专利名称：奶牛胚胎性别鉴定的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于一种实时荧光PCR检测奶牛胚胎性别的方法和试剂盒。
背景技术：
自从1985年美国Cetus公司和加利福利亚大学联合创建的聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction,简称PCR)问世以来，这一在模板DNA、引物、 脱氧核糖核苷三磷酸以及DNA聚合酶存在下进行的体外酶促扩增DNA的技 术立即引起了广泛的兴趣和重视，在全球范围内得到广泛应用和发展，迅速进 入分子生物学、法医学、考古学、以及遗传病和传染性病原体的核酸检测等各 个领域。目前，在核酸检测领域传统的"PCR+电泳"或"PCR+探针杂交"检 测方法已经广泛应用，但是该传统方法由于实际应用中易引起的非特异性扩 增、实验中易受外源核酸的污染而造成结果假阳性现象、同时操作比较繁冗， 使得该技术在实际应用尤其是临床检测受到很大限制。
实时荧光PCR是1996年美国应用生物系统公司在PCR基础上发展的新 技术，在核酸检测中和传统PCR电泳检测方法比较具有许多优点(1)其采 用的闭管检测在临床诊断中的优势尤其明显，消除了传统PCR电泳技术扩增 产物的污染问题，提高了检测准备度；(2) PCR体系中增加了荧光探针，提高 了检测的特异性和灵敏度；(3)定量范围极宽，样本无需做梯度稀释，可以进 行准确的定量检测；(4)操作迅速，无需传统PCR的后处理检测步骤，自动 化程度高。目前实时荧光PCR已在各种疾病病原体的基因检测及基因遗传突 变分析等领域中广泛应用。
基于TaqMan水解荧光探针的实时荧光PCR技术利用了 Taq酶的5'外切酶活性，合成一个能与PCR产物杂交的探针，该探针的5'端标记一个荧光分
子，3'端标记另一个荧光分子。其中3'端荧光分子能够吸收5'端荧光分子发出 的荧光，因此正常情况下该探针检测不到的5'端荧光分子发出的荧光，只能检 测到3'端荧光分子的荧光信号，但当溶液中有PCR产物(模板)时，该探针 与模板结合，激活Taq酶的5'外切酶活性，将探针5'端连接的荧光分子从探针 上切割下来，从而发出荧光，切割的荧光分子数与PCR产物的数量成比例。 因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。
怀孕奶牛中胎牛性别以及待移植胚胎性别鉴定一直是动物繁殖和良种培 育过程中需要关注的问题，蕴含着巨大的经济利益。位于奶牛基因组Y染色体 上的特异性公牛性别决定基因(S7)的发现使得奶牛的性别控制和胚胎性别鉴 定技术发展进入了一个新的阶段。最近10年来发展的利用wy基因和PCR技 术对奶牛早期胚胎进行性别鉴定是一种有效的方法，其中有的己经申请国内专 利(申请号200410014222.5)并制成检测试剂盒。其主要操作步骤是从待检 测胚胎取部分卵裂球用以提取DNA，再用so;基因的片段作引物，以所取的胚 胎细胞DNA为模板进行PCR或巢式PCR扩增，最后用矽特异探针对扩增的 产物进行检测。雄性胚胎显示呈阳性，雌性胚胎为阴性。也可对扩增产物进行 电泳，根据^y扩增条带的有无判断胚胎为雄、雌性。随着这项技术的深入研 究和进展，目前只需几个卵裂球即可完成检测的取样，减少了对胚胎的伤害。 经鉴定的胚胎，移植后产犊性别的准确率可达95%以上。
但是，上述性别鉴定技术及试剂盒存在的主要问题是对实验室条件和操作 人员技术水平要求较高，否则会有假阳性结果出现、降低检测准确率；其次， 试剂盒操作繁琐，所需时间较长；最后，试剂盒只能对待移植的胚胎细胞进行 鉴定，不能应用于怀孕奶牛中的胎牛性别鉴定。由于上述存在的局限性，目前尚不适于作为成熟技术推广使用。有鉴于此，本发明提供了一种更方便、更准 确的方法和试剂盒用于奶牛胚胎和胎牛性别鉴定。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用实时荧光PCR技术进行奶牛胚胎性别鉴定 的方法和试剂盒，以及所需的引物和探针，从而可以方便快速准确地对怀孕奶 牛中的胎牛性别、移植胚胎性别进行鉴定。本发明的技术内容如下
