用于将多肽转移入细胞中的方法

专利名称：用于将多肽转移入细胞中的方法
用于将多肽转移入细胞中的方法本发明涉及一种用于将多肽转移入细胞中的方法。本发明进一步涉及多肽特异性免疫细胞的检测和多肽特异性T细胞的引发、扩增和再活化。此外，本发明涉及与尿素组合的本发明方法的多肽及其用于研究、诊断或治疗和预防动物和人中疾病的用途。免疫系统的获得性分支由体液(免疫球蛋白)和细胞免疫防御组成。细胞和微生物多肽自抗原呈递细胞(APC)通过特异性切割加工，并且其片段(表位)与细胞表面上的I和/或II类MHC分子一起呈递。依靠其T-细胞受体，T细胞特异性识别具有MHC蛋白的复合物中呈递的表位，并开始免疫反应。可以使用特定表面蛋白来将T细胞细分成不同效应器群体。CD4+T细胞(T辅助细胞)识别肽，该肽与MHC II类蛋白一起在APC表面上呈递给它们，并且在免疫防御的协调 (orchestration)和极化中发挥至关重要的作用。T辅助细胞可以细分成T辅助1 (Th-I)、 T辅助2 (Th-2)和T辅助17 (Th-17)细胞。Th-I细胞以细胞因子IFN- γ和TNF- α的生成和转录因子T-bet的表达为特征。Th-I细胞通过增强巨噬细胞的杀伤功效并刺激细胞毒性 ⑶8+T细胞(细胞毒性T细胞(CTL)或⑶4TD8+T细胞)的增殖来激活细胞免疫应答。Th_2 细胞以IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13的分泌和转录因子GATA-3的生成为特征，并且支持抗体的生成及抗体类别转换(免疫应答的体液分支)。Th-17细胞以IL-17的生成为特征，并且认为其在自身免疫病中发挥关键的作用。除Th-I、Th-2和Th-17细胞外，⑶4+T细胞群体包括约10%调节性T细胞，其在缓和(dampening)免疫应答中、在预防自身免疫病中及在口服耐受性中发挥至关重要的作用。调节性T细胞可以细分成⑶4_、⑶25-和CTLA4-阳性天然调节性T细胞(Treg)及Th3 和Trl细胞，其以TGF-β (Th3细胞)或IL-10 (Trl细胞)的生成为特征。⑶8+T细胞的重要性在于识别并破坏变性的、赘生性(neoplastic)和恶性的细胞及被微生物或寄生物感染的组织和细胞。如此，T细胞是用于预防和控制微生物尤其是病毒诱导的疾病，及用于识别和破坏变性的和赘生性细胞的获得性免疫系统的一种重要的保护机制。在上文所提及的T细胞群体外，已经描述了循环T细胞的其它亚群，其具有双重阳性⑶4+⑶8+表型(例如，⑶4+⑶8dim、⑶P1TDStoight和⑶4hiOT8hiT细胞)。^4+008<"1细胞表达^8(! α同二聚体，并且在血液中可以以较低的频率(占 CD3+T细胞总群体的少于2%)检出。在健康个体中以及还在患有多种疾病(包括不同病毒，例如人免疫缺陷病毒1型(HIV-I)和人巨细胞病毒(CMV)的感染)的患者及患有各种自身免疫病的患者中都观察到⑶4+⑶SdimT细胞的短暂或持续的扩增。⑶4dimCD8toightT细胞是 ⑶8+T细胞的活化表型，如通过与其⑶4TD8+对应物相比多种活化和功能性标志物(⑶95、 CD25、CD38、CD69、CD28 和 CD45RA+CD45RA0+)的水平升高所确定的。CD4hiCD8hiT 细胞表达高水平的CD4分子和CDSa β链，并且在自身免疫状况中是升高的。专门的APC诸如树突细胞、单核细胞、巨噬细胞，还有非专门的APC诸如B细胞、嗜中性粒细胞和成纤维细胞在触发对外源和内源免疫原的T细胞应答中及在诱导对内源组织的T细胞耐受性中都发挥枢要的作用。通过同时触发两种信号来发生T细胞的活化和增殖。第一信号由识别与APC表面上的MHC结合的表位的T细胞受体引导入T细胞中。
第二共刺激信号通过APC上的共刺激分子诸如B7. 1 (⑶80)或B7. 2 (⑶86)与T细胞表面上的相关受体(诸如CD28)的特异性相互作用来介导。在没有共刺激信号的情况中， 表位特异性T细胞变得无变应性。无变应性描述了 T细胞不能增殖，而且不能响应抗原的状态。多肽的条件决定性确定APC的表位加工和呈递的效率和路径。另外，多肽施用形式不利地影响APC活化的程度并如此不利地影响诱导的免疫应答的谱(profile)。如此， 多肽的浓度和生物化学特性及免疫调节性物质(特别是细菌组分诸如核酸(例如CpG阳性 DNA)、脂多糖(LPS)和多肽(例如鞭毛蛋白)及细胞因子(例如IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、 IFN-Y、IL-18、IL-23)的存在或缺乏是关于免疫系统的细胞(T辅助-I(Th-I)型介导的免疫力)或体液分支(T辅助-2(Th-2)型介导的免疫应答)是否是活化的或者免疫应答是否发生致耐受性的决定因素。迄今，仅描述了很少的用于将外源多肽移位入哺乳动物细胞中的方法。此外，仅描述了很少的用于将外源多肽移位入APC的MHC I类加工途径中的方法。迄今，例如，已经不同程度成功地使用微注射、电穿孔和脂转染的机械方法将蛋白质转移入细胞中。其它用于将多肽转移入细胞中的方法基于使用蛋白质转导域(PTD)。包含10至 35个氨基酸的这些富含精氨酸的氨基酸序列源自例如HIV Tat蛋白、单纯疱疹病毒(HSV) VP22 蛋白或果蝇触角足同源蛋白(Drosophila Antennapedia homeoprotein ;Antp)。