Crp非免疫纳米金检测试纸条及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了用于检测CRP的非免疫纳米金试纸条的制备方法，包括：将标记有生物素的第一寡核苷酸标记到纳米金颗粒上并喷在结合垫上，将第二寡核苷酸喷在硝酸纤维膜上形成检测线并将亲和素喷在硝酸纤维膜上形成质控线，将样品垫、纳米金结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫依次排列固定在支撑板上，由此制成。另外，本发明还提供了由该方法制成的试纸条及其应用等。
【专利说明】CRP非免疫纳米金检测试纸条及其制备
【技术领域】
[0001] 本发明属于医疗检测器械领域，具体而言，本发明涉及检测CRP的非免疫纳米金 试纸条及其制备方法。
【背景技术】
[0002] C-反应蛋白（本文简称CRP)是由5个相同的亚单位以非共价键结合而成的血清 β球蛋白。该蛋白由肝细胞合成，在人的血清、脑脊液、胸腹水等多种体液中均可测出。正常 人CRP的浓度很低（0. 068?8. 2mg/L)，但在组织损伤、急性感染发生后6?8h开始升高， 24?48h达峰值，可达正常值的几百倍甚至上千倍，升高幅度与感染程度成正比，炎症治愈 后浓度迅速下降，7?12天可恢复正常水平；CRP在病毒感染时不会升高，其变化不受病人 的个体差异、机体状态和治疗药物的影响。所以，CRP的持续增高暗示机体存在慢性炎症或 自身免疫疾病，如常规C反应蛋白试验应用于存在细菌或病毒感染、慢性炎症性疾病（如： 类风湿关节炎）风险的患者，其需要的检测区间为l〇-l〇〇〇mg/L。另外，CRP也是诊断和预 测心血管事件发生、发展的有效指标，根据美国心脏学会、美国疾病预防与控制中心定义的 风险标准，检测低于1. 〇mg/L为低风险，检测1. 0-3. Omg/L为一般风险，检测高于3. Omg/L 为高风险。近年来，主要采用ELISA检测CRP，其灵敏度通常可达到0. 15mg/L。
[0003] ELISA检测需要试验室设备，用时长，不容易用于日常即时检测。所以，中国专利 201010236071和201120160566分别公开了 CRP胶体金免疫层析检测试纸（条），通过显色 观察来判读，无需试验室设备，方便随时随地使用。这些文献公开的都是基于抗原-抗体反 应的免疫学原理进行的，其中在硝酸纤维素膜上设有包被有C反应蛋白抗体的检测线。然 而，本发明人研究发现，抗体、抗原等大蛋白质分子受热容易变性，尤其在日常可接触的高 温（如：40°C)下，可加速稳定性丧失，其检测灵敏度甚至可以下降两个数量级，而试纸条的 使用和储运环境恰恰比较随意而恶劣，因此不利于长时间保存，因此不方便日常检测。
[0004] 本发明的发明人经过长期艰苦研究，开发出了一种新的检测CRP的非免疫纳米金 试纸条的制备方法，其中利用寡核苷酸而非抗体分子来标记纳米金颗粒和检测线。由此制 备获得的非免疫纳米金试纸条使用简便、灵敏、出结果快捷、无需复杂仪器及特别技巧，尤 其是稳定好，即使在较恶劣环境下长期保存、运输，也基本不影响检测灵敏度，从而便于在 日常使用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种新的纳米金试纸条的制备方法，该试纸条能够用于检 测CRP，而且它不采用抗原-抗体检测的免疫学原理。另外，本发明还提供了由该方法制备 的试纸条以及其应用等。
[0006] 具体而言，在第一方面，本发明提供了检测CRP的非免疫纳米金试纸条的制备方 法，所述试纸条包括样品垫、纳米金结合垫、硝酸纤维膜、吸水垫和支撑板，其特征在于，该 制备方法包括：
[0007] A，将标记有生物素的第一寡核苷酸标记到纳米金颗粒上，获得第一寡核苷酸标记 的纳米金颗粒；
[0008] B，将步骤A获得的第一寡核苷酸标记的纳米金颗粒喷在结合垫上，获得纳米金结 合垫；
[0009] C，将第二寡核苷酸喷在硝酸纤维膜上形成检测线，将亲和素喷在硝酸纤维膜上形 成质控线，获得带有检测线和质控线的硝酸纤维膜；和
