用于使用N-末端截短的β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶变体的糖蛋白的单-和二唾液酸 ...的制作方法
【专利说明】用于使用N-末端截短的β-半乳糖苷-α-2, 6-唾液酸转 移酶变体的糖蛋白的单-和二唾液酸化的方法
[0001] 本公开涉及具有Ν-末端截短缺失的某些糖基转移酶变体的用途。发现人β-半 乳糖苷-α-2, 6-唾液酸转移酶I(hST6Gal_I)的两种不同的截短变体的组合表现出不同的 唾液酸转移酶比活性。在一个例子中，在其中第一变体Λ89hST6Gal-I催化双唾液酸化目 标分子的形成的条件下，第二变体Λ108hST6Gal-I催化单唾液酸化目标分子的形成。因 此，公开了哺乳动物糖基转移酶的变体，编码其的核酸，用于重组产生哺乳动物糖基转移酶 的变体的方法和方式及其用途，特别是用于以定量受控方式唾液酸化作为糖蛋白诸如免疫 球蛋白的部分的聚糖部分的末端受体基团的用途。
[0002] 置量 转移酶（EC2)催化官能团从一种物质转移至另一种物质。糖基转移酶，酶的一个超家 族，参与合成糖蛋白、糖脂和糖胺聚糖的碳水化合物部分。特定糖基转移酶通过将活化的糖 供体的单糖部分的相继转移至受体分子来合成寡糖。因此，"糖基转移酶"催化糖部分从其 核苷酸供体转移至多肽、脂质、糖蛋白或糖脂的受体部分。该过程也被称为"糖基化"。作为 例如糖蛋白的结构部分的碳水化合物部分也被称为"聚糖"。聚糖构成最流行的所有已知的 翻译后蛋白修饰。聚糖参与和粘附、免疫应答、神经细胞迀移和轴突延伸一样多样的广泛系 列的生物识别过程。作为糖蛋白的结构部分，聚糖也在蛋白折叠和蛋白稳定性和生物活性 的支持中具有作用。
[0003] 在糖基转移酶催化中，单糖单元葡萄糖（Glc)、半乳糖（Gal)、N-乙酰葡糖胺 (GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺（GalNAc)、葡糖醛酸（GlcUA)、半乳糖醛酸（GalUA)和木糖被活 化为尿苷二磷酸（UDP)-a-D衍生物；阿拉伯糖被活化为UDP-β-L衍生物；甘露糖（Man)和 岩藻糖分别被活化为⑶P-a-D和⑶P-β-L衍生物；且唾液酸（=Neu5Ac;=SA)被活化为 β-D-Neu5Ac的CMP衍生物。
[0004] 许多不同的糖基转移酶有助于聚糖的合成。糖蛋白的碳水化合物部分的结构多 样性特别大，且通过复杂的生物合成途径来确定。在真核生物中，糖蛋白的聚糖-部分的 生物合成发生于内质网（"ER"）和高尔基体的内腔中。糖蛋白的单一（支链或直链）碳 水化合物链通常是N-或0-连接的聚糖。在翻译后加工过程中，碳水化合物通常经由天冬 酰胺（"N-连接的糖基化"），或经由丝氨酸或苏氨酸（"0-连接的糖基化"）连接至多肽。 聚糖的合成(无论N-连接或0-连接（="N-/0-连接的"））由几种不同的膜锚定的糖基转 移酶的活性影响。糖蛋白可以包含一个或多个聚糖连接的氨基酸（="糖基化位点"）。特 定聚糖结构可以是直链或支链的。支链是碳水化合物的显著特征，其与DNA、RNA和多肽 通常的线性性质相反。与它们的基本构建块的大异质性组合，单糖，多糖结构表现出高多 样性。此外，在特别的糖蛋白种类的成员中，连接至特定糖基化位点的聚糖的结构可以变 化，因此导致各自糖蛋白种类（即，共享多肽部分的相同氨基酸序列的种类）的微异质性 (microheterogeneity)。
[0005] 唾液酸转移酶（="ST"）是催化唾液酸（=5-N-乙酰神经氨酸=Neu5Ac=NANA) 残基从供体化合物转移至（i)糖脂或神经节苷脂的末端单糖受体基团或（ii)糖蛋白的 N-/0-连接的聚糖的末端单糖受体基团的糖基转移酶。对于哺乳动物唾液酸转移酶(其包 括人ST种类)，存在作为胞苷-5' -单磷酸-N-乙酰神经氨酸（=CMP-Neu5Ac=CMP-NANA) 的共同供体化合物。唾液酸残基的转移也被称为"唾液酸化（sialylating) "和"唾液酸化 (sialylation) '，。
