一种生长抑制素超表达dna疫苗及构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物DNA疫苗的构建及应用，特别是涉及一种生长抑制素超表达DNA 疫苗及构建方法和应用。 技术背景
[0002] 生长抑素（Somatostatin, SS)基因疫苗，就是通过将编码生长抑素-14的基因克 隆在真核表达载体上构建出的一个重组质粒。然后把该质粒导入动物体内，使SS-14在活 体内表达出有活性的多肽，通过免疫应答产生抗生长抑素的抗体以达到中和内源生长抑素 的目的，从而促进动物生长和泌乳。显然，在这种方法中发挥主要作用的是生长抑素。根据 生长抑素"抑制垂体生长激素（growth hormone，GH)和催乳类激素释放"的作用，近年来国 内关于SS基因免疫在动物繁殖方面的研宄显示，SS基因免疫在促进动物生长和泌乳方面 已初具成效，并取得较为明显的免疫效果。
[0003] 众所周知，乳制品作为一种营养丰富、全面、消化吸收率高的优质液体食品，越来 越受到广大消费者的喜爱，并受到普遍关注。鲜奶中含有丰富的蛋白质、糖类、氨基酸、维生 素、矿物质和酶等，而奶类营养成分排序由高到低依此为水牛奶、羊奶、荷斯坦牛奶、人奶和 马奶。这是因为，与普通牛奶相比，水牛奶的综合营养价值高出近2倍，酪蛋白含量高，胆固 醇低，体细胞数低，干物质含量（17. 5%)高0.5倍，不饱和脂肪酸含量高60-100倍，蛋白质 含量（4% )高0.5倍，乳脂率7. 5%，钙含量高0.3倍，锌含量高12倍，铁含量高78倍，维 生素A含量高32倍（章纯熙2006)。因此，常饮水牛奶能促进更多的酪氨酸钙吸收，有助于 骨骼和智力发育，降低心血管疾病发病率，提高人体免疫力。然而中国牛奶总产量仅占世界 的6. 4%，乳制品消费水平只是世界平均水平的1/5,同时水牛泌乳量、繁殖效率遗传力较 低。上述现状的存在导致必然要对提高乳品质和泌乳性能展开研宄。
[0004] 生长抑素应用到动物泌乳是有例可循的。王艳玲等用SS的化学拮抗剂半胱胺 (cysteamine hydrochloride, CSH)饲喂泌乳中期的荷斯坦奶牛，发现奶牛的日产奶量和饲 料转化率都明显提高了（王艳玲等1999)。据Sun等报导，使用外源SS激素主动免疫泌乳 母羊能显著提高其泌乳量（Sun et al. 1990)。Imgap等在免疫大鼠时发现，只有主动免疫 SS-14才能产生抗SS的抗体并且提高产奶量（Yiet al. 1999)。肖慎华用"激生1号"（即 一种SS重组痘苗病毒活载体疫苗）免疫奶牛，有促进泌乳的作用，并且使奶牛泌乳中后期 的产奶量下降过程减慢，但乳品质未受影响（肖慎华2005)。以上研宄结果表明，使用生长 抑素基因疫苗来提高家畜的泌乳性能是可行的。
[0005] 组织纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator, tpa)是一个特异的定位 于内质网的信号肽，可将其偶联的蛋白直接转运到内质网，避免抗原被加工转运到胞质，目 的蛋白以分泌形式在体内高量表达可保证理想的免疫原性的维持。tpa分子包含4个结构 域，其一是F区，即N末端的47个残基，与调节纤连蛋白的纤维蛋白亲和力的手指结构域同 源；其二是E区，与表皮生长因子同源；其三是K1和K2两个环状结构域；其四是P区，即丝 氨酸蛋白酶区（Pennica et al. 1983)。其中，F区和K2区的功能是与纤维蛋白结合，通过 F区、E区和多糖链的调节下快速清除，而P区则发挥酶活性（Lijnen and Collen 1991)。 随着提取和纯化过程的精确性提高，研宄者发现tpa主要由内皮细胞释放，并且tpa与血 管纤溶酶原激活物（vascular plasminogen activator, vpa)、血液纤溶酶原激活物（blood plasminogen activator, bpa)具有免疫同源性，但却区别于尿激酶型纤溶酶原激活物 (urokinase plasminogen activator, upa) (Rijken et al. 1980)。通过进一步的生化研宄 表明，tpa是血纤蛋白溶解系统中的主要成分，生理性调控纤维蛋白溶解；