另夕卜，依靠噬菌体文库确定合成的PTD序列。可以通过多肽与PTD的偶联来相当大地提高其膜流行(membrane prevalence)禾口移位。为了将蛋白质转移入细胞中而描述的其它方法基于使用各种阳离子脂质配制剂或ISCOM 颗粒(CSL Limited, Victoria, Australia)中的多肽掺入。所有这些方法对于常规使用是过于工作或成本密集的。另外，许多特定的转移系统拥有细胞毒性(例如脂质体)或免疫调节性特性( ISCOM 颗粒)，其随后可能不利地影响经处理细胞的天然特性。考虑到细胞免疫应答，特别是细胞毒性T细胞(CTL)对于控制微生物感染和肿瘤的重要性，目前在测试用于在体内引发在T辅助细胞外的CTL的许多新策略。这些包括使用肽、多肽、蛋白质、病毒样颗粒、活的减毒细菌和病毒、重组活疫苗(基于多种重组细菌和病毒的)和DNA疫苗。此外，在具有I和II类MHC蛋白的背景中呈递特定肽的经离体处理的自体APC是适合于诱导多肽特异性免疫应答的试剂，特别是在治疗性处理中。在较早的研究中，用肿瘤提取物、细胞裂解物、表达质粒和信使RNA脉冲(pulse)的APC已经证明适合于同时诱导 CD4+和 CD8+T 细胞应答(Herr 等(2000)，Blood，96 1857)。此外，在 EP 0421949B1 中记载了可以使用用碱金属氰酸盐预处理的经化学修饰的变应原来诱导IgG类的特异性抗体。目前，多种方法可用于刺激免疫细胞的多种群体，其不同程度地适合于检测抗原特异性免疫细胞的特定群体。用限定长度的肽(最佳地对于加载MHC I类蛋白为8-12个氨基酸，而最佳地对于加载MHC II类蛋白为16至22个氨基酸)直接加载膜结合MHC蛋白是一种常用于刺激免疫细胞的限定群体，特别是CD8+T细胞和CD4+T细胞的方法。另外，可以使用14-至16-聚物肽(14-to 16-mer ρ印tide)来同时活化CD4+和CD8+T细胞。然而，对使用这种用于测量蛋白质特异性T细胞的刺激方法的重要限制在于如下的事实，即T细胞表位的特异性识别受到MHC限制；S卩，表达不同MHC蛋白的个体识别多肽内的不同表位，这使得对具有可变 MHC样式的血液供体中多肽特异性T细胞的分析困难得多得多。另外，不同大小的肽(8-至12-和18-至22-聚物)优先在MHC I或II类蛋白上呈递。如此，使用此方法仅可以特异性记录(register)针对在限定的MHC蛋白背景中的已知表位的T细胞。或者，可以使用跨越完整蛋白质的肽的集合(例如在13个氨基酸上重叠的14至 16-聚物肽)来同时检测蛋白质特异性T细胞。然而，覆盖完整蛋白质的重叠肽的集合的生成是昂贵且代价高的。另外，包括已知T细胞表位的许多肽的应用受到其活化T细胞的低性能的限制。 在本文中，通过MHC/肽复合物的T细胞活化效率依赖于(i)所述肽对所述MHC分子的亲和力，(ii)肽MHC复合物的稳定性和(iii) T细胞受体对MHC/肽复合物的亲和力。然而，仅描述了一种技术来提高表位刺激T细胞的效率。Peterson及同事的小组报告了磷酸化的、HLA A2限制性CTL表位在与其非磷酸化对应物相比时展现了改变的刺激 CTL 的能力(Petersen 等(2009)，PNAS 106 :2776-2781)。与之相对，可溶性多肽和蛋白质适合于检测多肽特异性⑶4+T细胞，无论供体的 MHC限制和位于多肽中的T细胞表位的详细知识如何。可溶性多肽几乎仅经由APC中的MHC II类加工和呈递路径来摄取并回收，从而此方法几乎仅适合于检测⑶4+T细胞。此外，还已经描述了用于使多肽变性的多种方法，其使得将这些多肽供应给MHC I类和MHC II类加工和呈递路径成为可能。这些方法包括例如用热或十二烷基硫酸钠 (SDS)处理多肽。这些方法经证明适合于在鼠APC中的MHC I和II类分子上实现表位呈递 (Schirmbeck 等(1994)，Eur. J. Immunol.，24 :2068) ； (Schirmbeck 等(1995)，Vaccine,13 857)。在这些研究中，显示了依靠多种机制将以多种不同方式变性的蛋白质摄取到APC中， 并且所述蛋白质在其诱导MHC I类分子的多肽加载的效率方面存在不同。如此，与经SDS 处理的蛋白质相比，使用热失活法(于60°C 1小时或于100°C 15分钟)处理的多肽在经处理的鼠APC中仅诱导对MHC I类蛋白上表位呈递的略微刺激。另一方面，SDS变性方法经证明由于高毒性而基本不适合于在人细胞培养物中使用。另一种用于预处理多肽的方法记载于EP 1487497B1，其中用尿素预处理多肽。另一种用于刺激APC上的表位的MHC I和II类呈递的方法基于在特定结构，例如脂质体、特定的载体物质、病毒样颗粒或脂蛋白颗粒中掺入多肽。一开始的研究确认了 HIV-lPr55gag病毒样颗粒用于诊断CD4+和CD8+T细胞的适合性Gester等OOOO)，AIDS, 14 :2653-60)。然而，颗粒结合多肽的生成是昂贵且代价高的。另一种用于刺激APC上的表位的MHC I和II类呈递的方法基于使用质粒、非病毒或病毒载体来掺入编码期望的多肽的多核苷酸。出于诊断目的使用质粒的缺点是使用迄今可用的转染方法，例如电穿孔或脂转染来将核酸转移入APC中的低效率和细胞毒性效果。 与质粒相比，病毒或细菌载体通常具有显著升高的APC转染率。然而，这些基因转移系统通常不是免疫学惰性的，而且调控APC进行多肽的呈递和表位加工的能力。另外，这些基于核酸的方法的使用受到基因运输者(gene ferry)的昂贵且生产代价高的限制。迄今为止，已经通过测定在特异性刺激后的细胞增殖或由T细胞生成的信使物质
