专利名称：通过pcr鉴定山羊早期胚胎性别的方法
技术领域：
本发明涉及一种用非电泳PCR法鉴定山羊早期胚胎性别的方法，属家畜性别控制方法技术领域。
背景技术：
家畜后代性别控制一直是人们关注的课题之一，尤其是对于有经济实用价值的家畜，如奶牛、山羊等。因此对早期胚胎进行性别鉴定，加速所需性别子代的繁殖，对促进高效益畜牧业的发展具有重要的意义。
PCR(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)扩增技术是一种扩增目的基因的分子生物学方法，它是在模板DNA、引物和dNTP(4种脱氧核糖核苷酸)存在的条件下依赖于DNA聚合酶、反应缓冲液的酶促合成反应，具有快速、特异、灵敏、简便、高效的特点。PCR是由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成模板DNA的变性模板DNA在90℃～96℃加热一定时间，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便单链与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA经加热解离变性成单链后，温度降至45℃～65℃，两引物分别与模板DNA单链互补序列配对结合；引物的延伸DNA模板与引物的结合物在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，从5’端向3’端延伸，合成与模板DNA互补的DNA链。
每一循环经过这三步，DNA含量增加一倍。如此反复，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，经过30个左右的循环后，理论上可使目的基因扩增109倍以上。
基于PCR上述的反应动力特点，在用于早期胚胎性别鉴定时，需要样品量少，只要一个细胞就能进行。随着胚胎移植技术的产业化推广，用PCR法进行早期性别鉴定的技术日益发展成熟，成为目前最具有推广和实用价值的一项性别控制技术。但对PCR产物扩增结果传统的检测方法是对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过溴化乙锭(EB)染色后将胶置于紫外灯下观察，出现特异性条带的为雄性，否则为雌性，其中的电泳是为了保证性别鉴定的准确性。然而，现有的性别鉴定方法所进行的电泳实验需花费约40分钟左右的时间，这种方法因耗时，且需特定的仪器设备(如电泳仪和电泳槽)而不易于在生产实践中推广使用。并且，在实际操作中用于移植的胚胎和用于性别鉴定的胚胎是一次获得的，因此在鉴定出胚胎性别之前需要对待移植的胚胎进行培养，而培养时间的增长会导致胚胎可移植性的降低甚至死亡。
发明内容
本发明要解决的技术问题和提出的技术任务是克服现有将PCR产物需经电泳实验后再进行观察判定性别的方法所存在的不易于在生产实践中推广使用的缺陷，提供一种非电泳PCR法鉴定山羊早期胚胎性别的方法。为此，本发明采取如下技术方案一种通过PCR鉴定山羊早期胚胎性别的方法，所述的PCR是从山羊早期胚胎中取样制作模板DNA，并根据山羊SRY基因序列设计引物，将所述模板DNA、引物随同DNA聚合酶、反应缓冲液和dNTP一起加入到反应管中作为反应物，重复进行变性-退火-延伸三个步骤至反应结束；其特征是在PCR之前先向所述反应管中加入溴化乙锭，之后进行PCR反应，于PCR反应结束后直接将反应管置于紫外灯下观察结果。
本发明还包括以下附加技术特征所述的引物是SRY55’CGTGAACGAAGACGAAAGGTG 3’；SRY35’TGTGCCTCCTCAAAGAATGGG 3’。
所述的山羊早期胚胎为4胞期胚胎、桑椹期胚胎或者囊胚期胚胎。
所述的取样是用玻璃针法从所述胚胎中切取细胞选用4胞期胚胎时切取2个细胞；选用桑椹期胚胎时切取2～10个细胞；选用囊胚期胚胎时从囊胚期滋养层细胞中切取2～10个细胞。
所述模板DNA的制作是把胚胎细胞样品放入离心管，经生理盐水洗涤后加入灭菌超纯水；在离心机上短暂离心，将细胞样品置于离心管底，用封口膜封好离心管；100℃煮沸5～10min后立即置于冰上；冷却后高速离心10min，上清内所含DNA作为PCR的模板DNA。
所述的DNA聚合酶为Taq酶，所述的反应缓冲液为MgCl2和10×buffer的混合物。
