专利名称：一种桑黄黄酮及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种真菌的有效成分提取，具体地说涉及一种桑黄黄酮及 其制备方法和用途。 背景资料
桑黄(尸力e^i77ws Z^朋h'Pilat)，属担子菌纲、多孔菌目、多孔菌
科、针层孔菌属的真菌。桑黄最早记载于《本草纲目》中，《神农本草经》
描述桑黄"久服轻身不老延年"。其味微苦，性寒，能利五脏，宣肠气，排
毒气，压丹石，人热发，衄肠风，止血，泻血。民间认为桑黄能增强肝脏
机能，治疗肝硬化，肝腹水等。
现代研究表明，桑黄主要的药理作用有抗肿瘤、保护肝损伤、降血糖、
抗氧化及抗病毒等。研究表明，桑黄能抑制肿瘤细胞增殖，提高机体免疫 力；桑黄对S180、胃癌的抑制作用较灵芝、巴西蘑菇等药用真菌还强。桑 黄还具有明显的保护肝细胞作用，能减轻肝细胞变性、坏死，维护肝组织 正常结构，促进肝功能恢复，其保肝的作用机理可能是桑黄能抑制自由基 活性，抗脂质过氧化；能显著提高IFN-Y水平，抑制炎症反应。
桑黄中不仅含有丰富的活性多糖类物质，同时还含有黄酮类物质。在桑 黄中发现的黄酮类化合物属于生物类黄酮，是植物次生代谢产物，在针层 孔属真菌中是首次发现。类黄酮是自然界药用植物中主要活性成分之一， 具有调节血脂、消除氧自由基、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等生理活性，因 此生物类黄酮已引起国内外学者的广泛关注。大量的流行病学调查、动物 实验及体外实验研究结果表明黄酮类物质具有广泛的抑癌和防癌作用， 尤其是对一些认为与人体雌激素分泌有关的癌，如乳腺癌、卵巢癌、前列
腺癌等具有较好作用。目前的研究认为，生物类黄酮的抗癌作用主要通过 抗氧化和抗自由基作用、抑制癌细胞生长、抗致癌因子、抑制血管生成及 提高机体免疫力等途径实现。类黄酮属酚类物质，可整合金属离子，从而 抑制体内微量金属离子参与催化的脂质过氧化过程，同时，类黄酮作为抗 氧化剂和自由基的淬灭剂，能有效地阻止脂质过氧化引起的细胞破坏，起 到抗癌防癌作用。
目前，生物类黄酮主要是从天然药用植物中提取，这类物质在菌类中 很少发现，桑黄是少有的含有黄酮类的药用真菌。从植物中获得黄酮类化 合物有两种途径， 一是直接从植物的组织中提取，二是通过诱导植物愈伤 组织进行组织培养或悬浮培养获得次生代谢产物类黄酮。植物资源是有限 的，且砍伐植物会影响生态平衡；而利用植物愈伤组织进行组织培养的成 本较高，培养条件局限。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种桑黄黄酮及其制备方法和用 途，以解决现有技术中的缺陷。
本发明发酵所用的桑黄菌种(尸力^h'加s力3WMZ 力'Pilat)来自中国微
生物菌种保藏中心上海食用菌分中心，编号为Phellinus baumii Pilat3249。
本发明首先提供了一种桑黄黄酮，其中该桑黄黄酮是通过以下方法制 备得到的
① 对桑黄菌丝体进行深层发酵培养；
② 对获得的桑黄菌丝体用70%乙醇提取，获得桑黄黄酮。
其中所述的步骤①中对桑黄菌丝体进行深层发酵培养的具体步骤和
条件为.-
① 平板菌种培养将保藏的斜面菌种接入PDA平板培养基中，培养温度为
26-30。C，培养时间7-IO天；
PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基:马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15 20g，蒸馏水定容至1L。
② 摇瓶种子液培养
培养基PDA液体培养基马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水定容至
1L;
培养条件将步骤①中获得的平板菌种接入PDA液体培养基中，置迴
转式摇床培养，转速150-160r/min， 28 "C培养5-8天得摇瓶种子液； (D—级种子培养
摇瓶种子液匀浆后按10% (体积比)接种量接种到液体菌种培养基， 置迴转式摇床培养，转速150-160 r/min， 28 "C振荡培养4-6天得一级种 子液；
其中液体菌种培养基为葡萄糖20-30g/L，豆饼粉10 g/L，KH2P(U g/L ， MgS040. 5 g/L;
④发酵罐种子液培养
将长好的一级种子液按10% (体积比)接种量接种到发酵罐种子液培 养基，置迴转式摇床培养，转速150-160 r/niin， 28 。C振荡培养3 4天得 发酵罐种子液；
其中发酵罐种子液培养基为葡萄糖5 10g/L，玉米粉20 25g/L，豆 饼粉5 10g/L， KH2P04 lg/L， MgSO40. 5g/L;
⑤发酵罐发酵
发酵条件为罐温26~28 。C，搅拌转速100 180 r/min， pH值自然， 接种量8~10%(体积比)，通气量为'l: 0. 1 1: 1.5v/v/分，罐压为0.2-0.8 公斤/厘米3,发酵周期为4 5天；
其中培养基组成为葡萄糖20 30g/L，玉米粉5 10g/L，豆饼粉5 10 g/L， KH2P04 1.5~3 g/L， MgS04 1 1. 5 g/L，消泡剂(泡敌)0.01%。
其中放罐的标准为菌丝体浓密，色金黄，菌丝体紫外检测有荧光。
其中所述的步骤②中对桑黄菌丝体进行乙醇提取的具体步骤为
菌丝体经板框压滤后，于5(TC鼓风干燥箱中干燥，然后于18-3(TC下 在70%的食用级乙醇中浸泡12-48小时，其中料液比为l: 15 (菌丝体与乙 醇的料液比为重量公斤比体积升)，过滤后保留上清液，残渣再用70°/。乙醇 浸泡12-48小时；合并两次浸提液，于4CTC下减压浓縮，待蒸去大部分乙 醇后，再加水继续减压浓缩，将浓縮液冷冻干燥得桑黄黄酮提取物。如此 制备的桑黄黄酮其得率为9. 6%-11%，纯度为25-27%。
本发明还提供了一种制备上述桑黄黄酮的方法，该方法包括如下步骤
① 对桑黄菌丝体进行深层发酵培养；
② 对获得的桑黄菌丝体用70%乙醇提取，获得桑黄黄酮。
其中所述的步骤①中对桑黄菌丝体进行深层发酵培养的具体步骤和条
件为
① 平板菌种培养将保藏的斜面菌种接入PDA平板培养基中，培养温度为
26-30。C，培养时间7-10天；
② 摇瓶种子液培养
培养基PDA液体培养基；
培养条件将步骤①中获得的平板菌种接入PDA液体培养基中，置迴
转式摇床培养，转速150-160r/min， 28 。C培养5-8天得摇瓶种子液；
(D—级种子培养
摇瓶种子液匀浆后按10% (体积比)接种量接种到液体菌种培养基， 置迴转式摇床培养，转速150-160 r/min， 28 t:振荡培养4-6天得一级种 子液；
其中液体菌种培养基为葡萄糖20-30g/L，豆饼粉10g/L，KH2P0a g/L ， MgS04 0. 5 g/L;
④ 发酵罐种子液培养