6(细胞因子)来检测⑶4+T细胞。通常使用常规的氚标记胸苷(3H-TdR)掺入测定法或非放射性标记增殖测定法诸如5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU) ELISA、四唑微板测定法和酸性磷酸酶测定法来检测细胞增殖。可以依靠细胞因子ELISA、ELISPOT测定法或依靠FACS技术通过测定胞内细胞因子(例如胞内细胞因子染色)或分泌性细胞因子(例如FACS分泌测定法)来测定用多肽进行特异性刺激后来自CD4+T细胞的细胞因子生成。⑶8+T细胞已经通过在特异性刺激，特别是干扰素-Y (IFN- y )的特异性刺激后测定其特异性细胞毒性活性或由CD8+T细胞生成的信使物质(细胞因子)来常规地检测。通常依靠经典的铬释放测试或适当的非放射性方法来检测细胞毒性，其中测量由通过具有细胞毒性特性的效应细胞进行的特异性裂解所致的酶或ATP自靶细胞的释放。或者，可以通过测定⑶107a，b (LAMP 1，2蛋白)的瞬时表面表达来测量⑶8+T细胞的细胞毒性活性。可以依靠细胞因子ELISA、ELISPOT测定法或通过使用FACS技术通过测定胞内细胞因子或分泌性细胞因子(FACS分泌测定法)来测定表位特异性刺激后来自CD8+T细胞的细胞因子生成。通常使用IFN- y ,TNF和IL-2作为多肽特异性⑶8+T细胞存在的标志细胞因子。迄今为止，例如，已经使用了自体APC来刺激表位或多肽特异性CD8+T细胞，所述自体APC与其表面上的I类MHC蛋白一起呈递⑶8+T细胞表位。APC上MHC I类介导的表位呈递的诱导至今已经通过将它与合适长度(8至16个氨基酸)的携带表位的肽一起温育， 通过与脂多肽、特定多肽或包装于特定结构中的多肽、产生多肽的细胞的裂解物及重组和活的减毒微生物，特别是病毒或细菌一起温育来介导。四聚物(Coulter)、五聚物(Proimmune)和 Str印tamer 技术(IBA，G0ttingen)是用于检测表位特异性CD8+T细胞和CD4+T细胞的方法。然而，这些方法在T细胞诊断学中普遍使用方面的限制基于制造这些试剂非常高的成本。另外，四聚物、五聚物和Mi^ptamer 迄今为止仅可用于有限范围(i^pertoire)的MHC型，特别用于常见的MHC I类蛋白，例如 HLAA2。另外，此技术仅容许检测限定的表位特异性T细胞。针对多种表位的T细胞反应性只有在花费大量时间和金钱的条件下可以使用这种方法来测定。如此，本发明的目的是提供一种用于将多肽转移入细胞中的新方法。
此目的通过权利要求中所限定的主题来解决。使用下列图来解释本发明。

图1显示了伯胺氨甲酰化(carbamoylation)的反应机制。㈧尿素与铵和氰酸盐相平衡。热和/或时间驱动朝向尿素分解的反应，引起氰酸的累积。(B)在中性至碱性 PH，氰酸受到伯胺的亲核攻击，形成氨甲酰化的胺，如通过蛋白质的氨甲酰化所表明的，其中特别是蛋白质的氨基端，还有蛋白质中的赖氨酸(总体上)和其它氨基酸是氨甲酰化的 (Angel 等(2007)Rapid Commun. Mass Spectrom. 21 :1623)。图2显示了于低温保持的尿素溶液中的氰酸盐积累。曲线A、B、和C分别为于 25°C保持的6. 66,3. 33、和1. IlM尿素，曲线D 于5°C保持的6，66M尿素(Marier等(1964) Analytical Biochemistry 7 :304)。图3显示了于85°C保持的6. 66M尿素中的氰酸盐积累及相关变化(Marier等 (1964)Analytical Biochemistry 7:304)。图4显示了于25°C保持的6. 66M尿素中的氰酸盐浓度的变化。曲线A 经加热
7的溶液(即，85°C，50分钟)的再平衡。曲线B:直接平衡(Marier等(1964) Analytical Biochemistry 7 :304)。图5显示了于-40°C、于4°C和于25 °C保持的8M尿素中的氰酸盐浓度的变化 (Christison 等，Direct Determination of Cyanate in a Urea Solution and a Urea Containing Protein Buffer Using a Reagent-Free Ion Chromatography System “， Dionex (www. dionex. com))图6显示了加热2M尿素溶液(终浓度)中的多肽导致蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移行为改变。将(A) 0. 84mg/ml HIV壳体蛋白p24 (溶解于150mM NaCl, 50mM NaP, pH 7. 6中)，(B) lmg/ml牛血清清蛋白(BSA)或(C)O. 64mg/ml细小病毒B19 VP2颗粒(溶解于 38% (w/v) CsCl 中)与(B，D, E) H2O 禾口 30mM Tris pH 3. 