[0010] D，以样品垫、纳米金结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维膜和吸水垫这4部 件依次为序排列，相邻两部件间边缘接触或重合，固定在支撑板上，制成该检测CRP的非免 疫纳米金检测试纸条，
[0011] 其中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的序列不同。
[0012] 本发明采用非免疫机理，利用寡（聚）核苷酸与CRP的特异结合，来实现试纸条对 CRP的检测。寡核苷酸能够为本领域技术人员操作，可以在其末端进行标记，如第一寡核苷 酸的5'末端标记生物素。在本文中，如无相反指示，寡核苷酸为单链寡核苷酸，其长度为 10-40nt，优选为 12-35nt，如 16-30nt。
[0013] 亲和素是能与生物素结合的物质，有多种市售的亲和素可供选择。优选在本发明 第一方面的方法中，亲和素是链球菌亲和素。
[0014] 检测线和质控线不能重合。优选在本发明第一方面的方法中，检测线和质控线间 距为〇· 4-lcm，优选为0· 6cm。
[0015] 理论上，样品垫、纳米金结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维膜和吸水垫这4 部件中相邻两部件边缘接触，就能完成纳米金颗粒的转移，但是优选边缘重合。优选在本发 明第一方面的方法中，重合1-3_,如重合2_。
[0016] 固定可以采用热层压技术固定，这对于本发明的寡核苷酸的热稳定性好来说，是 特别有益的。但是由于现有试纸条通常采用粘合固定，相应设备也多为粘合固定设备，所以 也优选采用粘合固定。
[0017] 优选在本发明第一方面的方法中，样品垫是经过样品垫处理液浸泡处理的，即用 样品垫处理液浸泡后再晾干或烘干。进一步优选其中，样品垫处理液是含1-5% (W/W)酪蛋 白、0. 1-1 % (W/W)聚乙烯醇和 0. 05-0. 5 % (W/W)吐温-20 的 PBS 溶液（pH7. 0-7. 6)，更优 选其中样品垫处理液是含3 % (W/W)酪蛋白、0.5% (W/W)聚乙烯醇和0. 1% (W/W)吐温-20 的 20mMPBS 溶液（ρΗ7· 2)。
[0018] 为了喷洒均匀，优选是配制成溶液进行喷洒的。所以优选在本发明第一方面的方 法中，第一寡核苷酸标记的纳米金颗粒是稀释成0. 〇5-2mg/ml (优选0. 25mg/ml)的溶液，以 10-100微升/cm(优选50微升/cm)的量喷在结合垫上。也优选在本发明第一方面的方法 中，第二寡核苷酸是稀释成〇. l-2mg/ml (优选0. 5mg/ml)的溶液，以0. 5-5微升/cm (优选 1微升/cm)的量喷在硝酸纤维膜上。还优选在本发明第一方面的方法中，亲和素是稀释成 0. 2-3mg/ml (优选lmg/ml)的溶液，以0. 5-5微升/cm (优选1微升/cm)的量喷在硝酸纤维 膜上。
[0019] 为了使得检测线和质控线在硝酸纤维膜上结合牢固，并提高检测的灵敏度，优选 对硝酸纤维膜进行浸泡处理。优选在本发明第一方面的方法中，步骤C是将第二寡核苷酸 喷在硝酸纤维膜上形成检测线，将亲和素（优选是链球菌亲和素）喷在硝酸纤维膜上形成 质控线，晾干后紫外线交联并浸泡在封闭液中，然后烘干，获得带有检测线和质控线的硝酸 纤维膜。
[0020] 优选在本发明第一方面的方法中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的序列分别选自 如下序列：
[0021] 5, -atgggggggtatgatt-3，；
[0022] 5' -atgggtgggtatgggt-3' ；
[0023] 5' -aagcgggtgggtgtgt-3' ；
[0024] 5' -tgggtggggggtgggggttgttgggctgtt-3' ；
[0025] 5' -tgggtgggcggggtgggttgttgggcggtt-3' ；
[0026] 5' -tgggggagggggcggggccgtagggtgggt-3,；
[0027] 5' -cgggtggggggtgggggtcgccgggtcgct-3' ；或