将长好的一级种子液按10% (体积比)接种量接种到发酵罐种子液培 养基，置迴转式摇床培养，转速150-160 r/min， 28 。C振荡培养3 4天得 发酵罐种子液；
其中发酵罐种子液培养基为葡萄糖5 10g/L，玉米粉20 25g/L，豆 饼粉5 10g/L， KH2P04 lg/L， MgS04 0 . 5g/L;
⑤ 发酵罐发酵
发酵条件为罐温26 28 °C，搅拌转速100~180 r/min， pH值自然， 接种量8 10% (体积比)，通气量为1: 0. 1~ 1: 1. 5v/v/分，罐压为0. 2-0. 8 公斤/厘米3,发酵周期为4 5天；
其中培养基组成为葡萄糖20 30g/L，玉米粉5 10g/L，豆饼粉5 10 g/L， KH2P04 1.5~3 g/L， MgS04 1 1. 5 g/L，消泡剂(泡敌)0.01%。 所述的步骤②中对桑黄菌丝体进行乙醇提取的具体步骤为
菌丝体经板框压滤后，于5CTC鼓风干燥ft中干燥，然后于i8-30'C下
在70%的食用级乙醇中浸泡12-48小时，其中料液比为1: 15 (重量公斤/
体积升)，过滤后保留上清液，残渣再用70%乙醇浸泡12-48小时；合并两
次浸提液，于40。C下减压浓縮，待蒸去大部分乙醇后，再加水继续减压浓
縮，将浓縮液冷冻干燥得桑黄黄酮提取物。
利用真菌进行发酵生产可以直接用其菌种培养，培养条件要求不高，易 于生长。在真菌深层发酵的过程中，也会产生很多次生代谢产物。用这种 方法生产桑黄黄酮尚未见相关文献报道。
而且通过深层发酵的途径来获得桑黄中的次生代谢产物黄酮是获得桑 黄生物活性物质的一个新的途径，利用液体发酵生产量大、占地少、周期 短、容易控制等优点可以进行大规模工业化生产桑黄黄酮，能降低成本， 具有广阔的应用前景。
将本发明所获得的桑黄菌丝体黄酮提取物进行抗氧化实验研究表明， 桑黄黄酮提取物对活性氧(02'—、 *0H、 H202)均有明显的抑制作用，抑制率 与总黄酮含量之间存在一定的量效关系。桑黄黄酮提取物中的黄酮含量越 高则对活性氧的清除率越高，清除作用越强；说明桑黄菌丝体中具有抗氧 化作用的主要是黄酮类物质。桑黄黄酮还具有抑制肿瘤细胞生长的作用， 且抑制作用随着浓度的增加而增加。具体数据见实施例。
将桑黄黄酮作用于鳃鲤鱼籽酱的抗氧化实验表明，桑黄黄酮的抗氧化 能力接近于BHA (叔丁基羟基茴香醚)，强于Vc。添加后一周其抗氧化能力 就明显的表现出来，在0.5g鱼籽酱中添加0.05 mg桑黄黄酮时其抗氧化抑 制率达到79. 8%， BHA的抑制率为89. 5°/。。到第八天桑黄黄酮的抗氧化能力表 现接近于BHA，达到103%。说明桑黄黄酮对鳃鲤鱼籽酱油脂的抗氧化起到很
好的效果。因此在食品中添加桑黄黄酮既可以起到抗氧化、防衰老、减少 癌症的危险，又可以延长食品的保质期。
因此本发明所提供的桑黄黄酮可用于制备抗氧化制剂、防衰老制剂、 预防或治疗肿瘤的药物、添加剂。
具体实施例方式
实施例一
用桑黄菌(尸力eJh'/ ^Z^/鹏j7Pilat)菌种进行发酵产桑黄黄酮的生产工
艺过程如下
1. 平板菌种培养
将保藏的斜面菌种接入新配制的PDA平板培养基中，培养温度26°C，培 养时间7天。
2. 摇瓶种子液培养
培养基PDA液体培养基。
培养条件接种母种4块，每块0.5 cm2，置迴转式摇床培养，转速 150r/min， 28 'C振荡培养7天得摇瓶种子液。
3. —级种子培养 摇瓶种子液匀浆后按10X接种量接种到液体菌种培养基，葡萄糖30g/L，