9 或(A, C, F) 6M 尿素溶液禾口 30mM Tris pH 3. 9以1 1 1 (vol/vol/vol)混合，然后于96°C在热混合仪中温育60分钟。然后，将蛋白质通过(A) 12.5%或(B，C)10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)来分离，并通过用考马斯亮蓝染色来显现蛋白质。M 分子量标志物(A，B) =Colour Plus预染色蛋白质标志物，宽范围NEB P7703 ； (C)预染色蛋白质标志物，宽范围NEB P7703。大小以千道尔顿(kDa)标示。图7显示了遵循不同氨甲酰化方案用尿素的处理导致展现分子量增加的经修饰的BSA蛋白，如通过聚丙烯酰胺凝胶中的迁移改变所显示的。将lmg/ml BSA与(A) H20/HC1 (pH 3.6)禾口 30mM Tris pH 3. 6 或(B，C)6M 尿素溶液和 30mM Tris pH 3. 6 以 1:1:1 (vol/vol/vol)混合，并㈧于96°C温育O分钟或⑶于96°C温育30分钟或 (C)于 96°C温育 60 分钟。(D)遵循由 Angel 及同事(Angel 等(2007) Rapid Commun. Mass Spectrom. 21 :1623)描述的蛋白质氨甲酰化方案处理BSA。将IOnmol BSA在100 μ 1 8Μ尿素/200mM Tris-HCl, pH 7. 4中溶解。用20mM 二硫苏糖醇(DTT)于50°C将此溶液还原2 小时，接着用45mM碘乙酰胺(IDA)于室温进行氨甲酰甲基化(carbamidomethylation)达 1小时。将变性、还原、并烷基化的蛋白质的溶液用50mM碳酸氢铵以1 8稀释以调节尿素浓度至1M，并于37°C温育过夜。(E)如(D)中所描述的处理BSA。然后，将溶液在真空下于37°C干燥，并在300μ 1 8Μ尿素/200mM Tris-HCl,pH 8. 5中溶解。然后，将样品涡旋振荡，直至完全溶解，然后于80°C温育4小时，期间周期性涡旋振荡(依照Angel等Q007) Rapid Commun. Mass Spectrom. 21 :1623)。然后，将蛋白质通过10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)来分离，并通过用考马斯亮蓝染色来显现。M 预染色蛋白质标志物，宽范围NEB P7702。大小以千道尔顿(kDa)标示。图8显示了遵循不同氨甲酰化方案用尿素处理BSA导致展现改变的PKi值的经修饰的BSA蛋白，如通过二维电泳所显示的。将lmg/ml BSA与(A)H20/HC1 (pH 3.6)和3OmM Tris pH 3. 6 或(B，C)6M 尿素溶液和 30mM Tris pH 3. 6 以 1 1 1 (vol/vol/vol)混合，并于96°C温育(A)O分钟、(B) 30分钟或(C)60分钟。(D)遵循由Angel及同事(Angel 等Q007) Rapid Commun. Mass Spectrom. 21 :1623)描述的蛋白质氨甲酰化方案处理BSA。 将 IOnmol BSA 在 100 μ 1 8Μ 尿素 /200mM Tris-HCl, pH 7. 4 中溶解。用 20mM 二硫苏糖醇 (DTT)于50°C将此溶液还原2小时，接着用45mM碘乙酰胺(IDA)于室温进行氨甲酰甲基化达1小时。将变性、还原、并烷基化的蛋白质的溶液用50mM碳酸氢铵以1 8稀释以调节尿素浓度至1M，并于37°C温育过夜。然后，将蛋白质通过在IEF条(Immobiline DryStrip
8pH 3-10，11cm,GE Healthcare)上以的等电聚焦，接着进行 10% SDS-PAGE 电泳来
分离。通过银染色来显现蛋白质。M 预染色的蛋白质标志物，宽范围NEB P7702。蛋白质标准品的大小以千道尔顿(kDa)标示。图9显示了通过用2M尿素，IOmM Tris处理(于96°C温育2小时)对BSA的修饰基本上不受范围为PH 3. 9至pH 8. 7的pH值影响。将lmg/ml BSA与(A-C) 6M尿素和(A) 3OmM Tris pH 3. 9 或(B) 3OmM Tris pH 6. 8、或(C) 30mM Tris pH 8. 7 或者与(D-F) H2O禾口 (D) 3OmM Tris pH 3.9或伍)30福 Tris pH 6. 8 或(F) 30mM Tris pH 8. 7 以 1 1 1 (vol/vol/ vol)混合，然后于96°C在热混合仪(300rpm)中温育2小时。然后，将蛋白质通过10 % SDS-PAGE来分离，并通过考马斯亮蓝染色来显现蛋白质。M 预染色的蛋白质标志物，宽范围NEB P7702。大小以千道尔顿(kDa)标示。图10显示了对BSA的尿素介导的修饰的效率依赖于温育时间。㈧将lmg/ml牛血清清蛋白(BSA)与6M尿素和30mM Tris pH 3. 9以1 1 1 (vol/vol/vol)混合，并于 96°C温育达指定的温育时间(0至60分钟)。(B)将lmg/ml牛血清清蛋白(BSA)与6M尿素和30mM Tris pH 3. 