专利名称：牛胚胎性别的无创伤性鉴定分子检测方法
技术领域：
本发明属于分子生物学及畜牧业领域，涉及一种提供了快速的牛(指普通牛(Sew /做rM)或称家牛，下同)胚胎(包括胎儿，下同)性别无创伤性鉴定分子检测方法。
背景技术：
动物的性别控制技术是通过对动物的正常生殖过程进行人为干预，使成年雌性动物 按照人们的意愿产出所期望的性别后代的一门生物技术。该技术在畜牧生产上具有重要 的意义，可以实现性别的控制生产，也为伴性遗传性疾病的诊断提供了手段。性别鉴定 则是性别控制的重要步骤和手段。
传统的对胚胎或胎儿性别鉴定的方法，主要有结合胚胎移植的性别鉴定，或妊娠后 的性别鉴定。结合胚胎移植的性别鉴定，需要胚胎显微操作仪器，并结合染色体分型分 析或分子方法，价格昂贵，操作技术要求高，对胚胎也会造成一定的损伤，故在实际生 产中难以应用；传统的妊娠后胚胎(胎儿)性别鉴定，分有创性和无创性两种，前者采 用羊膜腔穿刺和绒毛吸取术，对产前胎儿细胞进行遗传学诊断，这类方法虽然准确率高， 但对母体尤其是胚胎会造成一定的伤害，并可诱发宫内感染、流产、死胎等问题；后者 有超声波诊断等方法，虽然对母体和胎儿没伤害，但其敏感性低，且假阳性率较高，多 用于妊娠后期。1997.年，Lo等应用煮沸法从人类母体血桨和血清中提取出胎儿游离 DNA，用常规PCR扩增单拷贝序列，对母体血浆中胎儿DNA的Y染色体特异性序列 (SRY)进行分析，从而鉴定胎儿性别，为进行早期胚胎的无创性性别鉴定开辟了另一途 径。但由于母体血浆和血清中胎儿游离DNA量非常微量，普通的PCR方法检测的灵敏 度和特异性均受到影响。
巢式PCR (nested PCR)，是指利用两套PCR引物(巢式引物)对进行两轮PCR 扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物再在内引物的存在下进 行第二轮扩增。由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可 能性(因为与两套引物都互补的引物很少)，增加了检测的敏感性；并且有两对PCR 引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。牛是哺乳纲偶蹄目(Artiodactyla)牛科(Bovidae)牛属(Bos)和水牛属(Bubalus) 家畜的总称。牛属包括4个种①普通牛(Bostaurus)，即家牛，包括常见的奶牛、肉 牛和我国黄牛品种。②瘤牛(B.indicus)，亦称驼峰牛。③牦牛(B.run-niens) 。 @野 牛(Bison)，如美洲野牛(B.bison)、欧洲野牛(B.bonasus)等。
人类母体血液中胎儿DNA的来源，己有诸多报到，可能源于以下几个方面
① 来源于孕妇血液中的有核细胞妊娠后由于在胎盘界面的胎-母输血，胎儿有核细 胞如有核红细胞、白细胞、淋巴细胞等突破胎盘屏障进入母体血循环后，母体会对胎儿 有核细胞产生免疫排斥反应，使胎儿有核细胞破裂而将DNA释放入母血浆，Lo等证实 孕妇外周血中有核红细胞的数量与游离胎儿DNA的水平相平行。
② 来源于胎盘滋养层细胞早期胚胎滋养层发育很快，孕4周时滋养层间隙被母血 充盈，合体滋养层细胞可直接渗透入母血，激活母体免疫系统破坏胎盘滋养层细胞，导 致胎儿DNA直接进入母血循环。Ohashi等研究发现植入性胎盘的孕妇血浆中含有的胎 儿DNA明显高于正常孕妇。
③ 来源于胎儿发育过程中凋亡的胎儿细胞凋亡即程序性细胞死亡，细胞核DNA分 解为核酸片段是细胞凋亡的一个特点。孕妇血浆中已被证实存在凋亡的胎儿细胞， Sckizawa等对应用荧光原位杂交技术标定的胎儿细胞行免疫组化染色，结果表明42% 带有凋亡标志。胎盘的凋亡随着妊娠的进展而增高，母体血浆中胎儿DNA的水平也随 着孕周的增加而增高。相关的报道表明最早在母体外周血中检测到胎儿游离DNA都在 四周以后。