[0028] 5' -ggggtggggggtgggggtagttgggtcgct-3, 。
[0029] 更优选第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的序列选自实施例中检测灵敏度高（如灵 敏度不小于lmg/L，优选不小于0. 5mg/L，更优选不小于0. lmg/L)的序列（对）。当然，日常 个体使用中，由于某些体液中正常的CRP含量较高，灵敏度并非越高越好；而对于合并样品 进行筛查，高灵敏度是特别有益的。
[0030] 另外优选在本发明第一方面的方法中，纳米金结合垫与硝酸纤维膜重合在硝酸纤 维膜靠近检测线的一侧，而且吸水垫与硝酸纤维膜重合在硝酸纤维膜靠近质控线的一侧。
[0031] 在第二方面，本发明提供了本发明第一方面的方法制备的纳米金试纸条。在本发 明的实施例1、2和/或3中，给出了多种本发明的纳米金试纸条的制备方法，由此可以制备 成不同灵敏度的纳米金试纸条，可供不同检测要求下使用。
[0032] 在第三方面，本发明提供了本发明第二方面的纳米金试纸条在制备用于检测CRP 的试剂盒中的应用，另外也提供了本发明第二方面的纳米金试纸条在检测CRP的非诊断方 法中的应用。
[0033] 优选在本发明第三方面的应用中，该试剂盒还包括标准图样片。优选其中，标准图 样片是印有〇、〇. l、〇. 3、0. 5、1、2、3和5mg/L CRP溶液上样于本发明第二方面的纳米金试纸 条后检测线显色的照片。尽管只需要检测线的标准图来比较，但是本发明人发现，许多用 户由于没有使用经验，很难通过单一线条的比较来区分出准确的线条，而如果加入了质控 线的照片，两条线条的对比，就容易得多。所以更优选其中，标准图样片是印有〇、〇. 1、〇. 3、 0. 5、1、2、3和5mg/L CRP溶液上样于本发明第二方面的纳米金试纸条后检测线和质控线显 色的照片。
[0034]另外，本发明也提供了本发明第二方面的纳米金试纸条和上述标准图样片联合在 制备用于检测CRP的试剂盒中的应用。
[0035] 本发明带来的有益效果包括：
[0036] 1，制备过程简便，可以利用现有试纸条制备的设备，尤其是合成寡核苷酸比合成 或纯化抗体更方便，因而便于规模化生产。
[0037] 2,本发明制备的纳米金试纸条检测快速而且无需特殊设备和培训，全部检测过程 约仅需5-10分钟，常人日常操作即可完成。
[0038] 3,本发明制备的纳米金试纸条可以适应不同的灵敏度要求，而且灵敏度高，没有 出现假阳性结果，检测准确率高。
[0039] 4,本发明制备的纳米金试纸条的热稳定性高，对储存条件的要求不高，便于日常 条件储存。
[0040] 5，商品化容易，适合于大、中、小型医院、诊所以及家庭使用，便于推广。
[0041] 为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指 出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论 述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。
[0042] 另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文 内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
【专利附图】
【附图说明】
[0043] 图1显示了本发明的试纸条的结构示意图，其中，1表示样品垫，2表示纳米金结合 垫，3表示硝酸纤维膜，4表示检测线，5表示质控线，6表示吸水垫，7表示支撑板。
【具体实施方式】
[0044] 以下将以举例形式进行说明，如有未详尽之处，可以参见常用的实验手册（如， 《分子克隆实验手册》）以及所用试剂和仪器的厂商说明书。其中，所有化学试剂均采用 分析级，实验用水经Milli-XQ过滤，各试剂均和材料可以商用渠道获得，具体而言：1_乙 基-3-(3-二甲基氨丙基）碳二亚胺（简称为EDC)购自Alfa Aesar公司（美国）；金纳米 颗粒溶液（粒径为30nm，有羧基标记）购自BB International (美国）；链球菌亲和素购自 Sigma-Aldrich(美国）；寡核苷酸以及生物素标记的寡核苷酸均委托Sigma-Aldrich公司 (USA)合成；试纸条所用基材均可购自上海金标生物技术有限公司。