[0006] 然而，tpa不仅是血纤蛋白溶解系统中的主要功能因子，其结构还决定了它是一 个高效的信号肽。因此，tpa具备所有信号肽的共有作用，即首先被信号识别蛋白（signal recognition particle, SRP)识别，附着到ER膜上进行信号识别，将处于翻译状态的核 糖体结合在RER膜上，待核糖体完成翻译后，经剪切修饰的成熟蛋白便会沿着导肽途径跨 膜分泌到胞外。此外，作为信号肽，tpa不仅可以使其偶联蛋白变成分泌蛋白，而且便于 在细胞中定位蛋白质和新生肽链（韦雪芳等2006)。目前，23bp的tpa信号肽已用作异 源前导序列，被用作将目的蛋白带入细胞分泌途径的方法（Yang et al. 2001，Costa et al.2006, Jalah et al. 2007, Golden et al. 2008, Luo et al. 2008, Kaur et al. 2009, Seo et al. 2009)。随后，tpa的应用不只局限于细胞水平的研宄，而是不断推广到其他领域，尤 其是为构建防治动物疾病的基因疫苗方面开辟了新的途径。因为诱发基因疫苗产生高效且 大量的免疫反应，取决于表达抗原的分泌能力（Watanabe et al. 2003, Liang et al. 2005); 而在基因疫苗中，tpa信号肽的存在可有效提高重组蛋白向胞外介质的分泌，并诱导机体对 病原体产生很强的免疫反应（Li et al. 1999, Alves et al. 2000, Ashok and Rangarajan 2002)。Sinone M. Costa等将tpa与登革热病毒DENV-2的NS1全长基因进行融合，构建的疫 苗pcTPANSl将重组的NS1蛋白以二聚体形式分泌到周围介质，攻毒后与对照组相比产生更 高水平的NS-1特异性抗体，且以IgGl为主，趋向于Th2型反应（Costa et al. 2006, Costa et al. 2007,姚艳丰2012)。Yang等为提高戊型肝炎疫苗的抗体活性，比较了在戊型肝炎病 毒HVE-pl79N末端融合tpa信号肽和在HVE-pl79C末端插入3个C3d补体重复序列这两种 方式，发现免疫后产生的抗体中和抗原的水平均有提高，融合tpa的戊型肝炎疫苗产生抗 体的时间提早2周（Yang et al. 2010)。然而，关于tpa信号肽的应用并未止于单纯的复 制沿用。Wang等将三聚体蛋白结构域引入质粒载体中时，发现tpa信号肽22位由脯氨酸 突变为丙氨酸或甘氨酸，可提高目的蛋白的表达及分泌情况（Wang et al. 2011)。除此之 外，相关研宄层出不穷，比如含tpa片段的甲型流感疫苗ptPAs/NP，肺结核DNA疫苗，联合电 穿孔免疫的人乳头瘤病毒（papillomavirus, HPV)疫苗等等（Delogu et al. 2002, Luo et al. 2008, Seo et al. 2009)。总之，当载体中的目的基因同tpa彳目号狀偶联后，不仅使目的基 因表达分泌形式蛋白，而且可以增强体液免疫水平（Wang et al. 2004, Costa et al. 2006)。
[0007] 泌乳是一个从乳腺组织分化到发挥作用的生理过程，主要涉及乳腺发育、泌乳 发动与维持以及乳腺退化等环节，而每个阶段都是由激素参与调控的。哺乳动物乳腺 发育是从胎儿时期开始的，此时的腺体和导管系统尚不发达，随着雌性动物个体发育， 雌激素和孕激素水平提高，雌激素促进乳腺导管的生长，而孕激素刺激乳腺腺泡的发育 (Lamote et al.2004)。并且雌激素刺激乳房基质细胞中IGFs的合成，从而促进乳腺 上皮细胞生成（Tucker 2000)。此外，胎盘催乳素（Prolactin，PRL)、促肾上腺皮质激素 (adrenocorticotrophic hormone, ACTH)、促甲状腺激素（thyrotropic hormone, TSH)等激 素以及外界刺激均会影响乳腺细胞增殖。分娩时泌乳发动，此时的显著特征是催乳素和糖 皮质激素的分泌达到高峰。泌乳高峰期以异化分解为主，GH水平升高而胰岛素和甲状腺激 素含量降低；此后同化合成为主（张少英1990)。但是，泌乳的启动与维持阶段主要受PRL 和GH的调控。对反刍动物来说，GH和PRL共同影响泌乳量，GH影响乳脂合成，而PRL影响 乳蛋白和乳糖的合成（Knight 2001)。皮质醇可维持上皮细胞的分泌活性，但未发现其促进 乳汁生成的作用（Sjaastad et al. 2010)。
