选自扭脱甲基 杆菌（Methylobacteriumextorquens)或罗得西亚甲基杆菌（Methylobacterium rhodesianum)〇
15. -种编码异戊二烯合成酶（IspS)的DNA序列，其序列为SEQIDN0:8。
16. -种编码甲羟戊酸激酶（MK)的DNA序列，其序列为SEQIDNO: 9。
17. -种编码二氧磷酸甲羟戊酸激酶（PMK)的DNA序列，其序列为SEQIDNO: 10。
18. -种编码甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（MPD)的DNA序列，其序列为SEQIDNO: 11。
19. 用于生产异戊二烯的方法，其包括： 以甲醇为碳源培养权利要求1~14中任一项所述的细菌，产生异戊二烯。
【专利摘要】本文涉及一种异戊二烯的生产菌以及生产异戊二烯的方法。具体来说涉及一种以甲醇为原料生产异戊二烯的属于甲基杆菌属(Methylobacterium)的细菌，对所述细菌进行修饰使其表达异戊二烯合成酶(IspS)。
【IPC分类】C12N1-21, C12N15-54, C12N15-60, C12P5-02, C12R1-26
【公开号】CN104789512
【申请号】CN201410020537
【发明人】张翀, 朱文亮, 邢新会, 梁伟凡
【申请人】清华大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2014年1月16日