1. 实时荧光PCR引物探针的设计与合成
通过对GenBank中奶牛w少基因序列査询，用美国Invitrogen公司Vector NTI软件对各种来源的奶牛w少基因序列进行比对后发现，其序列高度保守并 具有很好的同源性，按照TaqMan荧光PCR设计的原则，设计了一对奶牛特异 性引物扩增"基因上的182 bp的区域，并用特异性TaqMan水解探针法实时 检测。引物和探针碱基序列如下
上游弓I物为5 ， ACg CCT TCA TTg TgT ggT 3'
下游引物为5， Cgg gTA TTT gTC TCg gTg TA 3 ，
探针为5 ， FAM-CTA gTA gTC TCT gTg CCT CCT CAA-TAMRA 3'，其中探 针5'端标记FAM (6-羧基荧光素)，3'端标记TAMRA (四甲基-6-羧基罗丹明)。
上述引物探针由商业序列合成公司(上海生工生物工程技术服务有限公司 等)合成后用无菌双蒸水溶解至浓度为25)imol/L， 一2(TC保存。
2. 试剂盒主要成分
含有上述引物和探针的荧光PCR试剂盒(20 Test),其主要成分如下
(1) 核酸浓縮液1.5mlX10管，主要成分为13%PEG8000、 1.6 mol/LNaCl。
(2) 核酸提取液1.5 mix 1管，主要成分为50 mmol/LNaOH、 5 mMEDTA、1% Triton X-100 、 1 % NP-40 。
(3) PCR反应缓冲液0.5 ml,主要成分有20 mmol/1 Tris-HCl pH8.3(25°C)、 100 mmol/L KC1, 70 mmol/L MgCl2、 0.04Q/o(W/V)明胶、0.4 mM脱氧核糖核 苷三磷酸dNTP(dATP、dUTP、dCTP、dGTP)、0.4 nmol/L引物、0.2 pmol/L探针。
(4) Taq酶50pl，含Taq DNA聚合酶50 U，尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶) 12 U。
(5) 阴性对照300 ^1，为无菌双蒸水。
(6) 阳性对照300 ^1，为公牛全血白细胞中提取的DNA溶液，采用上海生工 全血DNA提取试剂盒进行。
3.样本的处理和实时荧光PCR检测
上述试剂盒在性别鉴定过程中的使用步骤为
(1) 样本处理
取怀孕12周以上奶牛血浆750 |il，加入相同体积核酸浓縮液，旋涡振荡 混匀，8000r/min离心6min弃上清，加入50 |il核酸提取液，旋涡振荡混匀后 IO(TC保持10 min， 8000 r/min离心6 min取上清作为PCR模板检测。
如果是胚胎移植性别鉴定，可取1 2个细胞直接加入25 (il核酸提取液， 旋涡振荡混匀后IO(TC保持10 min， 8000 r/min离心6 min取上清作为PCR模
(2) 扩增检测
按照待检测样品数n+3，取PCR反应缓冲液15X (n+3)、Taq酶2X (n+3) 组分，混匀后每个扩增管分装17 pl，分别加入试剂盒阴性对照、阳性对照以及上述处理好的n个样品模板各13pl。每个反应扩增管体积为30 ^，将上述 扩增管放到实时荧光PCR仪器上按照50。C 2min、 94°C 2 min后94°C 5 sec、 60°C 30sec循环40次的程序运行。运行结束后阴性对照为阴性、阳性对照为 阳性，样本扩增为阳性者为雄性，否则为雌性。 4.有益效果
本发明利用所设计的特异性引物探针，通过优化反应体系和扩增条件研制 成实时荧光PCR奶牛性别鉴定试剂盒，和目前现有的奶牛胚胎性别鉴定技术 专利比较，其主要特点如下
(1) 采用基于TaqMan水解探针的实时荧光PCR技术，和传统PCR方法比 较其灵敏度更高，并且操作简便快速；
(2) 采用奶牛性别决定基因特异性引物和探针，避免人和其它动物来源核酸 污染产生的假阳性；
(3) 试剂盒闭管检测，以及扩增体系中的dUTP—UNG酶系统更进一步避 免了因扩增产物污染导致的结果假阳性。