豆饼粉10 g/L， KH2P04 1 g/L ， MgSO, 0. 5 g/L;置迴转式摇床培养，转速 150 r/min， 28 'C振荡培养5天得一级种子液。
4. 发酵罐种子液培养
发酵罐种子液培养基葡萄糖10g/L，玉米粉25 g/L，豆饼粉10g/L，KH2P04 1g/L， MgS0,0.5g/L。将长好的一级种子液按10%接种量接种到发酵 罐种子液培养基，置迴转式摇床培养，转速150 r/min， 28 "振荡培养3 天得发酵罐种子液。
5. 发酵罐发酵 、
培养基葡萄糖20g/L，玉米粉5g/L，豆饼粉10g/L， KH2P041.5g/L， MgS04 1 g/L，泡敌O. 01%。
发酵条件为罐温28。C，搅拌转速160 r/min， pH值自然，接种量10%， 通气量l: l.Ov/v/分，罐压0.6公斤/厘米3，发酵时间为96小时。
6. 桑黄菌丝体黄酮的提取
放罐后的菌丝体经板框压滤后，于5(TC鼓风干燥箱中干燥，干燥后的 菌丝体用70%的食用级乙醇(料液比l: 15)室温浸泡24小时，过滤后保 留上清液，残渣再用70%乙醇浸泡20小时，条件同上。合并两次浸提液， 于40。C下减压浓縮，蒸去大部分乙醇后，再加水继续减压浓縮，浓縮至原 体积的1/10，将浓縮液冷冻干燥得桑黄黄酮提取物。提取物真空包装。 实施例二
用桑黄菌(尸力W"72^Z^Wffl^i'Pilat)菌种进行发酵产桑黄黄酮的工艺过
程
1. 平板菌种培养
将保藏的斜面菌种接入新配制的PDA平板培养基中，培养温度26"C，培 养时间8天。
2. 摇瓶种子液培养
培养基PDA液体培养基。培养条件接种母种4块，每块0.5 cm2，置迴转式摇床培养，转速 150r/min， 26 "C振荡培养7天得摇瓶种子液。
3. —级种子培养-
摇瓶种子液匀浆后按10%接种量接种到液体菌种培养基，葡萄糖 20g/L,豆饼粉10g/L，歸CUg/L ， MgS0』.5g/L;置迴转式摇床培养， 转速160 r/min， 28 。C振荡培养6天得一级种子液。
4. 发酵罐种子液培养
发酵罐种子液培养基葡萄糖10g/L，玉米粉20 g/L，豆饼粉5g/L， KH2P04 1g/L， MgS040.5g/L。将长好的一级种子液按10%接种量接种到发酵 罐种子液培养基，置迴转式摇床培养，转速160 r/min， 28 。C振荡培养3 天得发酵罐种子液。
5. 发酵罐发酵
培养基葡萄糖15g/L，玉米粉5g/L，豆饼粉7g/L， KH2P041.5g/L， MgS04 1 g/L，泡敌0.01。/0。
发酵条件为罐温26。C，搅拌转速160 r/inin， pH值自然，接种量10%， 通气量l: l.Ov/v/分，罐压0.6公斤/厘米3，发酵时间为106小时。
6. 桑黄菌丝体黄酮的提取
放罐后的菌丝体经板框压滤后，于5(TC鼓风干燥箱中干燥，干燥后的 菌丝体用70%的食用级乙醇(料液比1: 15)室温浸泡24小时，过滤后保 留上清液，残渣再用70%乙醇浸泡20小时，条件同上。合并两次浸提液， 于4(TC下减压浓縮，蒸去大部分乙醇后，再加水继续减压浓缩，浓缩至原 体积的1/10，将浓縮液冷冻干燥得桑黄黄酮提取物。提取物真空包装。
实施例3抗氧化，清除自由基的作用实验