[0045] 实施例1第一寡核苷酸标记的纳米金颗粒的制备
[0046] 取12微升金纳米颗粒溶液置于1. 5ml离心管中，1500rpm离心lOmin后，弃上清， 加入300微升含0. 03M EDC的0. 1M咪唑缓冲液（pH7. 0)，缓慢摇动离心管20分钟，然后再 将12pmol的第一寡核苷酸（其序列为5' -atgggggggtatgatt-3'（编号1)，其5'端标记有 生物素）加入，混合后于37°C孵育1小时，期间连续缓慢摇动离心管。5000rpm离心30min 后，弃上清，然后洗涤三次（每次加入300微升含100mM NaCl的PBS溶液（pH7. 2)，然后离 心并弃上清），然后加入240微升含0. 5M NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液（pH8. 0)，轻微震荡 混合均匀后，即制得第一寡核苷酸标记的纳米金颗粒，其中第一寡核苷酸浓度约为〇. 25mg/ ml〇
[0047] 实施例2本发明的试纸条的制备
[0048]将第二寡核苷酸（其序列为 5'_cgggtggggggtgggggtcgccgggtcgct_3'（编号 7)) 用20mM PBS(pH7. 2)稀释至0. 5mg/ml，以1微升/cm的量横向（以最终制备的试纸条长边方 向为纵向，短边方向为横向，下同）喷在硝酸纤维膜上形成检测线；将链球菌亲和素用20mM PBS(pH7. 2)稀释至lmg/ml，以1微升/cm的量喷在硝酸纤维膜上距检测线0. 6cm处，形成 质控线。晾干后，于紫外线交联仪（可购自美国UVP公司，CL-1000)中按默认程序进行紫 外线照射（120, OOOmicrojoules/cm2)，然后浸泡在封闭液（配方：SSC(6X)，Denhardt' s溶 液（5X)，SDS(0. 5%)，鲑鱼精DNA(100ug/ml))中10min，于30°C烘干8小时，即获得带有检 测线和质控线的硝酸纤维膜3。
[0049] 将实施例1制备的第一寡核苷酸标记的纳米金颗粒以50微升/cm的量横向喷在 玻璃纤维膜（结合垫）上，晾干后，即获得纳米金结合垫2。
[0050] 将硝酸纤维膜浸泡在样品垫处理液（含3% (W/W)酪蛋白、0. 5% (W/W)聚乙烯醇 和0. 1% (W/W)吐温-20的20mMPBS溶液（pH7. 2))中1小时，然后于30°C烘干8小时，即 获得样品垫1。
[0051] 另取棉浆纸作为吸水垫6,剪裁PVC板作为支撑板7。
[0052] 如图1所示，以样品垫1、纳米金结合垫2、硝酸纤维膜3和吸水垫6这4个部件依 次为序排列，相邻两者边缘间重合2mm，纳米金结合垫2与硝酸纤维膜3重合在硝酸纤维膜 靠近检测线4的一侧，吸水垫6与硝酸纤维膜3重合在硝酸纤维膜靠近质控线5的一侧，然 后粘贴在支撑板7上，制成了非免疫纳米金检测试纸条。
[0053] 实施例3本发明的试纸条的质量鉴定
[0054] 制备本发明的其他试纸条，其参照实施例1和2的方法，所不同的是第一寡核苷 酸和第二寡核苷酸的序列换成以下表1所列的不同序列，制备的试纸条编号以第一寡核苷 酸和第二寡核苷酸的序列组合构成，如采用编号8的序列作为第一寡核苷酸和编号3的序 列作为第二寡核苷酸制备的试纸条，命名为8-3 ;又如，实施例1和2制备的试纸条命名为 1-7。
[0055] 表1寡核苷酸的序列表
[0056]
【权利要求】
