一种干细胞因子缓释微球及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种干细胞因子缓释微球，包含干细胞因子、重均分子量为0.6-2.5万的乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙二醇和聚乙烯醇；缓释微球的平均粒径为8.4～9.8μm。本发明所述缓释微球形态良好、粒径分布均匀，缓释时间长，累积释放率高，可减少患者的给药频率，提高患者的依从性。本发明还提供了上述缓释微球的制备方法，该方法以复乳-溶剂挥发法为基本工艺，具有包封率高，载药量高，成球率高，回收率高，可重复性好等优点。
【专利说明】一种干细胞因子缓释微球及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药【技术领域】，特别涉及一种干细胞因子缓释微球及其制备方法。
【背景技术】
[0002]据研究在已婚人群中有将近15%的夫妇存在着不孕不育，而其中近一半是由男性因素引起的。引起男性不育的原因是复杂的，其中无精子症大约占了 10%。无精症可分为梗阻性无精症(Obstructive azoospermia, 0A)和非梗阻性无精症(Non-obstructiveazoospermia,Ν0Α)。NOA患者的睾丸生精功能缺陷，甚至不能产生精子。一部分NOA患者睾丸内仍然可以找到精子，通过单精子胞浆内注射技术(ICSI)获得生育机会；另一部分睾丸内无精子生成的患者就没有生育机会，这部分患者是治疗的难点。研究发现，很多睾丸内没有精子NOA患者睾丸局部都有生精细胞存在，即便是唯支持细胞综合症(sertoli cellonly syndrome, SC0S)也可以在其睾丸的局部找到生精细胞；这一研究结果给了我们有益的启示:如果能够有效促进NOA患者睾丸内残存的各级生殖细胞发育成精子，则有望获得作ICSI治疗的精子，解决临床难题。目前想到的解决方法有同种异体生殖细胞移植和生殖细胞的体外培养，但是由于伦理及技术等各种原因而无法推广。
[0003]干细胞因子(stem cell factor, SCF)又被称为干细胞生长因子(stem cellgrowth factor, SCGF)、肥大细胞生长因子(mast cell growth factor, MGF) > steel (SL)factor或c-kit蛋白配体(c_kit ligand, KL),是1990年发现的一种重要的造血细胞因子。多种资料表明SCF/c-kit系统与男性生精细胞发育增殖具有十分密切的关系，它通过PI3K通路与MEK通路途径调节生精细胞的自我更新和增殖，这两种通路彼此独立，不存在交叉反应。鉴于以上研究结果，我们想到:增加NOA患者睾丸内SCF的浓度，有可能使其残余的生殖细胞发育成精子，使NOA患者获得生育机会。但是SCF属多肽类药物，蛋白质多肽类药物半衰期短需频繁给药来维持有效治疗浓度，导致治疗周期长，注射次数多，患者依从性差，坚持完成疗程者少。
[0004]因此，提供一种能够长时间持续发挥作用的干细胞因子缓释微球具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题为提供一种干细胞因子缓释微球及其制备方法。本发明以乳酸-羟基乙酸共聚物为载体材料，采用复乳-溶剂挥发法制备的干细胞因子缓释微球，体内可以连续释放17天，体内累积释放率达70%。
[0006]具体地，本发明提供了一种干细胞因子缓释微球，包含干细胞因子、重均分子量为6，000-25，000的乳酸-羟基乙酸共聚物、助溶剂和稳定剂；所述干细胞因子缓释微球的平均粒径为8.4~9.8 μ m。
[0007]微球缓释给药系统是一种药物载体给药系统，它以生物可降解聚合物为载体材料将药物包封于微球载体中，通过微球内部的孔道以及高分子材料的溶蚀降解来调控药物在体内外的释放，延长药物作用时间，提高药物稳定性，改变药物在体内的分布，使药物浓集于靶区，提高疗效，降低毒副作用。本发明的载体材料为乳酸-羟基乙酸共聚物，由两种单体一乳酸和羟基乙酸随机聚合而成，是一种可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能。
[0008]作为优选，所述乳酸-羟基乙酸共聚物中，乳酸与羟基乙酸的聚合比例(摩尔比)为50:50。
[0009]作为优选，所述干细胞因子与乳酸-羟基乙酸共聚物的重量比为1:2X105。
[0010]作为优选，所述聚乙烯醇的分子量为31000-50000。
[0011]作为优选，所述干细胞因子与聚乙二醇、聚乙烯醇的重量比为0.00001:0.02:1。
[0012]作为优选，所述助溶剂为聚乙二醇、乳糖、微晶纤维素或聚乙烯吡咯烷酮中的一种或两者以上的混合物。
[0013]作为优选，所述稳定剂为聚乙烯醇。