由上述实施例得到的桑黄菌丝体黄酮提取物对活性氧(02'—、 '0H、 H202) 均有明显的抑制作用，在浓度为5Pg/mL时(V—的清除率达到62.67%;在浓度 为8Pg/mL时'0H的清除率达到67. 76%;在浓度为4)^/110相202的清除率达到
88. 25%。对上述自由基的清除率与总黄酮含量之间存在一定的量效关系。 桑黄菌丝体黄酮提取物中的黄酮含量越高对活性氧的清除率越高，清除作
用越强；说明桑黄菌丝体中具有抗氧化作用的主要是黄酮类物质。
将桑黄黄酮作用于鳃鲤鱼籽酱， 一周后表现出对鱼籽酱的抗氧化作用。
在O. 5g鱼籽酱中添加0. 05 mg桑黄黄酮， 一周后其抗氧化抑制率达到79. 8%，
阳性对照BHA (叔丁基羟基茴香醚)的抑制率为89.5%。到第八天桑黄黄酮
的抗氧化能力表现接近于BHA，达到103%。桑黄黄酮对鳃鲤鱼籽酱油脂的抗
氧化起到很好的效果。
实施例4抑制肿瘤细胞生长的作用
按上述工艺生产得到的桑黄菌丝体黄酮提取物在体外对肿瘤细胞有抑 制作用。用桑黄黄酮100 ^Lg/ml作用于肿瘤细胞时，其对肿瘤细胞L1210的 抑制率为46%; 250 jLig/ffll时，对肿瘤细胞L1210的抑制率为82。/。。说明桑黄 黄酮具有抑制肿瘤.细胞生长的作用，且抑制作用随着浓度的缯加而增加。
权利要求
1.一种桑黄黄酮，其特征在于该桑黄黄酮是通过以下提取方法制备得到的①对桑黄菌丝体进行深层发酵培养；②对获得的桑黄菌丝体用70％乙醇提取，获得桑黄黄酮。
2. 根据权利要求1所述的桑黄黄酮，其特征在于所述的步骤①中对桑黄菌 丝体进行深层发酵培养的具体步骤和条件为① 平板菌种培养将保藏的斜面菌种接入PDA平板培养基中，培养温度为26-30°C，培养时间7-10天；② 摇瓶种子液培养培养基PDA液体培养基；培养条件将步骤①中获得的平板菌种接入PDA液体培养基中，置迴转式摇床培养，转速150-160r/min， 28 。C培养5-8天得摇瓶种子液；③ 一级种子培养摇瓶种子液匀浆后按10%接种量接种到液体菌种培养基，置迴转式摇床 培养，转速150-160 r/min， 28'C振荡培养4-6天得一级种子液；其中液体菌种培养基为葡萄糖20-30g/L，豆饼粉10 g/L， KH2P041 g/L ， MgSO40.5 g/L;④ 发酵罐种子液培养将长好的一级种子液按10%接种量接种到发酵罐种子液培养基，置迴转式摇床培养，转速150-160 r/min， 28'C振荡培养3 4天得发酵罐种子液；其中发酵罐种子液培养基为葡萄糖5 10g/L，玉米粉20 25 g/L，豆 饼粉5 10g/L， KH2P04 lg/L， MgSO40.5g/L;⑤发酵罐发酵发酵条件为罐温26 28"，搅拌转速100 180r/min， pH值自然，接 种量8~10%，通气量为l: 0.1 h 1.5v/v/分，罐压为0.2-0.8公斤/厘米3， 发酵周期为4~5天；其中培养基组成为葡萄糖20 30g/L，玉米粉5 10g/L，豆饼粉5~10 g/L， KH2P04 1.5~3 g/L， MgS04 1~1.5 g/L，泡敌0.01%。
3. 根据权利要求1或2任一项所述的桑黄黄酮，其特征在于所述的步骤②中对桑黄菌丝体进行乙醇提取的具体步骤为菌丝体经板框压滤后，于5(TC鼓风干燥箱中干燥，然后于18-3(TC下在70%的食用级乙醇中浸泡12-48小时，其中料液比为1: 15，过滤后保留上清液，残渣再用70%乙醇浸泡12-48小时；合并两次浸提液，于4(TC下减压浓缩，待蒸去大部分乙醇后，再加水继续减压浓縮，将浓縮液冷冻干燥得 桑黄黄酮提取物。
