鸭坦布苏病毒病e-elisa检测试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及以一种坦布苏病毒E蛋白为包被抗原的酶联免疫吸附试验(E-ELISA)检测试剂盒、其制备方法及其应用。本发明试剂盒包含标准阳性对照鸭血清、标准阴性对照鸭血清、坦布苏病毒E蛋白(SEQ ID No.2)所包被的ELISA板、羊抗鸭酶标二抗、TMB底物显色液、终止液。本发明制备的E-ELISA检测试剂盒用于鸭坦布苏病毒感染后的抗体检测。
【专利说明】鸭坦布苏病毒病E-EL ISA检测试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明提供一种以鸭坦布苏病毒E蛋白为包被抗原的酶联免疫吸附试验 (E-ELISA)检测试剂盒，本发明还提供所述试剂盒的制备方法。
【背景技术】
[0002] 黄病毒（Flavivirus)是通过节肢动物传播的，属于黄病毒家族成员。其基因组 由单股正链RNA组成，约为10. 5kb，由一个开放阅读框组成，共编码3个结构蛋白和7个非 结构蛋白，该病毒在Y末端没有poly-A尾巴，病毒粒子由一个外壳蛋白（C)，一个膜蛋白 (E)，一个小的非糖基化蛋白（M)，7个非结构蛋白（NS1，NS2A，NS2B，NS3, NS4A，NS4B，NS5) 组成。在大多数黄病毒中，E蛋白定位于病毒粒子表面，病毒在与受体结合、侵入、细胞融合 过程中起重要作用 [1_2]。
[0003] 2010年4月以来，一种引起产蛋量急剧下降的新型传染病在中国各地的水禽饲养 区大面积爆发，感染鸭的种类包括：北京鸭、番鸭、麻鸭、鹅等[μ]。该病引起高达1〇〇 %的发 病率和小于5%的死亡率，产蛋率在5天内降至10%左右。剖检后发现病鸭具有严重的卵 巢出血、卵巢炎、卵巢萎缩现象。由于该病导致繁殖力的急剧下降给许多养殖场带来了严重 的经济损失。经过病毒分离和鉴定，该病毒鉴定为鸭坦布苏病毒（在本发明中也简称为"坦 布苏病毒"）。
[0004] 该病近年来在我国一些省、市、自治区均有流行，给水禽养殖业造成经济损失惨 重。国内外用于坦布苏病毒病诊断方法为病毒常规分离和鉴定。病毒分离和鉴定技术（诊 断过程需7-10天时间），费时、费力，还需要专业人员和电镜等设备；很难在临床上推广和 应用。为此急需建立一种敏感、准确、快速、简便的鸭坦布苏病毒病抗体检测方法。酶联免 疫吸附试验（ELISA)是广泛用于动物疾病诊断的一种方法，更适合短时间内检测大批量的 血清样品，具有较好的特异性和较高的灵敏度。
[0005] 随着我国人民生活水平的提高，水禽养殖业的迅猛发展，水禽发生坦布苏病毒病 的比率也随之上升。因此，急需研制和开发坦布苏病毒抗体监测试剂盒，为国内的坦布苏病 毒的防治提供技术支持。国外科研小组的报告中，已经证明E蛋白是坦布苏病毒的主要免 疫原性蛋白，免疫原性好，可诱导机体产生免疫保护性抗体。通过对国内不同的分离株序列 的比较分析，设计E蛋白PCR引物，E蛋白原核表达纯化后，以其为包被抗原建立了一种快 速检测坦布苏病毒抗体的ELISA方法。
【发明内容】
[0006] 本发明提供一种以鸭坦布苏病毒E蛋白为包被抗原的酶联免疫吸附试验 (E-ELISA)检测试剂盒，所述试剂盒包含标准对照阳性鸭血清、标准对照阴性鸭血清、鸭坦 布苏病毒E蛋白所包被的ELISA板、羊抗鸭酶标二抗及其它试剂，将标准对照阳性鸭血清、 标准对照阴性鸭血清、鸭坦布苏病毒E蛋白所包被的ELISA板、羊抗鸭酶标二抗及其它试剂 组装，即得到所述试剂盒，其他成分包括样品稀释液，10 X浓缩洗液，TMB底物显色液，终止 液，所述试剂盒特征在于酶标ELISA板的包被抗原为纯化的原核表达的坦布苏病毒E蛋白， 经过定量后包被ELISA板后得到；阳性标准血清为鸭坦布苏病毒免疫无特定病原（SPF)鸭 后得到，阴性标准血清为SPF鸭血清。
[0007] 本发明制备的E-ELISA检测试剂盒用于鸭坦布苏病毒感染后的抗体检测。