目前还没有利用母牛血采用无创伤性的分子检测方法准确、简洁、快速地鉴定牛胚 胎性别的技术报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种牛胚胎性别的无创伤性鉴定分子检测方法。
本发明的发明人在研究中发现，母牛妊娠后胚胎的DNA可以在母体血中检测到， 随着妊娠时间的增加，母体血中胚胎游离DNA的含量会逐渐增加，检测的准确性也会 大大增加，在母牛妊娠2个月后母体血中能够抽取到胚胎游离DNA的准确性可达100%。
本发明主要是利用牛母体血(全血、血浆或血清)中胚胎游离DNA，使用SRY基 因序列作为检测胚胎性别的物质，应用巢式PCR技术检测胚胎性别。
本发明的目的是通过下列技术措施实现的
牛胚胎性别鉴定分子检测方法，其特征在于该方法包括下列步骤a. 抽提DNA模板来集妊娠牛血样，分离游离DNA;
b. 设计引物以牛Y染色体特异性序列设计两对特异性引物，其中第二对特异性 引物扩增片断的序列包含在第一对特异性引物扩增片断的序列中；
c. 第一轮PCR反应以步骤a分离得到的游离DNA为模板，以第一对特异性引物 进行第一轮PCR反应；
d. 第二轮PCR反应以第一轮扩增产物为模板，以第二对特异性引物进行第二轮 PCR反应；
e. 结果判断分别以第一轮和第二轮扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，电泳图谱
与阳性对照比较或者与阳性和阴性对照比较，如第二轮扩增产物出现阳性条带或两轮扩
增产物均出现阳性条带则该妊娠牛的胚胎为雄性；否则，该妊娠牛的胚胎为雌性。 具体分析如下
第一轮扩增产物 第二轮扩增产物 胚胎性别判断 说明 是否有阳性条带 是否有阳性条带
有 有 雄
有 无 雌 第一轮为假阳性
无 有 雄 第一轮为假阴性
无 无 雌
所述的检测方法，其中牛血样为全血、血清或血浆。
所述的检测方法，其中第一对引物的上游引物为SEQIDNo.l，下游引物为SEQID No.2;第二对引物的上游引物为SEQIDNo.3，下游引物为SEQ ID No.4。
所述的检测方法，其中第一轮PCR产物长度为182bp;第二轮PCR产物长度为 124bp。
所述的检测方法，其中第一轮PCR产物序列为SEQIDNo.5;第二轮PCR产物序 列为SEQ ID No.6。若采用测序验证，PCR产物与SRY基因对应片段的同源性为 98.8%~99.5%。
所述的检测方法，其中妊娠牛为妊娠2个月以上的牛，所述的牛为普通牛。 通常，妊娠4 8周(或第1 8周，由于胚胎分期法不同所致)的胎体为胚胎；妊 娠8周以后的胎体为胎儿。本发明技术方案中所述胚胎包括胎儿。 本发明的有益效果
我们根据妊娠母牛的(外周)血中存在游离的胚胎DNA，建立了妊娠牛胚胎性别无创伤性鉴定的分子检测方法，实现牛胚胎的性别诊断，避免对胚胎的损害，以保证胚 胎的正常发育和生长，为母牛胚胎性别鉴定提供了一条准确、简洁、快速的新方法，并 为牛性别控制和胎儿伴性遗传性疾病的诊断与控制提供了一种手段。
本发明根据牛SRY基因序列设计，合成了特异于牛SRY基因的巢式PCR引物，用 于胚胎的性别鉴定。以此两对引物对32头成年荷斯坦公牛和50头母牛基因组DNA进 行扩增，公牛均出现182 bp和124 bp条带，母牛均无此条带，准确率为100%;采集 10头地方黄牛公牛和25头母牛，进行同样的测定，性别鉴定的准确率为100%;鉴定 110头不同妊娠阶段的荷斯坦母牛胚胎性别，并与实际产犊结果比较，妊娠50天至2 个月的准确率>90%,妊娠2个月以上的准确率为100%。任意选取荷斯坦牛扩增阳性 条带样品进行了克隆测序，通过和牛(bovine) SRY基因比对，证明扩增产物就是SRY 基因，说明所设计的引物具有特异性，可用于胚胎性别鉴定。