4. 一种制备权利要求1-3任一项所述桑黄黄酮的方法，其特征在于该方法 包括如下步骤.-① 对桑黄菌丝体进行深层发酵培养；② 对获得的桑黄菌丝体用70%乙醇提取，获得桑黄黄酮。
5. 根据权利要求4所述的桑黄黄酮，其特征在于所述的步骤①中对桑黄菌 丝体进行深层发酵培养的具体步骤和条件为① 平板菌种培养将保藏的斜面菌种接入PDA平板培养基中，培养温度为 26-30°C，培养时间7-10天；② 摇瓶种子液培养 培养基PDA液体培养基；培养条件将步骤①中获得的平板菌种接入PDA液体培养基中，置迴转式摇床培养，转速150-160r/min， 28 "C培养5-8天得摇瓶种子液；③ 一级种子培养摇瓶种子液匀漿后按10%接种量接种到液体菌种培养基，置迴转式摇床 培养，转速150-160 r/min, 28 "C振荡培养4-6天得一级种子液；其中液体菌种培养基为葡萄糖20-30g/L，豆饼粉10 g/L， KH2P04 1 g/L ， MgSO40.5g/L;④ 发酵罐种子液培养将长好的一级种子液按10%接种量接种到发酵罐种子液培养基，置迴转式摇床培养，转速150-160 r/min， 28 "C振荡培养3 4天得发酵罐种子液；其中发酵罐种子液培养基为葡萄糖5 10g/L，玉米粉20 25 g/L，豆 饼粉5 10g/L， KH2P04 lg/L， MgSO40.5g/L;(D发酵罐发酵发酵条件为罐温26 28。C，搅拌转速100-180r/min， pH值自然，接 种量8~10%，通气量为l: 0.1 1: 1.5v/v/分，罐压为0.2-0.8公斤/厘米3， 发酵周期为4 5天；其中培养基组成为葡萄糖20 30g/L，玉米粉5 10g/L，豆饼粉5~10 g/L， KH2P04 1.5 3 g/L， MgS04l 1.5g/L，泡敌0.01%。
6.根据权利要求4或5任一项所述的桑黄黄酮，其特征在于所述的步骤② 中对桑黄菌丝体进行乙醇提取的具体步骤为菌丝体经板框压滤后，于50。C鼓风干燥箱中干燥，然后于18-30。C下在 70%的食用级乙醇中浸泡12-48小时，其中料液比为1: 15，过滤后保留上 清液，残渣再用70°/。乙醇浸泡12-48小时；合并两次浸提液，于4(TC下减压 浓縮，待蒸去大部分乙醇后，再加水继续减压浓縮，将浓縮液冷冻干燥得 桑黄黄酮提取物。
7. 权利要求1-3任一项所述桑黄黄酮在制备抗氧化制剂中的应用。
8. 权利要求l-3任一项所述桑黄黄酮在制备防衰老制剂中的应用。
9. 权利要求l-3任一项所述桑黄黄酮在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应 用。
10. 权利要求1-3任一项所述桑黄黄酮在制备添加剂中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种桑黄黄酮及其制备方法和用途，其中桑黄黄酮是通过深层发酵得到桑黄菌丝体，然后对菌丝体进行乙醇提取得到。所制备的桑黄黄酮可用于制备抗氧化、抗衰老制剂，预防或治疗肿瘤的药物、添加剂。
文档编号C12P1/02GK101182550SQ20071017048
公开日2008年5月21日 申请日期2007年11月16日 优先权日2007年11月16日
发明者刘艳芳, 帅 周, 唐传红, 唐庆九, 张劲松, 焱 杨, 薇 贾, 赵子高, 郝瑞霞 申请人:上海市农业科学院