[0006] 在唾液酸化的糖蛋白的聚糖结构中，通常在寡糖的末端位置中发现（一个或多 个）唾液酸部分。由于所述末端（即暴露位置)，唾液酸可以参与许多不同的生物识别现象且 服务于不同种类的生物相互作用。在糖蛋白中，可以存在多于一个唾液酸化位点，即能够充 当唾液酸转移酶的底物且作为适合于唾液酸残基的转移的受体基团的位点。此类多于一个 位点原则上可以是锚定在糖蛋白的不同的糖基化位点的多个线性聚糖部分的末端。此外， 支链聚糖可以具有其中可以发生唾液酸化的多个位点。
[0007] 根据目前知识，可以发现末端唾液酸残基（i)α2 - 3 (α2, 3)连接至半乳糖 基-R，（ii)α2 -6(α2,6)连接至半乳糖基-R，（iii)α2 -6(α2,6)连接至Ν-乙酰半 乳糖胺基_R，（iv)α2 - 6 (α2, 6)连接至Ν-乙酰葡糖胺基-R，和（ν)α2 - 8/9 (α2, 8/9) 连接至唾液酸基（sialidyl)-R，其中-R表示受体底物部分的其余部分。因此，唾液酸缀合 物的生物合成（="唾液酸化"）中有活性的唾液酸转移酶通常根据其各自的单糖受体底物 且根据其催化的糖苷键的3、6或8/9位置进行命名和分类。因此，在本领域已知的文献中， 例如在PatelRY,等人，Glycobiology16 (2006) 108-116 中，根据转移Neu5Ac残基、 同时形成糖苷键的受体糖残基的羟基位置，参考真核生物唾液酸转移酶，诸如（i)ST3Gal， (ii)ST6Gal，（iii)ST6GalNAc，或（v)ST8Sia。也可以更通用的方式参考唾液酸转移 酶，例如，作为ST3、ST6、ST8 ;因此，"ST6"明确涵盖催化α2, 6唾液酸化的唾液酸转移酶。
[0008] 二糖部分β-D-半乳糖基-1，4-Ν-乙酰基-β-D-葡糖胺（=Galβ1，4GlcNAc)是 糖蛋白的N-连接的聚糖的触角（antennae)的常见末端残基，但也可以存在于0-连接的聚 糖和糖脂中。酶β-半乳糖苷-α2, 6-唾液酸转移酶（="ST6Gal"）能够催化聚糖的末端 Galβ1，4GlcNAc或聚糖的支链（="触角（antennae) "）的α2, 6-唾液酸化。对于其一般 方面，参考DallOlioF.GlycoconjugateJournal17 (2000) 669-676 的文献。在人和其 它哺乳动物中，似乎存在几种ST6Gal。本公开特别涉及人β-半乳糖苷-α-2, 6-唾液酸转 移酶I(=hST6Gal-I;根据IUBMB酶命名法，EC2. 4. 99. 1)，但不限于此。
[0009] 唾液酸转移酶的ST6组包含2个亚组，ST6Gal和ST6GalNAc。ST6Gal酶的活性催 化Neu5Ac残基转移至作为聚糖的末端Galβ1，4GlcNAc的部分或聚糖的触角的游离半乳糖 基残基的C6羟基，从而在聚糖中形成α2 - 6连接至Galβ1，4GlcNAc部分的半乳糖基残 基的末端唾液酸残基。聚糖中所得新形成的末端部分是Neu5Acα2, 6Galβ1，4GlcNAc。
[0010] 人β-半乳糖苷-α-2, 6-唾液酸转移酶I(hST6Gal-I)的野生型多肽在本文献 申请时在公开可得的NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/115445)中被 公开为"1]11丨?仰丨1?/3?丨^^^的：？15907.1"。包括编码序列的进一步信息被提供为数据库 条目"GeneID:6480" 内编译的超链接（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6480)。
[0011] 哺乳动物唾液酸转移酶与其它哺乳动物高尔基体驻留的（Golgi-resident)糖基 转移酶共享所谓的"II型构造（typeIIarchitecture)"，其具有（i)短胞质N-末端尾部， (ii)跨膜片段，随后为（iii)可变长度的茎区域和（iv)面向高尔基体的内腔的C-末端 催化结构域（DonadioS.等人inBiochimie85 (2003) 311-321)。哺乳动物唾液酸转移 酶表现出在它们的催化结构域中展示显著的序列同源性。