[0008] 如上所述，从鸭坦布苏病毒TA株（自行分离）提取RNA，反转录后经坦布苏病毒E 蛋白基因特异性引物P1和P2 (引物序列见表1)扩增得到坦布苏病毒E蛋白的编码核苷酸 序列（SEQ ID No. 1)，将其克隆到适当的原核细胞表达载体中，在相应的原核宿主细胞中进 行表达和纯化，得到坦布苏病毒E蛋白（SEQ ID No. 2)。经过定量后可用于包被ELISA板。
[0009] 为便于纯化，经原核重组表达的坦布苏病毒E蛋白的N端带有His标签，便于纯 化。
[0010] 本领域技术任意应该理解，利用坦布苏病毒E蛋白包被ELISA板可以按照本领域 的常规方法进行。例如，所述的E蛋白包被的ELISA板可以由以下过程制备得到：
[0011] 用〇. 〇5mol/L碳酸盐缓冲液（pH值9. 6)将已纯化的E重组蛋白稀释为5 μ g/ml ; 将含有重组蛋白的碳酸盐缓冲液加入到96孔酶标板中，100μ 1/孔，置于4°C (15?18h); 倾尽96孔板中的液体，加入10mmol/L PBST (pH值7. 4)，200 μ 1/孔，洗3次，每次5min ; 倾尽96孔板中的液体，加入封闭液，置于37°C 2. 5h ;倾尽96孔板中的液体，加入lOmmol/ L PBST (pH值7. 4)，200 μ 1/孔，洗3次，每次5min。彻底倾尽96孔板中的液体，将包被有 His-E蛋白的96孔板置于37°C，干燥2h，放入有干燥剂塑料袋中。
[0012] 标准阴性对照血清为SPF鸭血清，由SPF鸭采血，按照常规方法提取血清。标准阳 性对照血清为用鸭坦布苏病毒（例如，鸭坦布苏病毒TA株）免疫SPF鸭后采血，按照常规 方法提取血清。为用于试剂盒，可以按照常规方法分别大量提取SPF鸭血清和鸭坦布苏病 毒免疫鸭后的血清，并作为标准品储备，无需每次检测重新提取。
[0013] 羊抗鸭酶标二抗可以商购得到，例如，可从KPL公司购买的HRP羊抗鸭二抗（货 号：04-25-06)。
[0014] 所述试剂盒中的其他试剂包括：样品稀释液，10 X浓缩洗液，TMB底物显色液，终 止液。其成分及配制方法如下：
[0015] 1)样品稀释液：每个试剂盒装量1瓶，250ml/瓶；10X浓缩洗液（lOOmmol/ L PBST，ρΗ7·4)的配制过程如下：KH2P042.6g，Na2HP0 4-12H2028.9g，NaC187. lg，去离子水 800ml，调pH值至7. 4,添加去离子水至1L，在此溶液中添加5ml Tween-20。使用时10X浓 缩洗液按照1 : 9(V/V)稀释获得样品稀释液。
[0016] 2)包被液的配制：0· 05mol/L碳酸盐缓冲液，pH值9. 6包被液的配制
[0017] 甲液：Na2C0310. 6g加去离子水溶解至500ml
[0018] 乙液：NaHC038 . 4g加去离子水溶解至500ml
[0019] 取甲液16ml，乙液34ml，加去离子水至200ml，即为0.05mol/L pH值9. 6碳酸盐缓 冲液。
[0020] 3) TMB底物显色液购自天根公司，每个试剂盒装量1瓶/盒50ml。
[0021] 4)终止液：每个试剂盒装量1瓶瓶，250ml/瓶；终止液的配制：2mol/L硫酸溶液 (2mol/L H2S04)，浓硫酸溶液浓度为18mol/L，浓硫酸与去离子水按1 : 9配制即可成为 2mol/L硫酸溶液。
[0022] 5)封闭液的配制：ΚΗ2Ρ040· 26g，Na2HP04-12H202. 89g，NaC18. 71g，脱脂奶粉 50g，去 离子水800ml，调pH值至7. 4,添加去离子水至1L，在此溶液中添加0. 5ml Tween-20。
[0023] 检测的样品为鸭血清。
[0024] 本发明还涉及制备以鸭坦布苏病毒E蛋白为包被抗原的酶联免疫吸附试验 (E-ELISA)检测试剂盒的方法，所述方法包括下述步骤：
[0025] (1)原核表达并纯化鸭坦布苏病毒E蛋白，取适量的鸭坦布苏病毒E蛋白包被 ELISA 板；
[0026] (2)从SPF鸭提取血清作为标准对照阴性血清，从用鸭坦布苏病毒（例如，鸭坦布 苏病毒TA株）免疫后的SPF鸭提取血清作为标准对照阳性血清；
