用于在原核细胞中重组生产多肽的方法
【技术领域】
[0001] 本发明公开通过敲除NADH脱氢酶II基因（ndh-基因）而遗传修饰的原核细胞和 其在生产多肽中的用途。
【背景技术】
[0002] 近年来蛋白质生产稳步增长，在不久的将来蛋白质可能成为可用于治疗各种疾病 的疗法中的最大组。蛋白质的影响来自于其特异性，如其特异的靶标识别和结合功能。
[0003] 在发酵方法中使用细胞培养物生产物质，特别是生产蛋白质。有两种不同的方法， 其一是细胞培养物未被遗传修饰而形成其自身代谢产物的方法，另一是生物体被遗传修饰 从而或者生产更为大量的自身物质如蛋白质或者生产外源（异源）物质。为产生物质的生 物体提供营养培养基，其保证了生物体的存活并使其能生产所需的目标化合物。众多用于 这些目的培养基是公知的，其允许特定宿主的最佳培养。
[0004] Riesenberg(Riesenberg，D.，等人，Curr.Opin.Biotechnol. 2(1991)380-384) 和Horn(Horn，U·，等人，Appl.Microbiol.Biotechnol· 46 (1996) 524-532)报道 了大肠杆菌的高细胞密度培养。Riesenberg,D.和Guthke,R. (Appl.Microbiol. Biotechnol. 51(1999)422-430)报道了微生物的高细胞密度培养。Shiloach，J.和Fass，R. (Biotechnol.Advances23(2005)345-357)对培养大肠杆菌到高细胞密度进行了综述。
[0005] Calhoun等人（J.Bacteriol. 175(1993)3020-3025)报道 了大肠杆菌的 能效--在需氧呼吸链组分中突变的影响。Melo等人（Microbiol.Mol.Biol. Rev. 68 (2004) 603-616)报道了对II型NAD⑵Η:醌氧化还原酶的新见解。Yun等人 (J.Appl.Microbiol. 99 (2005) 1404-1412)报道了在NADH脱氢酶缺陷大肠杆菌的adhE或 pta-ackA突变体中乳酸和琥?自酸形成的增强。
[0006] Trinh等人（Met.Eng. 8(2006)628)报道了最高效的生物质生产大肠杆菌细菌的 设计、构建和性能。
【发明内容】
[0007] 已发现，通过缺失/失活编码酶NADH脱氢酶II的ndh-基因，可获得遗传修饰的原 核生物，相对于除ndh-基因外同基因的亲代菌株，其具有相当的摄氧率、相当的生长率、但 增加的生产力（productivity)。因此，已发现，通过ndh-基因的缺失/失活，可以增加原核 生物的比生产力。
[0008] 如本文所报道的一个方面是用于在原核细胞中重组生产多肽的方法，其包括以下 步骤：
[0009] -培养表达多肽的原核细胞（即培养包含编码多肽的核酸的细胞），和 [0010]-从细胞或培养基中回收多肽，
[0011] 其中，原核细胞是ndh-基因缺陷的（即原核细胞不包含/含有ndh-基因的功能 拷贝）。
[0012] 如本文所报道的一个方面是用于在原核细胞中重组生产多肽的方法，其包括以下 步骤：
[0013] -培养表达多肽的原核细胞（即培养包含编码多肽的核酸的细胞），和
[0014] -从细胞或培养基中回收多肽，
[0015] 其中，原核细胞是ndh-基因缺陷的（即原核细胞不包含/含有ndh-基因的功能 拷贝），
[0016] 和其中所述多肽不是酶。
[0017] 如本文所报道的一个方面是用于在原核细胞中重组生产多肽的方法，其包括以下 步骤：
[0018] -培养表达多肽的原核细胞（即培养包含编码多肽的核酸的细胞），和
[0019] -从细胞或培养基中回收多肽，
[0020] 其中，原核细胞是ndh-基因缺陷的（即原核细胞不包含/含有ndh-基因的功能 拷贝），
[0021] 且其中所述多肽不是呼吸链途径酶或由抗生素抗性诱导基因编码的多肽。
[0022] 如本文所报道的一个方面是用于在原核细胞中重组生产多肽的方法，其包括以下 步骤：
[0023] -培养表达多肽的原核细胞（即培养包含编码多肽的核酸的细胞），和
[0024] -从细胞或培养基中回收多肽，
[0025] 其中，原核细胞是ndh-基因缺陷的（即原核细胞不包含/含有ndh-基因的功能 拷贝），
[0026] 和其中所述多肽不是NADH脱氢酶、SoxM型氧化酶、Sox型氧化酶、细胞色素bd型 氧化酶、细胞色素bo型氧化酶或由抗生素抗性诱导基因编码的任何多肽。