[0012] DonadioS.等人在CH0细胞中表达hST6Gal_I的几种N-末端截短的变体，且发现 包含前35、48、60和89个氨基酸的N-末端缺失产生突变酶，然而其在将唾液酸转移至外源 受体中仍然具有活性。
[0013] 糖基化是影响蛋白折叠、稳定性和生物活性的调节的蛋白的重要的翻译后修饰。 唾液酸部分（=唾液酸，5-N-乙酰神经氨酸，Neu5Ac)通常暴露于N-糖基化的末端位置并因 此，是对于生物识别和配体功能的重要贡献因素，例如，特征在于末端唾液酸的IgG被显示 诱导更少的炎症反应和增加的血清半衰期。
[0014] 使用糖基转移酶用于酶促合成定义的聚糖结构正成为引导治疗性蛋白诸如抗 体的N-糖基化的工具。由于原核生物来源的糖基转移酶通常不对复杂糖蛋白结构起作 用，所以哺乳动物来源的唾液酸转移酶是优选的。例如，Barb等人（2009)使用分离的人 ST6Gal-I制备免疫球蛋白G的Fc片段的高度有效的唾液酸化的形式。然而，由于在各种 宿主（毕赤酵母（Pichiapastoris)、草地贪夜蛾（Spodopterafrugiperda)和大肠杆菌） 中的低表达和/或不良活性，重组ST6Gal-I用于治疗应用仍然受限。
[0015] 本领域已知的是，哺乳动物糖基转移酶可以有利地用于在体外唾液酸化复杂的目 标分子诸如糖蛋白或糖脂的触角受体位点。然而，仍然缺乏以定量控制的方式进行唾液酸 化（特别是关于具有两个或更多个能够被唾液酸化的受体位点的目标分子）的手段和方 法。也就是说，期望提供了与唾液酸化目标分子的两个或更多个或甚至所有受体位点相反， 允许唾液酸化几个受体位点中的仅一个的方式、方法和条件。进一步期望在批次唾液酸化 反应混合物中控制目标分子的单事件唾液酸化及其多事件唾液酸化之间的平衡。
[0016] 令人惊讶地，最初发现两种截短变体Λ89hST6Gal-I和Λ108hST6Gal-I表现出不 仅对抗体、而且对其它目标分子的不同的体外唾液酸化活性。显然，IgG-Fc触角聚糖G2在 可以被唾液酸化的分枝的末端具有两个半乳糖部分。在相同的反应条件下，Λ89hST6Gal-I 优选催化双唾液酸化聚糖（G2 + 2SA)的合成，而变体Λ108hST6Gal-I合成单唾液酸化聚 糖（G2 + 1SA)。因此，两种酶都是适合用于聚糖结构、特别是N-聚糖的选择性唾液酸化的 工具。
[0017] 本发明人的最初发现是人β-半乳糖苷-α-2, 6-唾液酸转移酶I的Δ108 hST6Gal_I变体主要能够将仅单一唾液酸残基添加至具有两个或更多个触角受体位点 的目标分子。相比之下，人β-半乳糖苷-α_2,6-唾液酸转移酶I及其特定变体诸如 八89 1^了66&1-1的酶促活性导致目标分子的多重唾液酸化。因此，借助使用单独的六108 hST6Gal_I，例如在分批处理中，单-唾液酸化的目标分子可以从具有两个或更多个非唾液 酸化的触角受体位点的目标分子产生。
[0018] 这为许多不同的方法、特别是在体外糖工程改造免疫球蛋白和还有其它糖基化的 目标分子的领域中铺平了道路。此处，具体地和示例性地提供了导致产生单唾液酸化和双 唾液酸化的免疫球蛋白G分子的方法，其中其比率借助控制（i)Λ108hST6Gal-I酶促活性 和（ii)能够以饱和方式唾液酸化目标分子的受体位点的人β-半乳糖苷-α-2, 6-唾液酸 转移酶I的酶促活性的量来控制。然而，定量唾液酸化控制待唾液酸化的目标分子的许多 其它体外唾液酸化方法变得可行，且可以从本公开内容来推断。
[0019] 在一个具体实施方案中，本文献公开了通过在ΗΕΚ293细胞中瞬时基因表达而高 产量表达人β-半乳糖苷-α-2, 6-唾液酸转移酶I(hST6Gal-I，EC2. 4. 99. 1 ;数据库条 目P15907)的两种不同变体，其中产率高达100mg/L。发现两种变体的特征在于令人惊讶 不同的唾液酸化活性。
[0020] 概述 在第一个方面，在此公开了SEQIDN0:3的N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2, 6-唾 液酸转移酶I(A108hST6Gal-I)用于从目标分子特异性形成