1. 检测CRP的非免疫纳米金试纸条的制备方法，所述试纸条包括样品垫、纳米金结合 垫、硝酸纤维膜、吸水垫和支撑板，其特征在于，该制备方法包括： A，将标记有生物素的第一寡核苷酸标记到纳米金颗粒上，获得第一寡核苷酸标记的纳 米金颗粒； B，将步骤A获得的第一寡核苷酸标记的纳米金颗粒喷在结合垫上，获得纳米金结合 垫； C，将第二寡核苷酸喷在硝酸纤维膜上形成检测线，将亲和素（优选是链球菌亲和素） 喷在硝酸纤维膜上形成质控线，获得带有检测线和质控线的硝酸纤维膜，其中检测线和质 控线间距为〇· 4-lcm，优选为0· 6cm ;和 D，以样品垫、纳米金结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维膜和吸水垫这4部件依 次为序排列，相邻两部件间边缘接触或重合（优选重合l_3mm，如重合2mm)，固定（如热层 压固定或粘合固定）在支撑板上，制成该检测CRP的非免疫纳米金检测试纸条， 其中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的序列不同。
2. 权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中样品垫是经过样品垫处理液浸 泡处理的，优选其中样品垫处理液是含1-5% (W/W)酪蛋白、0. 1-1% (W/W)聚乙烯醇和 0. 05-0. 5 % (W/W)吐温-20的PBS溶液（pH7. 0-7. 6)，更优选其中样品垫处理液是含3% (W/W)酪蛋白、0. 5% (W/W)聚乙烯醇和 0. 1% (W/W)吐温-20 的 20mMPBS 溶液（pH7. 2)。
3. 权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中第一寡核苷酸标记的纳米金颗粒是 稀释成0· 05-2mg/ml (优选0· 25mg/ml)的溶液以10-100微升/cm (优选50微升/cm)的量 喷在结合垫上。
4. 权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中第二寡核苷酸是稀释成0. l_2mg/ ml (优选0. 5mg/ml)的溶液以0. 5-5微升/cm (优选1微升/cm)的量喷在硝酸纤维膜上。
5. 权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中亲和素是稀释成0. 2-3mg/ml (优选 lmg/ml)的溶液以0. 5-5微升/cm (优选1微升/cm)的量喷在硝酸纤维膜上。
6. 权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中步骤C是将第二寡核苷酸喷在硝酸纤 维膜上形成检测线，将亲和素（优选是链球菌亲和素）喷在硝酸纤维膜上形成质控线，晾干 后紫外线交联并浸泡在封闭液中，然后烘干，获得带有检测线和质控线的硝酸纤维膜。
7. 权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的序 列分别选自如下序列： 5, _atgggggggtatgatt_3，； 5, _atgggtgggtatgggt_3，； 5, _aagcgggtgggtgtgt_3，； -tgggtggggggtgggggttgttgggctgtt-3,； -tgggtgggcggggtgggttgttgggcggtt-3,； -tgggggagggggcggggccgtagggtgggt-3,； _cgggtggggggtgggggtcgccgggtcgct-3,;或 5' -ggggtggggggtgggggtagttgggtcgct-3,〇
8. 权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中纳米金结合垫与硝酸纤维膜重合在 硝酸纤维膜靠近检测线的一侧，而且吸水垫与硝酸纤维膜重合在硝酸纤维膜靠近质控线的 一侧。
9. 权利要求1-9之任一所述的制备方法制备的纳米金试纸条，优选该纳米金试纸条是 如实施例1、2和/或3制备的。
10. 权利要求9所述的纳米金试纸条在制备用于检测CRP的试剂盒中的应用，优选其中 该试剂盒还包括标准图样片。
【文档编号】G01N33/68GK104280550SQ201310289752
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月11日 优先权日:2013年7月11日
【发明者】游绍进, 陈琼, 张钲, 李为 申请人:苏州友林生物科技有限公司