[0027] (3)商购得到羊抗鸭酶标二抗，例如，但不限于，KPL公司购买的HR羊抗鸭二抗 (货号：04-25-06);
[0028] (4)配制样品稀释液、10 X浓缩洗液、TMB底物显色液和终止液：
[0029] 样品稀释液：每个试剂盒装量1瓶，250ml/瓶；10X浓缩洗液（100mm〇l/L PBST， pH7. 4)的配制过程如下：KH2P042. 6g，Na2HP04-12H2028. 9g，NaC187. lg，去离子水 800ml，调 pH值至7. 4,添加去离子水至1L，在此溶液中添加5ml Tween-20。使用时10X浓缩洗液按 照1 : 9(V/V)稀释获得样品稀释液；
[0030] 包被液的配制：〇· 05mol/L碳酸盐缓冲液，pH值9. 6包被液的配制
[0031] 甲液：Na2C0310. 6g加去离子水溶解至500ml
[0032] 乙液：NaHC038 . 4g加去离子水溶解至500ml
[0033] 取甲液16ml，乙液34ml，加去离子水至200ml，即为0.05mol/L pH值9. 6碳酸盐缓 冲液；
[0034] TMB底物显色液购自天根公司，每个试剂盒装量1瓶/盒50ml ;
[0035] 终止液：每个试剂盒装量1瓶，250ml/瓶；终止液的配制：2mol/L硫酸溶液（2mol/ L H2S04)，浓硫酸溶液浓度为18mol/L，浓硫酸与去离子水按1 : 9配制即可成为2mol/L硫 酸溶液；
[0036] 封闭液的配制：KH2P040 . 26g，Na2HP04-12H202. 89g，NaC18. 71g，脱脂奶粉 50g，去离 子水800ml，调pH值至7. 4,添加去离子水至1L，在此溶液中添加0. 5ml Tween-20 ;
[0037] (5)组装：将上述鸭坦布苏病毒E蛋白包被的ELISA板与适量的（2)-⑷的成分 组装成试剂盒。
[0038] 因此，本发明提供下列各项：
[0039] 1. 一种鸭坦布苏病毒病E-ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包含标准阳性对照鸭血 清、标准阴性对照鸭血清、鸭坦布苏病毒E蛋白所包被的ELISA板、羊抗鸭酶标二抗及其他 试剂。
[0040] 2.第1项所述的试剂盒，其中所述标准阳性对照鸭血清为提取自用鸭坦布苏病毒 免疫的SPF鸭的血清，所述标准阴性对照鸭血清为提取自SPF鸭的血清。
[0041] 3.第1项所述的试剂盒，其中所述鸭坦布苏病毒E蛋白所包被的ELISA板通过用 在原核表达系统中重组表达的鸭坦布苏病毒E蛋白包被ELISA板制得。
[0042] 4.第3项所述的试剂盒，其中所述鸭坦布苏病毒E蛋白通过将SEQ ID No. 1所示 的编码坦布苏病毒E蛋白的核苷酸序列克隆在原核细胞表达载体中并在原核细胞中表达 制得。
[0043] 5.第1项所述的试剂盒，其中所述羊抗鸭酶标二抗为HR标记的羊抗鸭二抗。
[0044] 6.第1项所述的试剂盒，其中所述其他试剂包括样品稀释液、10X浓缩洗液、TMB 底物显色液、终止液。
[0045] 7.第1项所述的试剂盒，所述试剂盒的检测方法包括：
[0046] (1)反应步骤：将待测鸭血清样品、标准阳性对照鸭血清和标准阴性对照鸭血清 分别加入所述鸭坦布苏病毒E蛋白所包被的ELISA板的独立的孔中，在37°C反应lh ;
[0047] (2)与二抗反应步骤：将每孔洗涤后，分别加入所述羊抗鸭酶标二抗，在37°C反应 lh ;
[0048] (3)显色步骤：将每孔洗涤后，分别加入TMB底物显色液进行显色反应；
[0049] (4)读数步骤：终止显色反应，在酶标仪上读数；
[0050] (5)判断步骤：待测鸭血清样品反应孔的0D值与标准阴性对照鸭血清反应孔的0D 值的比例大于等于2. 1时，表示待测鸭血清样品为阳性，说明待测鸭感染了鸭坦布苏病毒； 上述比值小于2. 1时，表示待测鸭血清样品为阴性，说明待测鸭没有感染鸭坦布苏病毒。
[0051] 本发明的有益效果：
[0052] 与费时费力的现有检测鸭坦布苏病毒的方法相比较，利用本发明的试剂盒检测鸭 坦布苏病毒的方法具有下述优点：