图l:第一轮巢式PCR扩增结果的电泳分析图。
M—DNA分子量标准；阳一阳性对照；阴一阴性对照，1—8为样品。其中1 5出 现182bp条带，6~8未出现182bp条带。
图2:第二轮巢式PCR扩增结果的电泳分析图。
M—DNA分子量标准；阳一阳性对照；阴一阴性对照，l一8为样品。其中1 5出 现124bp条带，鉴定雄性；6-8未出现124bp条带，为鉴定雌性。 图3:是公牛克隆测序的图谱片段。
图4:是阳性样本克隆测序的图谱片段。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
以下实施例所述的牛为普通牛(5o"awnw)或称家牛。
实施例1
1 DNA提取
阴阳性对照以及样品DNA提取
以无妊娠史的青年母牛(或母犊牛)为阴性对照，以公牛(或公犊牛)为阳性对照， 采取外周血(血浆)。样本为待测定妊娠母牛，同样方法采集外周血(浆)。提取DNA。 (1)阴性、阳性对照DNA提取"1取700(JL血样于2mL离心管中，用PBS液加满离心管，充分混匀后8000r/min离 心10min，弃上清液。往沉淀物中再加600nL血样后，加入PBS液至满离心管，充分混 匀后8000r/min离心10min，弃上清液至沉淀物呈灰白色。加裂解液(尿素8mM;Nacl 0.3mM;SDS2%) 600pL和蛋白酶K lO^L, 55'C温浴过夜。次日浴至4'C冰水中，待降 温后，加等体积Tris饱和酚，混匀静置10min， 12000r/min离心10min;上清液转入另 一灭菌eppendorf管中。观察上清液是否有蛋白层，若有则用Tris饱和酚重复抽提1-2 次，至无蛋白层出现。将上清液转入另一 eppendorf管中，加入等体积的Tris饱和酚/ 氯仿/异戊醇(按体积比25:24:l)充分混匀10min， 10000r/min离心8min后，取上清转入 洁净的1.5mL离心管中。向有上清的离心管中加入上清体积倍数2.5倍的冰无水乙醇用 力摇晃，离心去除上清液后加入75%乙醇漂洗，并于10000r/min离心5min，重复漂洗 DNA沉淀2-3次。室温下静置至管内乙醇挥发尽，加50pL超纯水至DNA完全溶解。 用紫外分光光度计测定OD值，0.7。/。琼脂糖电泳检测DNA提取效果。根据OD值及电 泳结果，可将DNA溶液稀释至100ng/nL。置于-20'C保存备用。 (2)母体血浆中游离DNA的提取2]:
从妊娠母牛颈静脉或尾静脉采血5-10mL, ACD (枸橼酸葡萄糖抗凝溶液)抗凝。 在采样4h内于3000r/min离心10min，小心吸取上层血浆加入另一离心管中，再次以 14000r/min离心10min，小心吸取上层血浆，放入另一离心管中置于-20'C冻存。取母体 血桨2.0mL，加入15pLRNA酶于37'C温浴lh，再加入40nL蛋白酶K于37'C水浴振 荡过液，第二天加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)反复抽提10min， 10000r/min 离心10min，取上清，然后加入等体积的氯仿/异戊醇(24:l)反复抽提10min， 10000r/min 离心10min，取上清，加入3倍体积的无水乙醇以及1/10体积的醋酸钠溶液(3mol/L) 冰浴30min, IOOOOr/min离心IOmin，弃上清，室温下晾干，在沉淀中加入20jaL灭菌超 纯水进行溶解，用分光光度计测定其纯度和浓度，然后置于-2(TC备用。
2应用本发明所筛选的引物SEQ ID No.l 、SEQ ID No.2; SEQ ID No.3、SEQ ID No.4 对提取的阴性、阳性对照以及样品DNA进行巢式PCR扩增分析，并对第二轮扩增产物 进行2%的琼脂糖凝胶电泳，对电泳图谱进行基因分析，具体操作过程如下 (1)第一轮反应体系与PCR反应程序