[0027] 如本文所报道的一个方面是用于在原核细胞中重组生产多肽的方法，其包括以下 步骤：
[0028] -培养表达多肽的原核细胞（即培养包含编码多肽的核酸的细胞），和
[0029] -从细胞或培养基中回收多肽，
[0030] 其中，原核细胞是ndh-基因缺陷的（即原核细胞不包含/含有ndh-基因的功能 拷贝），
[0031] 和其中所述原核细胞具有基因型thi_l、ndh、pyrF、acnA、aceA、icd,其中acnA基 因编码的多肽包含S68G突变，aceA基因编码的多肽包含S522G突变，和icd基因编码的多 肽包含D398E和D410E突变。
[0032] 如本文所报道的一个方面是用于在原核细胞中重组生产多肽的方法，其包括以下 步骤：
[0033] -培养表达多肽的原核细胞（即培养包含编码多肽的核酸的细胞），和
[0034] -从细胞或培养基中回收多肽，
[0035] 其中，原核细胞是ndh-基因缺陷的（即原核细胞不包含/含有ndh-基因的功能 拷贝），
[0036] 和其中所述多肽是免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、免疫球蛋白-毒素缀合物、免疫 球蛋白片段-毒素缀合物、毒素、细胞因子或激素。
[0037] 如本文所报道的一个方面是用于在原核细胞中生产多肽的方法，其包括以下步 骤：
[0038] -培养表达多肽的原核细胞（即培养包含编码多肽的核酸的细胞），和
[0039] -从细胞或培养基中回收多肽，
[0040] 其中，原核细胞是ndh-基因缺陷的（即原核细胞不包含/含有ndh-基因的功能 拷贝），
[0041] 和其中所述多肽不是酶。
[0042] 如本文所报道的一个方面是用于在原核细胞中生产多肽的方法，其包括以下步 骤：
[0043] -培养表达多肽的原核细胞（即培养包含编码多肽的核酸的细胞），和
[0044] -从细胞或培养基中回收多肽，
[0045] 其中，原核细胞是ndh-基因缺陷的（即原核细胞不包含/含有ndh-基因的功能 拷贝），
[0046] 且其中所述多肽不是呼吸链途径酶或由抗生素抗性诱导基因编码的多肽。
[0047] 如本文所报道的一个方面是用于在原核细胞中生产多肽的方法，其包括以下步 骤：
[0048] -培养表达多肽的原核细胞（即培养包含编码多肽的核酸的细胞），和
[0049] -从细胞或培养基中回收多肽，
[0050] 其中，原核细胞是ndh-基因缺陷的（即原核细胞不包含/含有ndh-基因的功能 拷贝），
[0051] 和其中所述多肽不是NADH脱氢酶、SoxM型氧化酶、Sox型氧化酶、细胞色素bd型 氧化酶、细胞色素bo型氧化酶或由抗生素抗性诱导基因编码的任何多肽。
[0052] 如本文所报道的一个方面是用于在原核细胞中生产多肽的方法，其包括以下步 骤：
[0053] -培养表达多肽的原核细胞（即培养包含编码多肽的核酸的细胞），和
[0054] -从细胞或培养基中回收多肽，
[0055] 其中，原核细胞是ndh-基因缺陷的（即原核细胞不包含/含有ndh-基因的功能 拷贝），
[0056] 和其中所述原核细胞具有基因型thi_l、ndh、pyrF、acnA、aceA、icd,其中acnA基 因编码的多肽包含S68G突变，aceA基因编码的多肽包含S522G突变，和icd基因编码的多 肽包含D398E和D410E突变。
[0057] 如本文所报道的一个方面是用于在原核细胞中生产多肽的方法，其包括以下步 骤：
[0058] -培养表达多肽的原核细胞（即培养包含编码多肽的核酸的细胞），和
[0059] -从细胞或培养基中回收多肽，
[0060] 其中，原核细胞是ndh-基因缺陷的（即原核细胞不包含/含有ndh-基因的功能 拷贝），
[0061] 和其中所述多肽是免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、免疫球蛋白-毒素缀合物、免疫 球蛋白片段-毒素缀合物、毒素、细胞因子或激素。
[0062] ndh-基因的产物是NADH脱氢酶II。
[0063] 在一个实施方案中，原核细胞进一步是bd-型氧化酶缺陷的。
[0064] 在一个实施方案中，原核细胞是大肠杆菌细胞。在一个实施方案中，大肠杆菌是大 肠杆菌K12。
[0065] 在一个实施方案中，所述方法是一种高细胞密度培养。
[0066] 在一个实施方案中，ndh-基因（NADH脱氢酶II)缺陷的原核细胞，与除具有功能 性ndh-基因（NADH脱氢酶II