[0053] (1)省时，只须2小时，即可知道检测结果；
[0054] (2)无需分离病毒，对待检鸭血清直接进行检测，操作简单；
[0055] (3)可以同时检测多份样品，进行高通量检测；
[0056] (4)本发明的试剂盒具有针对鸭坦布苏病毒的高特异性，检测不受其他病毒感染 的影响，准确度高；
【专利附图】
【附图说明】
[0057] 从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
[0058] 图1.纯化的E蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析；泳带1，蛋白分子量标准； 泳带2,纯化的E蛋白；泳带3,纯化的E蛋白。
【具体实施方式】
[0059] 下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发 明并不限于这些具体的实施例。
[0060] 下述实施例中所用的试剂如无特别说明，均为市售分析纯级别的试齐IJ。
[0061] 实施例1.原核表达坦布苏病毒E蛋白
[0062] 1)按TRIZ0L说明书提取鸭坦布苏病毒TA株（由张云和刘明在山东泰安原始采 集，现保存于哈尔滨兽医研究所）RNA，反转录后经坦布苏病毒E蛋白基因特异性引物P1和 P2 (TaKaRa公司合成）扩增。1 %琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，与原核表达质粒pET32a (购 自Novagen公司）连接获得重组质粒pET32-E。
[0063] 表1.扩增坦布苏病毒E蛋白基因的引物序列
[0064]
【权利要求】
1. 一种鸭坦布苏病毒病E-ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包含标准阳性对照鸭血清、 标准阴性对照鸭血清、鸭坦布苏病毒E蛋白所包被的ELISA板、羊抗鸭酶标二抗及其他试 剂。
2. 权利要求1所述的试剂盒，其中所述标准阳性对照鸭血清为提取自用鸭坦布苏病毒 免疫的SPF鸭的血清，所述标准阴性对照鸭血清为提取自SPF鸭的血清。
3. 权利要求1所述的试剂盒，其中所述鸭坦布苏病毒E蛋白所包被的ELISA板通过用 在原核表达系统中重组表达的鸭坦布苏病毒E蛋白包被ELISA板制得。
4. 权利要求3所述的试剂盒，其中所述鸭坦布苏病毒E蛋白通过将SEQ ID No. 1所示 的编码坦布苏病毒E蛋白的核苷酸序列克隆在原核细胞表达载体中并在原核细胞中表达 制得。
5. 权利要求1所述的试剂盒，其中所述羊抗鸭酶标二抗为HRP标记的羊抗鸭二抗。
6. 权利要求1所述的试剂盒，其中所述其他试剂包括样品稀释液、10X浓缩洗液、TMB 底物显色液、终止液。
7. 权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒的检测方法包括： (1) 反应步骤：将待测鸭血清样品、标准阳性对照鸭血清和标准阴性对照鸭血清分别 加入所述鸭坦布苏病毒E蛋白所包被的ELISA板的独立的孔中，在37°C反应lh ; (2) 与二抗反应步骤：将每孔洗涤后，分别加入所述羊抗鸭酶标二抗，在37°C反应lh ; (3) 显色步骤：将每孔洗涤后，分别加入TMB底物显色液进行显色反应； (4) 读数步骤：终止显色反应，在酶标仪上读数； (5) 判断步骤：待测鸭血清样品反应孔的0D值与标准阴性对照鸭血清反应孔的0D值 的比例大于等于2. 1时，表示待测鸭血清样品为阳性，说明待测鸭感染了鸭坦布苏病毒；上 述比值小于2. 1时，表示待测鸭血清样品为阴性，说明待测鸭没有感染鸭坦布苏病毒。
【文档编号】G01N33/543GK104280551SQ201310290098
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月11日 优先权日:2013年7月11日
【发明者】张云, 刘明, 陈志峰 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所