筛选多能干细胞生长促进因子的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高效的无饲养层、无血清的细胞培养技术和一种基于此类培养技 术的筛选方法。
【背景技术】
[0002] 最近对于人多能干细胞如人ES细胞（hESC)和人iPS细胞（hiPSC)的研究为再生 医学的实际应用提供了增加的可能性。由于此类细胞具有无限的增殖能力和分化成不同细 胞的能力，因而使用多能干细胞的再生医学有望从根本上改变对于难治性疾病、与生活习 惯相关的疾病和其他疾病的治疗方法。目前的技术已经能够诱导多能干细胞在体外分化成 不同细胞，包括神经细胞、心肌细胞、血液细胞和视网膜细胞。
[0003] 已主要在使用小鼠胚胎成纤维细胞（MEF)的饲养细胞层上常规培养人多能 干细胞，如hESC和hiPSC。饲养细胞提供了用于维持人多能干细胞向干细胞培养的 生长因子。已发现在不同人细胞类型以及MEF中其活性能够维持人多能干细胞的培 养（Hovatta0·等，Hum.Reprod·，（2003) 18,ρρ· 1404-1409;RichardsM.等，Nat. Biotechnol·，（2002) 20,ρρ· 933-936;ChengL.等，StemCells, (2003) 21，ρρ· 131-142 ;和 RichardsM.等，StemCells, (2003) 21，pp. 546-556)。然而，在常规技术中，在培养时饲养 细胞的制备是费力的，并且在干细胞中存在饲养细胞污染的风险。因而，需要发展替代性的 更加安全的技术。
[0004] 作为不使用MEF的多能干细胞培养技术，已知一种涉及使用来自添加了血清如 FBS或血清替代物的培养基的MEF-预制条件培养基（即MEF-CM)的方法和一种使用化学 固定的MEF的方法（YueX-S.等，PLoS. 0NE，（2012)7，e32707)。此外，还有一种涉及使用 不同人细胞（例如成纤维细胞、胎盘细胞、骨髓细胞和子宫内膜细胞）作为活的饲养细胞而 不使用已报道的外源性细胞的方法（HayatoFukusumi和YonehiroKanemura,Development ofFeeder-freeCellCultureTechniqueofHumanES/iPSCells(人ES/iPS细胞无饲 养细胞培养技术的开发），JournalofClinicalandExperimentalMedicine, (2011)239 ，pp. 1338-1344)。在这些方法中，使用添加了牛血清或KNOCKOUT?SR(敲除血清替代物，其 是作为能够培养ES/iPS细胞的血清替代物的添加剂）的培养基以培养人多能干细胞。然 而，很多添加剂成分包含从牛血清中提取的蛋白。因此，感染性疾病如牛海绵状脑病（BSE) 和细胞的病毒污染成为关注的问题。尽管在一些情况下使用人血清，但是人血清不适于实 际使用，因为其使用或用量受到限制。
[0005] 此外，对用于培养的无MEF完全合成培养基（化学上确定的培养基）的研发已被 推进（AkopianV.等，InVitroCellDev.Biol.Anim·，（2010)46，ρρ· 247-258;和Chen G.等，Nat.Methods, (2011)8,ρρ· 424-429)。针对功能性蛋白对MEF分泌产物进行了分析 (ChinA.C.等，J.Biotechnol·，（2007) 130,ρρ· 320-328)。然而，在无饲养层、无血清培养 基中稳定培养人多能干细胞仍是困难的，并且一直期待开发一种能够理想生长的技术。
[0006] 发明概述
[0007] 发明要解决的问题
[0008] 本发明的目的是提供一种高效的无饲养层、无血清的细胞培养技术。本发明的另 一个目的是提供一种基于此类培养技术筛选生长促进因子的方法。
[0009] 解决问题的方法
[0010] 本发明人为了达到上述目的进行了集中的研究。作为结果，他们发现预先使用饲 养细胞来条件化能够用于多能干细胞培养的无血清培养基能够制备得到不需要饲养细胞 共培养就能够稳定培养多能干细胞并且改善其生长能力的培养基。他们还发现了一种能够 通过筛选此类制备得到的培养基有效鉴定多能干细胞生长促进因子的技术。这导致完成了 本发明。
[0011] 此外，本发明人发现多能干细胞的生长能力能够通过使用在含有特定成分的无血 清培养基中的多能干细胞的饲养培养，随后通过无饲养培养（feeder-freeculture)得到 进一步改善。
[0012] 具体地，本发明包括下述。
[0013] [1] -种筛选多能干细胞生长促进因子的方法，包括：
[0014] a)在含有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠并且不含血清或血清替 代物的无血清培养基中培养饲养细胞以产生条件培养基并且回收所述条件培养基；和
[0015] b)在所回收的条件培养基中检测多能干细胞的生长促进因子。
[0016] 在所述筛选方法的一个优选实施方式中，所述无血清培养基可以是含有L-抗坏 血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠的DMEM/F12培养基。
[0017] 在所述筛选方法的一个实施方式中，所述饲养细胞的培养优选地通过向所述无 血清培养基中加入生长因子实现。在所述筛选方法中加入的生长因子优选FGF2和/或 TGF-β1。