本发明试剂盒根据不同的样本采用不同的处理方法，通过对荧光PCR扩 增信号的分析来判断奶牛Y染色体特异性片段的存在，试剂盒操作简便快速(1 小时以内)，同时扩增体系中的dUTP—UNG酶(脱氧尿嘧啶核苷酸一尿嘧瞎 DNA糖基化酶)系统更进一步避免了因扩增产物污染导致的结果假阳性，准 确率达到100%，可以广泛应用于生产和科研实践中怀孕奶牛中胎牛性别、移 植胚胎性别以及科研中奶牛基因的快速鉴定，在奶牛养殖业中对加快品种 改良速度、有效降低生产成本、提高牧场和养殖者的收益和经营效益将发挥重 要的作用。本发明中所涉及的主要试剂说明
TaqDNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)、dNTPs (dATP、 dUTP、 dCTP、 dGTP)均为上海宏谊公司生产，全血DNA提取试剂盒以及其它化学 试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
具体实施例方式
下面详细介绍本发明的实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例 仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明 讲授的内容之后，本领域技术人员可以通过技术常识对本发明作各种技术性改 动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例l:怀孕奶牛中胎牛性别的鉴定
(1) 样品处理
用真空采血管(含EDTA抗凝剂)采集10头怀孕12周以上奶牛的全血， 于10000 r/min离心6 min后分别吸取血浆750 pl，置于1.5 ml离心管中，10 个样本共10管，往管中分别加入相同体积核酸浓縮液，旋涡振荡混匀，8000 r/min离心6 min弃上清，加入50核酸提取液，旋涡振荡混匀后IO(TC保持 10 min， 8000 r/min离心6 min取上清作为PCR模板检测。
(2) 扩增检测
按照待检测样品数10+3，取PCR反应缓冲液15X (10+3)、 Taq酶2X (10+3)组分，混匀后每个扩增管分装17 ^d，分别加入试剂盒阴性对照、阳 性对照以及上述处理好的IO个样品模板各13 pl。每个反应扩增管体积为30 ^， 将上述扩增管放到ROTORGENE实时荧光PCR仪器(澳大利亚Corbett Research公司)上按照50°C 2 min、 94°C 2 min后94°C 5 sec、 60°C 30 sec循环40次的程序运行。运行结束后按照仪器软件自动设定阈值，阴性对照为阴 性、阳性对照为阳性，而10个样本中3个扩增阳性、7个阴性，表明10头奶
牛中3头孕雄胎牛、7头孕雌胎牛。最后经和分娩结果比较，胎牛的性别和荧 光PCR鉴定结果全部符合。
实施例2:奶牛胚胎移植中胚胎性别的鉴定
(1) 样本处理
取5个处于桑葚胚期的奶牛胚胎，应用显微操作技术各吸取1 2个胚胎 细胞，直接加入25 pl核酸提取液，旋涡振荡混匀后IO(TC保持10 min， 8000r/min 离心6min取上清作为PCR模板检测。
(2) 扩增检测
按照待检测样品数5+3，取PCR反应缓冲液15X (5+3)、Taq酶2X (5+3) 组分，混匀后每个扩增管分装17 pl，分别加入试剂盒阴性对照、阳性对照以 及上述处理好的n个样品模板各13 ^。每个反应扩增管体积为30 W，将上述 扩增管放到ABI 7000实时荧光PCR仪器(美国应用生物系统公司)上按照50 °C 2min、 94°C 2min后93。C 15 sec、 60°C 45 sec循环40次的程序运行。运 行结束后按照仪器软件自动设置基线和阈值，阴性对照为阴性、阳性对照为阳 性，而5个胚胎样本中2个扩增为阳性、3个阴性，表明2个胚胎为雄性奶牛 胚胎、3个为雌性奶牛胚胎。将这5个奶牛胚胎移植到受体母牛中，妊娠分娩 后胎牛的性别和荧光PCR鉴定结果完全相符。
10核苷酸序列表 SEQUENCE LISTING
〈110〉上海复星医药(集团)股份有限公司 上海复星医学科技发展有限公司 吴大治，夏懿
〈120〉奶牛胚胎性别鉴定的方法和试剂盒
<130〉 bovine sexing
〈藩 CN
〈141〉 2007-11-11
〈160〉 3