[0008] 据研宄发现，不仅血浆中含有SS，乳汁中亦可检测到SS的存在。只是血浆中70% 的SS是SS-28,而乳汁中仅有SS-14。这是因为在哺乳动物的乳腺组织中只表达PC-1蛋 白酶基因，PC-1蛋白酶可促使促生长抑素原合成SS_14(Werner et al. 1985, Holst et al. 1990)。Chen et al.的研宄指出，在大鼠的乳腺中可检测出的唯--种神经肽就是SS， 并推断SS可能参与泌乳活动，即乳腺的发育和发挥功能（Chen et al. 1999)。此外，SS可 在雌激素的协同作用下抑制PRL的分泌（Lee and Shin 1996)。
[0009] 就反刍动物来讲，PRL是发动泌乳的必需因素。然而，泌乳一旦被发动起来，PRL便 不再是决定泌乳量高低的限制因素了（张少英1990)。早在1940年，英国科学家便证实GH 可能具有一定的催乳效应（Peel and Bauman 1987)。目前，用垂体或基因重组牛生长激素 (bST)提高泌乳量的实践结果更证明了 GH对泌乳维持的作用。韩正康等对每头泌乳牛每天 注射12. 5-50mg GH，结果发现注射后泌乳牛的乳产量一般可以提高15-24%，而其饲料利用 效率可增长5-20% (韩正康1999)。其实，GH并非直接对乳腺产生影响，而是GH先刺激肝 脏，使肝脏产生IGFs，而IGFs可以影响乳腺活动（苗树君1999)。也就是说，GH通过IGFs 为媒介间接刺激乳腺细胞分化，增强乳腺的泌乳能力。GH具有协调乳腺和乳腺外组织对营 养的竞争，使乳腺外组织的营养物质摄取量降低。在神经内分泌学方面的研宄已经验证，GH 被下丘脑和胃肠道释放的生长激素释放激素（growth hormone releasing hormone, GHRH) 和SS双重调控，即GH的分泌量由GHRH和SS这两种激素的共同作用所平衡。因此，一些研 宄通过调控促进GHRH分泌或抑制SS水平来提高体内GH的含量，从而达到提高泌乳量的效 果（韩正康1999)。很多研宄表明，使用GH注射泌乳牛的方法可以将泌乳量提高20-30%， 经检验此方法并不会影响乳的成分或牛的健康状况（苗树君1999)。Machlin、Baird等研 宄人员分别通过注射提取的GH和DNA重组合成的GH至泌乳母牛体内，使泌乳母牛的泌乳 性能都提高了 10-25% (Machlin 1973, Baird and Durkin 1986)。1981 年美国康奈尔大学 用重组甲硫氨酰牛生长激素（MBS)对奶牛进行一个短期试验，结果表明在增加泌乳量这个 方面，MBS与垂体衍生的GH的作用相当（Peeland Bauman 1987)。Chadio等用基因重组生 产出的牛生长激素（bovine growth hormone, bST)处理泌乳期的山羊，发现除提高泌乳量 外，还提高了乳脂和乳糖的含量，但乳蛋白的含量变化不大（Chadio et al. 2000)。此外， Castigliego等对处于泌乳期的奶牛作用bST，检测到处理奶牛血衆中的bST和IGF-1水平 均显著上升（Castigliego et al.2009)。如今美国已经将重组牛GH推广应用于乳业生产 中，国内亦有类似的研宄取得较好的成绩。比如陆东林等培养大肠杆菌，利用基因重组技术 获取bST的粗提取物，以此处理奶牛一个月，每头牛泌乳量增加1. 65kg/d (约10. 75% )，但 乳脂率、乳密度等指标未见差别（陆东林等1990)。尽管试验方法与检测指标各异，但总得 来说GH可以促进哺乳动物的泌乳力。
[0010] 从以上文献报道来看，tpa信号肽及生长抑素SS基因疫苗联合作用于动物泌乳和 繁殖作用在国内外无相关报道，因此本发明对原有生长抑素基