[0014]本发明所述缓释微球形态良好、粒径分布均匀，缓释性能良好，表现在以下两个方面:(1)缓释时间长:体外缓释可达一个月，体内释放可持续17天；(2)累积释放率高:体外累积释放率约为90%，体内累积释放率约为70% ;可减少患者的给药频率，提高患者的依从性。另外，本发明干细胞因子缓释微球载药量可达4.6ng/mg。
[0015]本发明还提供 了一种上述干细胞因子缓释微球的制备方法，该方法包括以下步骤:
[0016](I)将将0.5体积份内水相溶液与8体积份油相溶液混合，并以4000-6000rpm转速搅拌30s形成初乳；
[0017]以重量体积百分比计，所述内水相溶液为干细胞因子含量为2X10_3%、聚乙二醇含量为4%的水溶液，所述油相溶液为乳酸-羟基乙酸共聚物含量为25%的二氯甲烷溶液；
[0018]所形成的初乳中，干细胞因子与乳酸-羟基乙酸共聚物的重量比为1:2X105;
[0019](2)将8.5体积份步骤(1)所得初乳和100体积份外水相溶液混合，并以4000-6000rpm转速搅拌3_4min形成复乳；
[0020]所述外水相溶液为重量体积百分比为1%的聚乙烯醇水溶液；
[0021](3)步骤(2)所得复乳去除二氯甲烷，离心、收集沉淀，即得干细胞因子缓释微球。
[0022]本发明还提供了一种由上述制备方法制得的干细胞因子缓释微球。
[0023]本发明所述缓释微球的制备方法具有包封率高(可达87.1%)，载药量高(可达
4.6ng/mg)，成球率高(可达92%)，回收率高(可达62.7%)，可重复性好等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为肉眼观察干细胞因子缓释微球成品；
[0025]图2为光镜下干细胞因子缓释微球的形态；
[0026]图3为电镜下干细胞因子缓释微球的形态；
[0027]图4为电镜下干细胞因子缓释微球的断面；
[0028]图5为干细胞因子缓释微球的粒径分布直方图；
[0029]图6为本发明干细胞因子缓释微球的体外累积释放曲线；
[0030]图7为本发明干细胞因子缓释微球的体内释放血药浓度曲线。【具体实施方式】
[0031]为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0032]主要试剂来源:
[0033]干细胞因子(SCF):S9915-10UG, From Mouse, Mw31KDa, Sigma-Aldrich USA ；
[0034]聚乳酸-羟乙酸(PLGA):719897, Acid Terminated50:50, Mw6000-25000,Sigma-Aldrich, USA ； [0035]聚乙烯醇(PVA):36318, Mw31000_50000，Sigma-Aldrich, USA ；
[0036]聚乙二醇(PEG):国药集团化学试剂有限公司，中国。
[0037]实施例1本发明干细胞因子缓释微球的制备
[0038]制备工艺:
[0039](I)配制内水相(Wl):取IOyg SCF，20mg PEG，加入蒸馏水至终体积0.5ml ；
[0040](2)配制油相(O):精密称取2g PLGA (MW: 14000)，加入8ml 二氯甲烷充分溶解，配成25%的PLGA溶液；
[0041](3)配制外水相(W2):称取PVA (Mw42000)l.0g，加少量注射用水使之充分溶胀后，加注射用水溶解并定溶至100ml，浓度为1%。用滤纸过滤,放置于4°C待用；
[0042](4)用加样枪将Wl滴入O中，冰浴条件下，乳化分散机5000rpm搅拌约30秒，形成初乳；
[0043](5 )将步骤(4 )所得初乳倒入步骤(3 )所得W2中，冰浴条件下，4000-6000rpm搅拌3-4min,形成复乳；
[0044](6)电动搅拌器lOOOrpm，冰浴下搅拌2-3小时，挥发CH2Cl2 ;待有机溶媒挥尽，2000rpm离心，收集上清液保存，取沉淀。蒸馏水洗涤3遍，再次离心收集，真空冷冻干燥即得冻干的本发明干细胞因子缓释微球。
[0045]实施例2本发明干细胞因子缓释微球的制备
[0046]制备工艺:
[0047](I)配制内水相(Wl):取IOyg SCF，20mg PEG，加入蒸馏水至终体积0.5ml ；
[0048](2)配制油相(0):精密称取2g PLGA (MW:6000)，加入8ml 二氯甲烷充分溶解，配成25%的PLGA溶液；
[0049](3)配制外水相(W2):称取PVA (Mw31000)l.0g，加少量注射用水使之充分溶胀后，加注射用水溶解并定溶至100ml，浓度为1%。用滤纸过滤,放置于4°C待用；
[0050](4)用加样枪将Wl滴入O中，冰浴条件下,乳化分散机5000rpm搅拌约30秒,形成初乳；
[0051](5)将步骤(4)所得初乳倒入步骤(3)所得W2中，冰浴条件下，4000-6000rpm搅拌3-4min,形成复乳；