<170> Patentln version 3.3
<210〉 1
〈211〉 18
〈212〉 DNA
<213〉 Bos taurus
〈220〉
〈221〉 Sry PRM1 <222〉 (1)..(18)
〈400〉 1
acgccttcat tgtgtggt 18
<210〉 2
〈211〉 20
〈212〉 DNA
<213〉 Bos taurus
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<221〉 Sry P脂2 <222> (l)..咖
〈400> 2
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11〈210> 3
〈211〉 26
〈212〉 DNA
〈213〉 Bos taurus
〈220〉
〈221〉 Sry Probe
〈222〉 (1)..(26)
〈223〉 n=FAM,y:TAMRA
〈220〉
〈221〉 misc_feature
〈222> (1).. (1)
〈223> n is a, c, g, or t
<400〉 3
nctagtagtc tctgtgcctc ctcaay 2权利要求
1. 一种实时荧光PCR扩增检测奶牛性别决定基因(sry)上182bp区域的方法，碱基序列如下上游引物为5’ACg CCT TCA TTg TgT ggT 3’下游引物为5’Cgg gTA TTT gTC TCg gTg TA 3’探针为5’FAM-CTA gTA gTC TCT gTg CCT CCT CAA-TAMRA 3’(5’标记FAM，3’标记TAMRA)。
2. —种浓縮并提取血浆或血清中游离DNA的方法和溶液，浓縮液的主要成分 为聚乙二醇8000和NaCl，其浓度分别为10 15%和1.5 2.0 mol/L。
3. 如权利要求1和2所述方法和引物探针建立的试剂盒，其组分为核酸浓縮 液、核酸提取液、PCR反应缓冲液、Taq酶、空白对照、阳性对照。
4. 如权利要求l所述试剂盒在奶牛胚胎性病鉴定中的应用，包括以下步骤(1) 样品处理取怀孕12周以上奶牛血浆750 ^il，加入相同体积核酸浓縮液，旋涡振荡 混匀，8000r/min离心6min弃上清，加入50 核酸提取液，旋涡振荡混匀后 IO(TC保持10 min， 8000 r/min离心6 min取上清作为PCR模板检测。如果是胚胎移植性别鉴定，可取1 2个细胞直接加入25 pl核酸提取液， 旋涡振荡混匀后IO(TC保持10 min， 8000 r/min离心6 min取上清作为PCR模 板检测。(2) 扩增检测按照待检测样品数n+3，取PCR反应缓冲液15 X (n+3)、Taq酶2X (n+3 ) 组分，混匀后每个扩增管分装17 pl，分别加入试剂盒阴性对照、阳性对照以 及上述处理好的n个样品模板各13 ^。每个反应扩增管体积为30 W，将上述 扩增管放到实时荧光PCR仪器上按照50。C 2min、 94°C 2min后94。C 5 sec、60°C 30sec循环40次的程序运行。运行结束后阴性对照为阴性、阳性对照为 阳性，样本扩增为阳性者为雄性，否则为雌性。
全文摘要
本发明为一种利用实时荧光PCR进行奶牛胚胎性别鉴定的方法和试剂盒，它采用一对奶牛特异性引物扩增性别决定基因(sry)上的182bp区域，并用特异性TaqMan水解探针法实时检测。试剂盒组分包括核酸浓缩液、核酸提取液、PCR反应缓冲液、Taq酶、阴性对照、阳性对照。试剂盒的使用包括样本处理和扩增检测两个步骤，本发明通过检测模板中sry基因片段的存在来判断样品个体的性别，试剂盒操作简便快速(1小时以内)，并可避免因自身扩增产物、人以及其它动物来源核酸污染产生的假阳性，准确率达到100％，可广泛应用于怀孕奶牛胎牛性别鉴定、奶牛胚胎移植性别鉴定以及科研奶牛sry基因检测中。
文档编号C12Q1/68GK101451161SQ20071017124
公开日2009年6月10日 申请日期2007年11月29日 优先权日2007年11月29日
发明者吴大治, 懿 夏 申请人:上海复星医药(集团)股份有限公司;上海复星医学科技发展有限公司