反应体系10xbuffer2pL; Mg2+1.6nL(25mM); dNTPs 0.5nL(10 mM); SRY primer 1 (上、下)l攀x2(20pM);模版DNA2攀(lPg-l吗);TaqDNA 0.3pL(5U4iL);灭菌超 纯水H20 11.6nL。 (SRYprimer 1上为SEQ ID No.l ，下为SEQ IDNo.2)PCR反应程序94'C预变性5min; 94。C30s， 53.5。C30s， 72。C30s， 72。Cl0min，共 32个循环，4'C保存。
(2) 第二轮反应体系与PCR反应程序 反应体系取第一轮PCR扩增产物4pL作为第二轮PCR的模板。PCR反应体系(2(VL)
为10xbuffer 2pL; Mg2+ 1.2nL(25mM); dNTPs 0.5nL(10 mM); SRY primer 2 (上、 下)1.0pLx2(20pM);第一轮PCR产物4.0nL(4 mM); TaqDNA 0.3jaL(5U/nL);灭菌超纯 zKH209.6nL。 (SRYprimer2上为SEQIDNo.3,下为SEQIDNo.4)
PCR反应程序94'C预变性5min; 94'C30s, 54.5。C30s， 72。C30s， 72。Cl0min,共 32个循环，4'C保存。
(3) 电泳分析以第一轮和第二轮扩增产物分别2%琼脂糖凝胶电泳，结果如图l 和图2。 M—DNA分子量标准；阳一阳性对照阴一阴性对照，1—8为样品。根据第 二轮电泳图谱，1 5泳道扩增出了 124bp条带，与阳性对照一致，鉴定为雄性。6~8没 有124bp产物，鉴定为雌性。
(取荷斯坦牛扩增阳性条带样品进行了克隆测序，第一轮扩增产物序列为SEQ ID No.5，第二轮扩增产物序列为SEQ ID No.6。)
实施例2:克隆测序
为验证根据上述电泳结果判断性别的可靠性，随机挑选上述第二轮一阳性对照和一
阳性样品扩增产物进行克隆测序，结果显示，阳性对照扩增产物(片段，图3)与牛(6oW^) 的SRY基因对应片段的同源性为99.5%，阳性样品扩增产物(片段，图4)与牛(6oW"e) 的SRY基因对应片段的同源性为98.8%，说明经过PCR扩增出来的目的片段就是SRY 基因。
参考文献金冬雁，黎孟枫.分子克隆实验指南[M].北京:科学出版社，1992: 463-469. [2]奥斯伯F，布伦特R,金斯顿RE,等主编.精编分子生物学实验指南[M].北京:科学 出版社，1999， 31.〈110〉南京农业大学
〈120〉牛胚胎性别的无创伤性鉴定分子检测方法 〈歸6
〈210〉 1 <211> 19 〈212> ■ 〈213>人工序列 〈220〉
〈223〉巢式第一轮引物的上游引物 <400〉 1
acgccttcat tgtgtggtc 19
<210> 2 <211> 18 <212>腿 <213〉人工序列 <220>
〈223>巢式第一轮引物的下游引物 〈婦2
cgggtatttg tctcggtg 18
〈210〉 3 <211> 19 〈212> DNA <213>人工序列 〈220〉〈223>巢式第二轮引物的上游引物 〈400〉 3
gaacgaagac gaaaggtgg 19
<210> 4 <211> 19 〈212〉 ■ <213〉人工序列 〈220〉
<223>巢式第二轮引物的下游引物 〈400〉 4
gtgcctcctc aaagaatgg 19
〈210> 5 〈211> 182 <212〉 DNA
〈213>扩增产物序列，来自荷斯坦牛(Holstein) 〈220〉
〈223> SRY基因1242bp-1423bp区域 <德5