9以1 1 1 (vol/vol/vol)混合，并于96°C温育达指定的温育时间(0-8小时)。然后，将蛋白质通过10% SDS-PAGE来分离，并通过用考马斯亮蓝染色来显现蛋白质。M 预染色的蛋白质标志物，宽范围NEB P7702。大小以千道尔顿(kDa)标示。图11显示了对BSA的尿素介导的修饰的效率依赖于温度。将在H2O中的lmg/ml BSA 与 6M 尿素和 30mM Tris pH 3. 9 以 1 1 1 (vol/vol/vol)混合(第 A 道-第 L 道)， 并于指定的温度(0至96°C )温育2小时。然后，将蛋白质通过10% SDS-PAGE来分离，并通过用考马斯亮蓝染色来显现蛋白质。M 预染色的蛋白质标志物，宽范围NEB P7702。大小以千道尔顿(kDa)标示。图12显示了用经放置尿素(cbposed urea)(于室温7至14天，然后于96°C加热超过1小时)处理人巨细胞病毒(CMV) IEl蛋白导致展现改变的PKi值的经修饰的IEl蛋白，如通过二维电泳所显示的。将(A) 100 μ 1 IEl蛋白(PBS中的0. 89yg/ml)或(B)与8M 经放置尿素(于96°C加热超过1小时，然后于室温保持7至14天)以1 1 (vol/vol)混合的在PBS中的IEl于40°C温育过夜。然后，将蛋白质通过在IEF条(pH 3_10，线性)上以38300Vh的等电聚焦，接着进行10% SDS-PAGE来分离。通过银染色来显现蛋白质。M: 预染色的蛋白质标志物，宽范围NEB P7703。大小以千道尔顿(kDa)标示。图13显示了对未处理的BSA和用经放置尿素处理的BSA的MALDI-TOF MS分析。 自(A)未修饰的BSA ；双重同位素质子化质量33230. 3和(B)与8M经放置尿素(于室温7 至14天，然后于96°C加热超过1小时)混合(1 1 ；vol/vol)后的BSA ；双重同位素质子化质量33497获得谱。如此，在所描述的测试条件下，BSA的尿素处理诱导226. 7Da的质量转变。图14显示了尿素的温育温度和预加热时间对于对BSA的尿素诱导的修饰的效率是至关重要的因素。将在H2O中的lmg/ml BSA与(A，C，E，G)新鲜制备的4M尿素溶液或出，0斤，《)411尿素(其于961预处理1小时，然后快速冷却)以1 1 (vol/vol)混合。然后，将样品于40°C在热混合仪(以300rpm)中温育(A，B)0小时、(C，D)2小时、(E，F)4小时或(G，H)17小时。然后，将蛋白质通过10% SDS-PAGE来分离，并通过用考马斯亮蓝染色来显现蛋白质。M:Colour Plus预染色的蛋白质标志物，宽范围NEB P7703。大小以千道尔顿(kDa)标示。图15显示了于40°C与经放置尿素一起温育M小时诱导BSA的质量迁移。将在 H2O中的lmg/ml BSA与4M经放置尿素(其于96°C预处理1小时，然后于室温温育8天)以 1 1(V01/V01)混合，并于40°C温育指定的时间点(0至对小时)。然后，将蛋白质通过 10% SDS-PAGE来分离，并通过用考马斯亮蓝染色来显现蛋白质。M=Colour Plus预染色的蛋白质标志物，宽范围NEB P7703。大小以千道尔顿(kDa)标示。图16显示了遵循不同氨甲酰化方案用尿素处理BSA导致展现改变的pKi值的经修饰的BSA蛋白，如通过二维电泳所分析的。将lmg/ml BSA与(A) H20/HC1 (pH 3. 6)和30mM Tris pH 3. 6 或者(B，C)与 6M 尿素溶液和 30mM Tris pH 3. 6 以 1 1 1 (vol/vol/vol) 混合，并于96°C温育㈧O分钟、⑶30分钟或(C) 60分钟。(D)或者，将IOmM BSA与4M经放置尿素(于96°C加热1小时，然后于室温保持3个月)以1 1 (vol/vol)混合，并于 40°C温育20小时。然后，将蛋白质通过在IEF条上以约(A-D) 26350Vh的等电聚焦，接着进行10% SDS-PAGE电泳来分离。通过银染色来显现蛋白质。蛋白质标准品的大小以千道尔顿(kDa)来标示。图17显示了通过氰酸钾对BSA的化学氨甲酰化。将BSA(在水中的lmg/ml)于 40°C在热混合仪中与终浓度(A) OmM、(B) 25mM、(C) 100mM、(D) 500mM和(E) IOOOmM的氰酸钾以1 1 (vol/vol)混合1小时。将反应产物通过10% SDS PAGE来分离，并通过用考马斯亮蓝染色来显现。M 预染色的蛋白质标志物，宽范围NEB P7702。大小以kDa标示。图18显示了通过氰酸钾对BSA的化学氨甲酰化。将BSA(在水中的lmg/ml)与增加浓度的氰酸钾水溶液(终浓度 KOCN (A) OmM、(B) ImM, (C) 5mM、(D) 10mM、(E) 20mM、(F) 50mM、 (G) lOOmM、(H) 200mM、(J) 500mM)以(1 lv/v)混合。然后，将蛋白质于40°C在热混合仪中温育19. 5小时，随后在在10% SDS-凝胶上分离。通过用考马斯亮蓝染色来显现蛋白质。 M 分子量标志物(预染色的蛋白质标志物，宽范围(NEB P7708))。蛋白质的大小以千道尔顿(kDa)标示。图19显示了来自经pGEX-KG-IEl转染的细菌(M15[pREP4])的裂解物的人巨细胞病毒IEl蛋白的亲和纯化。将指定的纯化步骤的样品在12. 5% SDS-PAGE上分离，并用考马斯亮蓝染色。标志物预染色的蛋白质标志物，宽范围(Biolabs ；NEB7703)，大小以kDa标