所述的dNTP为浓度分别为10mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核酸的混合物。
本方法在PCR反应体系中加入EB，PCR结束后，取出反应管直接在紫外灯下观察，有荧光的为雄性，否则为雌性；由于本方法不需要电泳实验，不需要特定的仪器设备就能够简单进行，利于在生产实践中推广使用；而且，节约了性别鉴定的时间，2～2.5小时即可完成。对山羊早期胚胎鉴定的准确率达到95％～97％。
本方法根据Genbank中所提供的山羊Y-染色体特异性DNA序列中的SRY基因序列，设计一对引物扩增SRY基因上128bp的区域；并采用非电泳法对扩增产物的检测来判断Y染色体特异性片段存在，可以缩短检测时间，为胚胎移植争取了时间，便于在生产实践中使用。
具体实施例方式
下面结合实施实例对本发明作进一步详细说明以下所用引物为根据Genbank中所提供的山羊Y-染色体特异性DNA序列中的SRY基因序列设计的SRY55’CGTGAACGAAGACGAAAGGTG 3’SRY35’TGTGCCTCCTCAAAGAATGGG 3’，该对引物用灭菌双蒸水稀释，最终浓度为20μM，-20℃保存；所用DNA聚合酶为Taq酶，所述的反应缓冲液为MgCl2和10×buffer的混合物；所用dNTP为浓度分别为10mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核酸的混合物，它作为DNA聚合酶的底物使用。
实施例一山羊4胞期胚胎性别鉴定1.微量山羊4胞期胚胎细胞DNA提取使用玻璃针法，从山羊4胞期胚胎切取1～2个细胞，然后把胚胎细胞样品放入200μl离心管，经生理盐水洗涤后加入10μl灭菌超纯水；在离心机上短暂离心，将细胞样品置于离心管底，用封口膜封好离心管；在100℃下煮沸5～10min后立即置于冰上；冷却后12000r/min离心10min，取上清用于PCR，上清内所含DNA即为模板DNA。
2.特异性DNA序列扩增反应管中PCR反应总体积30μl，其中两个特异性引物各为1μl，dNTP200μM，Taq酶1U，MgCl22.5mM，10×buffer3μl，模板原液2μl，EB1～1.5μl，补足去离子水30μl；将上述容纳反应原料的反应管置于基因扩增仪上进行PCR先在95℃预变性5min，然后进行40～45个循环扩增，每个循环包括95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，最后再72℃延伸7～10min，于4℃结束反应。用双蒸水做空白对照。
3.产物检测①对PCR产物的污染检验将作为空白对照的反应管置于紫外灯下观察，无荧光出现，证实前述PCR产物没有被污染。
②非电泳法PCR扩增产物性别检测PCR结束后不经电泳直接将PCR管在紫外灯下观察结果。通过对15个胚胎的检测，判定有荧光的为雄性，否则为雌性。性别鉴定后胚胎移植产羔羊的性别和检测结果完全一致。
实施例二山羊桑椹期胚胎性别鉴定1.微量山羊桑椹胚胚胎细胞DNA提取使用玻璃针法，从山羊桑椹胚胚胎切取2～10个细胞，然后把胚胎细胞样品放入200μl离心管，经生理盐水洗涤后加入10μl灭菌超纯水；在离心机上短暂离心，将细胞样品置于离心管底，用封口膜封好离心管；在100℃煮沸5～10min后立即置于冰上；冷却后12000r/min离心10min，取上清用于PCR，上清内所含DNA即为模板DNA。
2.特异性DNA扩增反应管中PCR反应总体积30μl，其中两个特异性引物各为1μl，dNTP200μM，Taq酶1U，MgCl22.5mM，10×buffer3μl，模板原液2μl，EB1～1.5μl，补足去离子水30μl；将上述容纳反应原料的反应管置于基因扩增仪上进行PCR先在95℃预变性5min，然后进行40～45个循环扩增，每个循环包括95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，最后再72℃延伸7～10min，于4℃结束反应。用双蒸水做空白对照。
3.非电泳法PCR产物检测①对PCR产物的污染检验将作为空白对照的反应管置于紫外灯下观察，无荧光出现，证实前述PCR产物没有被污染。
②非电泳法PCR扩增产物性别检测PCR结束后不经电泳直接将PCR管在紫外灯下观察结果。通过对15个胚胎的检测，判定有荧光的为雄性，否则为雌性。性别鉴定后胚胎移植产羔羊的性别和检测结果完全一致。