[0018] 在所述筛选方法中，所述饲养细胞可以是小鼠胚胎成纤维细胞。
[0019] 在所述筛选方法中，所述多能干细胞优选是ES细胞或iPS细胞。
[0020] [2] -种制备用于培养多能干细胞的培养基的方法，所述方法包括在含有L-抗坏 血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠并且不含血清或血清替代物的无血清培养基中培养 饲养细胞以产生条件培养基并且回收所述条件培养基。
[0021] 在所述制备方法的一个优选实施方式中，所述无血清培养基可以是含有L-抗坏 血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠的DMEM/F12培养基。
[0022] 在所述制备方法的一个实施方式中，所述饲养细胞的培养优选地通过向所述无 血清培养基中加入生长因子实现。在所述制备方法中加入的生长因子优选FGF2和/或 TGF-β1。
[0023] 在所述制备方法中，所述饲养细胞可以是小鼠胚胎成纤维细胞。
[0024] 在所述制备方法中，所述多能干细胞优选是ES细胞或iPS细胞。
[0025] [3] -种用于培养多能干细胞的条件培养基，其通过根据上述[2]所示的方法制 备。
[0026] [4] -种多能干细胞的生长方法，所述方法包括在条件培养基中实现多能干细胞 的无饲养培养，所述条件培养基通过在含有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠 并且不含血清或血清替代物的无血清培养基中培养饲养细胞产生。
[0027] 在所述生长方法的一个优选实施方式中，所述无血清培养基可以是含有L-抗坏 血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠的DMEM/F12培养基。
[0028] 在所述生长方法的一个实施方式中，所述饲养细胞的培养优选地通过向所述无血 清培养基中加入生长因子实现。在另一个实施方式中，通过不向所述无血清培养基中加入 生长因子实现所述饲养细胞的培养和通过向所述条件培养基中加入生长因子实现多能干 细胞的无饲养培养是优选的。在所述生长方法中加入的生长因子优选FGF2和/或TGF-β1。
[0029] 在所述生长方法中，所述饲养细胞可以是小鼠胚胎成纤维细胞。
[0030] 在所述生长方法中，所述多能干细胞优选是ES细胞或iPS细胞。
[0031] [5] -种生长多能干细胞的方法，所述方法包括使用含有L-抗坏血酸、胰岛素、转 铁蛋白、硒和碳酸氢钠并且不含血清或血清替代物的无血清培养基将在饲养细胞上培养的 多能干细胞转变成无饲养细胞的培养，并且实现所述多能干细胞的无饲养培养。
[0032] 在这种方法的一个优选实施方式中，所述无血清培养基优选地不含白蛋白。
[0033] 本说明书包括在日本专利申请号2013-137206中公开的内容，本申请要求了该申 请的优先权。
[0034] 发明的效果
[0035] 根据本发明，使用不含血清或血清替代物的无血清培养基能够改善多能干细胞在 无饲养培养中的生长能力。此外，根据本发明，能够制备能够筛选促进多能干细胞在无饲养 培养中非分化生长的因子的条件培养基。
[0036] 附图简述
[0037] 图1代表显示在无饲养培养中无血清MEF条件培养基对iPS细胞生长能力影响的 照片。A:在由基础培养基（无血清培养基）A+ITS+FGF2+TGF-0 1制备的条件培养基中的生 长能力（+++) ;B:在基础培养基（无血清培养基）A+ITS+FGF2+TGF-0 1 (未条件化）中的生 长能力（+);C:在由基础培养基（无血清培养基）A+ITS制备的条件培养基（条件化后，添 加FGF2+TGF-i3 1)中的生长能力（++) ;D:在由基础培养基（无血清培养基）A制备的条件 培养基（条件化后，添加ITS+FGF2+TGF-0 1)中的生长能力（-);E:在由基础培养基（无血 清培养基）B+ITS制备的条件培养基（条件化后，添加FGF2+TGF-0 1)中的生长能力（-);和 F:在基础培养基（无血清培养基）B+ITS+FGF2+TGF-0 1 (未条件化）中的生长能力（-)。
[0038] 图2代表显示在包被了不同培养基质的塑料培养皿中在无血清条件培养基中人 iPS的生长结果。使用Matrigel__ (见图2A、B)、玻连蛋白（vitronectin)(见图2C、D)和 PCM-DM(见图2E、F)作为培养基质。在A、C和E中，使用未条件化的无血清培养基。在B、D和F中，使用MEF-条件培养基。
[0039] 图3代表显示在使用MEF-条件无血清培养基或未条件化无血清培养基培养中人 iPS细胞生长能力的比较结果的表。
[0040] 图4显示了通过流式细胞术对在MEF-条件无血清培养基或未条件化无血清培养 基中培养的人iPS细胞的非分化标记物进行表达分析的结果。
[0041] 图5代表显示在由使用含有血清替代物的培养基（B至E)或含有给定成分的无血 清培养基（G至J)进行的饲养培养转变为无饲养培养前后人iPS细胞生长能力比较结果的 照片。在图5中，生长程度以符号（无生长）或" + "的数量表示。
[0042] 实施发明的实施方式
[0043] 以下，对本发明进行更加详细的描述。