7J\ ο图20显示了经尿素修饰的多肽特异性再活化⑶4+和/或⑶8+T细胞的能力增加， 其通过用氨甲酰化或未氨甲酰化形式的合成肽或重组CMV IEl蛋白再刺激后对CMV阳性 HLA A2阳性个体的肝素化全血的流式细胞术分析得到。在这些实验中，将纯化的IEl蛋白 (PBS中的0. 89 μ g/ml)与8M经放置尿素(于96°C预温育过夜)以1 1 (Vol/Vol)混合， 并于40°C温育过夜。将肽(在100% DMSO中的10 μ g/ μ 1)与8Μ经放置尿素(于96°C预温育过夜)以1 1 (Vol/Vol)混合，并于40°C温育过夜。显示了⑶4+Th细胞和⑶8+细胞毒性T细胞，并分析IFN- γ分泌，如通过胞内细胞因子染色所测定的。用未处理的或经尿素处理的IEl蛋白或YIL肽(代表IEl蛋白内HLA A2限制性CTL表位)刺激HLA A2阳性、 CMV-血清阳性个体的肝素化全血达6小时，并通过胞内IFN- γ染色来测定IEl或YIL-特异性⑶4+和⑶8+T细胞的活化。用对照肽(其代表HIV pM蛋白内的鼠CTL表位)刺激的细胞充当阴性对照。通过在刺激的最后4小时添加布雷菲德菌素(Brefeldin)A来抑制来自活化的细胞的细胞因子分泌。点线图显示了对数荧光强度。图21显示了在CMV阳性HLA A2阳性个体的肝素化全血中经氰酸盐和经尿素-氨甲酰化的肽特异性再活化CD8+T细胞的能力增加，如通过流式细胞术分析所显示的。在这些实验中，将合成肽YIL (在100% DMSO中的10 μ g/μ 1)与8Μ经放置尿素(于96°C预温育过夜)或200mM氰酸钾(在H2Odest中)以1 1 (Vol/Vol)混合，并于40°C温育过夜。然后，用10 μ g/ml ElOF肽(其覆盖HIV-Itelltl)Gag的pM壳体区内的鼠CTL表位(aa291_300) (Wild 等· (2004) Vaccine. 2004 ；22 :1732-1743))或 HL 肽(其代表 IEl 蛋白内的 HLA A2 限制性CTL表位)或备选地YIL肽(其用IOOmM KOCN或4M经放置尿素氨甲酰化)刺激HLA A2阳性、CMV血清阳性个体的肝素化全血达9小时。对于对照，用4mM尿素或200mM KOCN 刺激细胞。使用FACS技术通过胞内IFN- γ染色来测定YIL-或PSA-特异性⑶8+T细胞的活化。通过在刺激的最后7小时添加布雷菲德菌素A来抑制来自活化的细胞的细胞因子分泌。点线图显示了对数荧光强度。图22显示了用代表p24-特异性CTL表位或无关CTL表位的合成肽再刺激后在没有或存在免疫刺激性CpG ODN 1668的情况中用未修饰的或氨甲酰化的pM免疫的小鼠的脾细胞的流式细胞术分析。对照包括用PBS或HIV Gag VLP免疫的小鼠的特异性或非特异性再刺激的脾细胞。显示了分析IFN-γ分泌的CD8+T细胞的数目，如通过胞内细胞因子染色所测定的。在这些实验中，在没有或存在免疫刺激性CpG ODN 1668的情况中用未修饰的或经尿素修饰的HIV p24蛋白免疫6只BALB/c小鼠(Bauer等，(1999) Immunology 97 699)。对于阴性和阳性对照，用PBS或HIV Gag病毒样颗粒(VLP)免疫小鼠(Demi等2005， Mol. Immunol. 42 :259)。在初次免疫后的第2周和第4周时，小鼠接受用相同免疫原的加强注射。第一次和第二次加强注射后7天，自每组的各三只小鼠获得脾细胞，并在存在布雷菲德菌素A的情况中用IOyg HIV C型pM肽(AMQILKDTI (SEQ ID NO 1)；在经pM免疫的小鼠的情况中为aa197_2Q5)或HIVui A9I肽(AMQMLKETI (SEQ ID NO 2)；在用病毒样颗粒 (VLP)免疫的小鼠的情况中为aa 197-205 (Wild等Q004)，Vaccine 22:1732))再刺激各 2xl06个细胞达6小时。对于对照，在存在布雷菲德菌素A的情况中用对照肽(其代表前列腺特异性抗原内的人 CTL 表位(PSA 141-150 FLTPKKLQCV (SEQ ID NO 3) ；Chakraborty 等 (2003) ,Cancer Immunol. Immunother. 52 :497)刺激脾细胞。显示了表达 IFN-γ 的 CD8+细胞的数目的均值数值加标准偏差(SD)。图23显示了在CMV血清阳性HLA Α2阳性个体的肝素化全血中经氰酸盐-氨甲酰化的(A) YIL肽和(B)CMV ρρ65蛋白特异性再活化CD8+T细胞的能力增加，如通过流式细胞术分析所显示的。在这些实验中，将代表CMV IEl蛋白内的HLA Α2限制性CTL表位 (YILEETSVML(SEQ ID NO 4)；氨基酸 315-324 ；Prod，homme 等(2003)，J. Immunol. 170 2030)的合成YIL肽以2 μ g/μ 1的终浓度在100% DMSO中溶解。将CMV(AD169株)蛋白PP65的免疫优势区(aa 862-1048 ；RecMol UL83_pp65，产品目录编号1B023A)在包含 140mM NaCl,2. 