[0052](6)电动搅拌器lOOOrpm，冰浴下搅拌2_3小时，挥发CH2Cl2 ;待有机溶媒挥尽，2000rpm离心，收集上清液保存，取沉淀。蒸馏水洗涤3遍，再次离心收集，真空冷冻干燥即得冻干的本发明干细胞因子缓释微球。
[0053]实施例3本发明干细胞因子缓释微球的制备[0054]制备工艺:
[0055](I)配制内水相(Wl):取IOyg SCF，20mg PEG，加入蒸馏水至终体积0.5ml ；
[0056](2)配制油相(O):精密称取2g PLGA (MW: 25000)，加入8ml 二氯甲烷充分溶解，配成25%的PLGA溶液；
[0057](3)配制外水相(W2):称取PVA (Mw50000)l.0g，加少量注射用水使之充分溶胀后，加注射用水溶解并定溶至100ml，浓度为1%。用滤纸过滤,放置于4°C待用；
[0058](4)用加样枪将Wl滴入O中，冰浴条件下，乳化分散机5000rpm搅拌约30秒，形成初乳；
[0059](5 )将步骤(4 )所得初乳倒入步骤(3 )所得W2中，冰浴条件下，4000-6000rpm搅拌3-4min,形成复乳；
[0060](6)电动搅拌器lOOOrpm，冰浴下搅拌2-3小时，挥发CH2Cl2 ;待有机溶媒挥尽，2000rpm离心，收集上清液保存，取沉淀。蒸馏水洗涤3遍，再次离心收集，真空冷冻干燥即得冻干的本发明干细胞因子缓释微球。
[0061]实施例4本发明干细胞因子缓释微球的质量参数评定
[0062](I)形态学特征
[0063]肉眼观察结果如图1所示，干细胞因子缓释微球呈白色粉末状；
[0064]( 2 )光镜下的微球形态
[0065]取已冻干的上述微球少许，用含0.02%吐温80的生理盐水分散，用Nikon光学显微镜，于20 X 10倍放大倍数下观察微球形态，结果如图2所示，微球表面光滑，分散好，彼此间无粘连。
[0066](3)电镜下的微球形态
[0067]采用电子扫描显微镜(SEM)观察微球表面以及内部的外观形貌和分散性，实验操作如下:冻干后的微球样品通过双面胶固定在铝质圆台上喷金，在JE0LJSM7401F扫描电子显微镜1.0kV的加速电压下进行形态学的观察，放大倍数250~10，000 ;本发明干细胞因子缓释微球的电镜结果如图3所示，图3显示:微球表面光滑，分散好，彼此间无粘连；电镜下微球断面如图4所示。
[0068](4)成球率:
[0069]光镜下随机观察100个微球，其中，圆形完整的微球为92个，由此得出成球率为92%。
[0070](5)微球平均粒径及粒径分布:
[0071]在光学显微镜下用测微尺测定500个微球的粒径，每隔3 μ m粒径为一单元，分别计数每一单元的微球数；
[0072]a)微球平均粒径的计算公式为:
[0073]
【权利要求】
1.一种干细胞因子缓释微球，其特征在于，包含干细胞因子、重均分子量为6，000-25，000的乳酸-羟基乙酸共聚物、助溶剂和稳定剂；所述干细胞因子缓释微球的平均粒径为8.4~9.8 μ m。
2.如权利要求1所述的干细胞因子缓释微球，其特征在于，所述乳酸-羟基乙酸共聚物中，乳酸与羟基乙酸的聚合比例为50:50。
3.如权利要求1所述的干细胞因子缓释微球，其特征在于，所述干细胞因子与乳酸-羟基乙酸共聚物的重量比为1:2X105。
4.如权利要求1所述的干细胞因子缓释微球，其特征在于，所述聚乙烯醇的分子量为31000-50000。
5.如权利要求1所述干细胞因子缓释微球，其特征在于，干细胞因子与聚乙二醇、聚乙烯醇的重量比为0.00001:0.02:lo
6.如权利要求1所述干细胞因子缓释微球，其特征在于，所述助溶剂为聚乙二醇、乳糖、微晶纤维素或聚乙烯吡咯烷酮中的一种或两者以上的混合物。
7.如权利要求1所述干细胞因子缓释微球，其特征在于，所述稳定剂为聚乙烯醇。
8.—种如权利要求1-7任一项所述干细胞因子缓释微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将将0.5体积份内水相溶液与8体积份油相溶液混合，并以4000-6000rpm转速搅拌30s形成初乳； 以重量体积百分比计，所述内水相溶液为干细胞因子含量为2X 10 3%、聚乙二醇含量为4%的水溶液，所述油相溶液为乳酸-羟基乙酸共聚物含量为25%的二氯甲烷溶液； (2)将8.5体积份步骤(1)所得初乳和100体积份外水相溶液混合，并以4000-6000rpm转速搅拌3-4min形成复乳； 所述外水相溶液为重量体积百分比为1%的聚乙烯醇水溶液； (3)步骤(2)所得复乳去除二氯甲烷，离心、收集沉淀，即得干细胞因子缓释微球。
9.根据权利要求8所述的制备方法制得的干细胞因子缓释微球。
【文档编号】A61P15/08GK103690933SQ201410008284
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2014年1月8日 优先权日:2014年1月8日
【发明者】邱学德, 程波, 李泽慧, 李志鹏, 陈云建, 普俊学 申请人:昆明制药集团股份有限公司