实施例3山羊囊胚期胚胎性别鉴定1.微量山羊囊胚期胚胎细胞DNA提取使用玻璃针法，从山羊囊胚期胚胎滋养层细胞切取2～10个细胞，然后把胚胎细胞样品放入200μl离心管，经生理盐水洗涤后加入10μl灭菌超纯水；在离心机上短暂离心，将细细胞样品置于离心管底，用封口膜封好离心管；在100℃煮沸5～10min后立即置于冰上；冷却后12000r/min离心10min，取上清用于PCR，上清内所含DNA即为模板DNA。
2.特异性DNA扩增反应管中PCR反应总体积30μl，其中两个特异性引物各为1μl，dNTP200μM，Taq酶1U，MgCl22.5mM，10×buffer3μl，模板原液2μl，EB1～1.5μl，补足去离子水30μl；将上述容纳反应原料的反应管置于基因扩增仪上进行PCR反应条件中先在95℃预变性5min，然后进行40～45个循环扩增，包括95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，最后再72℃延伸7～10min，于4℃结束反应。用双蒸水做空白对照。
3.非电泳法PCR产物检测①对PCR产物的污染检验将作为空白对照的反应管置于紫外灯下观察，无荧光出现，证实前述PCR产物没有被污染。
②非电泳法PCR扩增产物性别检测PCR结束后不经电泳直接将PCR管在紫外灯下观察结果。对15个胚胎进行检测，判定有荧光的为雄性，否则为雌性。性别鉴定后胚胎移植产羔羊的性别和检测结果完全一致。
权利要求
1.一种通过PCR鉴定山羊早期胚胎性别的方法，所述的PCR是从山羊早期胚胎中取样制作模板DNA，并根据山羊SRY基因序列设计引物，将所述模板DNA、引物随同DNA聚合酶、反应缓冲液和dNTP一起加入到反应管中作为反应物，重复进行变性-退火-延伸三个步骤至反应结束；其特征是在PCR之前先向所述反应管中加入溴化乙锭，之后进行PCR反应，于PCR反应结束后直接将反应管置于紫外灯下观察结果。
2.根据权利要求1所述的通过PCR鉴定山羊早期胚胎性别的方法，其特征是所述的引物是SRY55’CGTGAACGAAGACGAAAGGTG 3’；SRY35’TGTGCCTCCTCAAAGAATGGG 3’。
3.根据权利要求1或2所述的通过PCR鉴定山羊早期胚胎性别的方法，其特征是所述的山羊早期胚胎为4胞期胚胎、桑椹期胚胎或者囊胚期胚胎。
4.根据权利要求3所述的通过PCR鉴定山羊早期胚胎性别的方法，其特征是所述的取样是用玻璃针法从所述胚胎中切取细胞选用4胞期胚胎时切取2个细胞；选用桑椹期胚胎时切取2～10个细胞；选用囊胚期胚胎时从囊胚期滋养层细胞中切取2～10个细胞。
5.根据权利要求1、2或4所述的通过PCR鉴定山羊早期胚胎性别的方法，其特征是所述模板DNA的制作是把胚胎细胞样品放入离心管，经生理盐水洗涤后加入灭菌超纯水；在离心机上短暂离心，将细胞样品置于离心管底，用封口膜封好离心管；100℃煮沸5～10min后立即置于冰上；冷却后高速离心10min，上清内所含DNA作为PCR的模板DNA。
6.根据权利要求1、2或4所述的通过PCR鉴定山羊早期胚胎性别的方法，其特征是所述的DNA聚合酶为Taq酶，所述的反应缓冲液为MgCl2和10×buffer的混合物。
7.根据权利要求1、2或4所述的通过PCR鉴定山羊早期胚胎性别的方法，其特征是所述的dNTP为浓度分别为10mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核酸的混合物。
全文摘要
一种通过PCR鉴定山羊早期胚胎性别的方法，所述的PCR是从山羊早期胚胎中取样制作模板DNA，并根据山羊SRY基因序列设计引物，将所述模板DNA、引物随同DNA聚合酶、反应缓冲液和dNTP一起加入到反应管中作为反应物，重复进行变性－退火－延伸三个步骤至反应结束；其特征是在PCR之前先向所述反应管中加入溴化乙锭，之后进行PCR反应，于PCR反应结束后直接将反应管置于紫外灯下观察结果。本发明根据山羊Y染色体特异性序列设计一对引物，并用非电泳PCR法进行鉴定，解决了目前山羊早期胚胎性别鉴定耗时长、需特定仪器设备的问题；简化了操作程序，便于在生产中推广应用。
文档编号C12Q1/68GK1978664SQ200510061758
公开日2007年6月13日 申请日期2005年12月1日 优先权日2005年12月1日
发明者徐雪明, 俞颂东, 陈阿琴, 王争光, 王锡炉, 张锐 申请人:新昌县大东种畜发展有限公司