7mM KClUOmM Na2HPO4U. 8mM Iffl2PO4 和增加浓度的 KOCN(OmM、100mM、200mM 和500mM)的吐0中溶解，并于40°C温育过夜。然后，在存在0. 04M新鲜制备的尿素的情况中用10 μ g/ml指定的经氰酸钾-氨甲酰化的YIL肽或pp65蛋白刺激HLA A2阳性、CMV血清阳性个体的肝素化全血达6小时。依照制造商的方案，添加抗-⑶49d和抗-⑶观单克隆抗体(BD)以进行共刺激。使用FACS技术通过胞内IFN-Y染色来测定YIL-或pp65_特异性⑶8+T细胞的活化。通过在刺激的最后4小时添加10 μ g/ml布雷菲德菌素A(Sigma)来抑制来自活化的细胞的细胞因子分泌。除非另有记录，使用下列试剂来进行流式细胞术分析缀合有异硫氰酸荧光素(FITC)的抗_CD8(克隆B9. 11)、缀合有藻红蛋白-得克萨斯红 (ECD)的抗_CD3(克隆UCHT1)和缀合有藻红蛋白(PE)的抗-IFN-γ抗体(克隆45. 15)(均为Beckman Coulter的)。在细胞的表面标志物染色、固定和透化后对胞内标志物染色。将经染色的细胞在FACS Epics XL MCL流式细胞仪(Beckman Coulter)上运行。在采集期间实施淋巴细胞和⑶3+事件的活-闸选(live-gating)。每次分析采集多至2X IO6个事件。 结果报告为闸选的响应特异性刺激生成IFN- γ的⑶8+T细胞的百分比。在本发明中使用一般使用的核苷酸和氨基酸缩写。如本文中所使用的，术语“多核苷酸”意为任意长度的核苷酸的聚合形式，优选地脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)。该术语仅意为分子的一级结构。该术语包括双链和单链DNA或RNA，例如诱饵或反义多核苷酸及合成的寡脱氧核苷酸(ODN)和具有核酸酶抗性主链的0DN。如本文中所使用的，术语“多肽”或“蛋白质”意为任意长度的氨基酸的聚合物。优选地，如本文中所使用的术语“多肽”指由超过6个氨基酸残基组成的氨基酸聚合物。术语多肽还包含术语表位、肽、寡肽、蛋白质、多蛋白和多肽的聚集体。此术语中还包括具有翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化和类似的修饰及化学修饰诸如氨甲酰化、硫代氨甲酰化、取代的胍基团和类似的修饰的多肽。此外，此术语包含例如具有一个或多个氨基酸类似物(例如非天然氨基酸)的多肽、具有取代的连接及作为现有技术的其它修饰的多肽，而不管它们是否天然存在或者是否是非天然来源的。如本文中所使用的，术语“氨甲酰化”意指氨甲酰基从含有氨甲酰基的分子(例如，氨甲酰磷酸)转移到接受模块诸如氨基基团、羧基基团、硫氢基基团、磷酸基团、羟基基团或咪唑基团。此外，如本文中所使用的，术语“氨甲酰化”进一步包含多肽的硫代氨甲酰化。如本文中所使用的，术语“氨甲酰基”意指酰基基团，即NH2-C0-。氨甲酰基基团的转移在某些生物化学反应；例如在经由氨甲酰磷酸的尿素循环中发挥重要的作用。如本文中所使用的，术语“氨甲酰基”还包含硫代氨甲酰基(NH2-CS-)。如本文中所使用的，术语“氰酸盐/氰酸根(cyanate)”指源自氰酸(HNCO)和氰酸的任何盐的阴离子NC0—。此外，如本文中所使用的，术语“氰酸盐/氰酸根”指含有单价基团-OCN的任何有机化合物，并且如此指具有结构R-OCN的任何有机化合物，其中R是任何有机模块。特别地，如本文中所使用的，术语“氰酸盐/氰酸根”还指异氰酸盐/根 (isocyanate)禾口异硫氰酸盐 / 根(isothiocyanate)。如本文中所使用的，术语“纯化的”和“分离的”意指分子例如多肽或核酸序列在尽可能没有相当类型的生物学大分子的情况中存在。该术语意指占存在的生物学大分子的总重量的至少65%，优选地至少75%。优选地至少85%，特别优选地至少95%且特别优选地至少98%的期望产物的分数重量。然而，如本文中所使用的，术语“生物学大分子”内不包括水、缓冲液和其它小分子，特别是具有小于1000道尔顿的分子量的分子。如本文中所使用的，术语“表位”指多肽中拥有抗原特性，并且例如充当T细胞或免疫球蛋白的识别位点的区域。在本发明的意义中，表位例如是多肽中由免疫细胞诸如例
12如 CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、CD4+CD8+T 细胞、CDfCDStwmT 细胞、CD56tD8+ 和 CD56XD57+CD8+NKT 细胞或CD4+调节性T细胞识别的那些区域。表位可以包含3个或更多个氨基酸。通常，表位由至少6至7个氨基酸或者更常见地8至12个氨基酸，或者13至18个氨基酸组成。然而，表位还可以由超过18个氨基酸，并且甚至更罕见地超过30个氨基酸组成。如本文中所使用的，术语“表位”还包含表位的独特空间构象。自表位区域中的氨基酸序列获得此空间构象。本文所使用的术语“微生物”指病毒、原核和真核微生物，诸如例如古细菌、细菌、 单细胞和真菌，其中后一组例如包含酵母和丝状真菌。如本文中所使用的，术语“免疫细胞”指具有辅助、细胞溶解或调节特性的淋巴细胞诸如例如⑶4+T细胞、⑶8+T细胞、⑶4+⑶8+T细胞、⑶4+⑶8dimT细胞、⑶4+调节性T细胞、 CD56+CD8+和CD56TD57+CD8+NKT细胞及CD16+CD56+NK细胞。