acgccttcat tgtgtggtct cgtgaacgaa gacgaaaggt ggctctagag aatcccaaaa 60 tga,actc agacatcagc aagcagctgg gatatgagtg gaaaaggctt acagatgctg 120 aaaagcgccc attctttgeig gaggcac卿gactactagc catacaccga gacaaatacc 180 eg 啦
〈210〉 6 〈211〉 124 〈212〉 DNA
<213>扩增产物序列，来自荷斯坦牛(Holstein) 〈220><223> SRY基因1265bp-1388bp区域 <400〉 6
gaacgaagac gaaaggtggc tctagagaat cagctgggat atgagtggaa aaggcttaca
gC3C
cccaaaatga aaaactcaga catcagcaag 60 gatgctgaaa agcgcccatt ctttgaggag 120
12权利要求
1、牛胚胎性别鉴定分子检测方法，其特征在于该方法包括下列步骤a.抽提DNA模板采集妊娠牛血样，分离游离DNA；b.设计引物以牛Y染色体特异性序列设计两对特异性引物，其中第二对特异性引物扩增片断的序列包含在第一对特异性引物扩增片断的序列中；c.第一轮PCR反应以步骤a分离得到的游离DNA为模板，以第一对特异性引物进行第一轮PCR反应；d.第二轮PCR反应以第一轮扩增产物为模板，以第二对特异性引物进行第二轮PCR反应；e.结果判断分别以第一轮和第二轮扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，电泳图谱与阳性对照比较或者与阳性和阴性对照比较，如第二轮扩增产物出现阳性条带或两轮扩增产物均出现阳性条带则该妊娠牛的胚胎为雄性；否则，该妊娠牛的胚胎为雌性。
2、 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于牛血样为全血、血清或血浆。
3、 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于第一对引物的上游引物为SEQID No.l，下游引物为SEQ ID No.2;第二对引物的上游引物为SEQ ID No.3，下游引物为 SEQIDNo.4。
4、 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于第一轮PCR产物长度为182bp; 第二轮PCR产物长度为124bp。
5、 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于第一轮PCR产物序列为SEQ ID No.5;第二轮PCR产物序列为SEQIDNo.6。
6、 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于妊娠牛为妊娠2个月以上的牛。
7、 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于牛为普通牛。
全文摘要
本发明属于分子生物学及畜牧业领域，公开了牛胚胎性别的无创伤性鉴定分子检测方法。该方法通过妊娠牛血样抽提DNA模板，以牛Y染色体特异性序列设计两对巢式引物，进行巢式PCR，通过扩增产物是否出现阳性条带判断牛胚胎的性别。该方法实现牛胚胎的性别诊断，避免对胚胎的损害，以保证胚胎的正常发育和生长，为母牛胚胎性别鉴定提供了一条准确、简洁、快速的新方法，并为牛性别控制和胎儿伴性遗传性疾病的诊断与控制提供了一种手段。
文档编号C12Q1/68GK101514369SQ20091003025
公开日2009年8月26日 申请日期2009年3月24日 优先权日2009年3月24日
发明者崔群维, 王根林, 程凯宁 申请人:南京农业大学