然而，如本文中所使用的，术语 “免疫细胞”不仅指在培养基中体外保持并增殖的免疫细胞，还指从健康血液供体、患者或动物采集的免疫细胞群及分别纯化的免疫细胞。如本文中所使用的，术语“多肽特异性T细胞”指具有特定多肽的特异性结合位点的受体的所有种类的T细胞，如例如CD4+T细胞、CD8+T细胞和CD4+调节性T细胞。如本文中所使用的，术语“多肽特异性T细胞”还包括表位特异性、抗原特异性和免疫原可刺激性细胞。如本文中所使用的，术语“⑶4+T细胞”指协调巨噬细胞和⑶8+T细胞的活化(Th-I 细胞)、B细胞的抗体生成(Th-2细胞)，或者已经认为在自身免疫病中发挥至关重要的作用(Th-17细胞)的T辅助细胞。另外，术语“⑶4+T细胞”还指调节性T细胞，其占⑶4+T细胞总群体的约10%。调节性T细胞在缓和免疫应答中、在预防自身免疫病中及在口服耐受性中发挥至关重要的作用。如本文中所使用的，术语“天然的调节性T细胞”或“调节性T细胞”指Treg、Th3 和Trl细胞。Treg以表面标志物⑶4、⑶25、CTLA4和转录因子R)xp3的表达为特征。Th3 和Trl细胞是⑶4+T细胞，其分别以TGF-β (Th3细胞)或IL-IO (Trl细胞)的表达为特征。如本文中所使用的，术语“⑶8+T细胞”或“CTL”指识别并破坏变性的、赘生性和恶性的细胞及被微生物或寄生物感染的组织和细胞的细胞毒性T细胞。CD8+T细胞又称作 ⑶4XD8+T细胞或Th-I细胞。如本文中所使用的，术语“抗原呈递细胞(APC) ”指能够捕获、加工多肽并与MHC I 类和MHC II类蛋白结合将这些多肽的片段(表位)呈递给免疫系统的细胞。特别地，如本文中所使用的，“抗原呈递细胞(APC) ”指专门的APC诸如树突细胞、单核细胞、巨噬细胞和 B细胞，还指非专门的APC诸如嗜中性粒细胞、成纤维细胞，还有血管上皮细胞和各种上皮、 间充质细胞和脑的小胶质细胞。如本文中所使用的，术语“经放置尿素”指通过数种温育条件预处理的尿素。特别地，尿素的预处理可以包括于约-20°C至约40°C温育尿素，优选地通过约室温持续数小时、数天、数周或数个月和/或于范围为约40°C至约100°C的温度加热尿素达数分钟、数小时或数天来进行。如本文中所使用的，术语“经放置尿素”优选地指与未经放置尿素相比具有增加的氰酸盐浓度的尿素溶液。优选地，如本文中所使用的，术语“经放置尿素”指具有范围为约0. 2至约50mmol/l，更优选地范围为约0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8或约0. 9至约50mmol/l，更优选地范围为约1至约50mmol/l，更优选地范围为约2至约45mmol/l，更优选地范围为约5至约40mmol/l，更优选地范围为约10至约40mmol/l，更优选地范围为约20 至约40mmol/l，更优选地范围为约30至约40mmol/l的氰酸盐浓度的尿素溶液。如本文中所使用的，术语“蛋白质转导域(PTD) ”指蛋白质中能够将所述蛋白质移位入细胞的胞质中的域和链。如此，蛋白质转导域促进胞外蛋白质转移入细胞的胞质中，且特别地进入APC的内源加工途径，即MHC I类路径中。特别地，如本文中所使用的，术语“蛋白质转导域(PTD)”^(i)天然的蛋白质转导域诸如富含精氨酸的PTD，包括HIV Tat (转录的反式激活物)、果蝇 Antp (触角足肽(Antennapedia))和 PTD-5，(ii)疏水性信号序列诸如成纤维细胞生长因子的信号序列，又称为膜转导序列 (MTS)，(iii)合成的蛋白质转导域，诸如赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸同聚物，和(iv)细菌毒素诸如白喉毒素和破伤风毒素的膜移位域。本发明的发明人已经令人惊讶地发现了，可以在存在尿素的条件下以高效率将与氰酸盐一起温育的多肽转移入细胞中。此外，本发明的发明人发现了，与氰酸盐一起温育的多肽在存在尿素的条件下诱导免疫细胞中的MHC I和II类蛋白上的显著表位呈递，并且如此能够有效地引发、再活化并扩增多肽特异性T细胞(例如⑶4+T细胞和⑶8+T细胞)。如此，本发明涉及一种用于将多肽转移入细胞中的方法，包括下列步骤a)在包含氰酸盐离子的溶液中温育多肽，其中所述氰酸盐离子以范围为约0. 2至约9000mmol/l的浓度存在，并b)在存在尿素的条件下将细胞与步骤(a)的所述多肽一起温育。可以使用依照本发明的方法来将多肽渗透入任意的细胞中，所述细胞是原核(例如细菌)和真核细胞，例如真菌诸如酵母和丝状真菌、昆虫细胞、鸟、爬行动物、鱼、两栖动物、哺乳动物细胞，例如鼠或人细胞，特别是抗原呈递细胞(APC)，诸如树突细胞(例如朗格汉斯细胞)、单核细胞、巨噬细胞、B细胞，还有血管上皮细胞和各种上皮、间充质细胞及脑的小胶质细胞。依照本发明的另一种方法是一种用于检测多肽特异性免疫细胞的方法，包括下列步骤a)在包含氰酸盐离子的溶液中温育多肽，其中所述氰酸盐离子以范围为约0. 2至约9000mmol/l的浓度存在，并b)在存在尿素的条件下将含有APC的细胞培养物或体液与步骤(a)的多肽一起温育，c)将依照步骤b)获得的所述含有APC的细胞培养物或体液与免疫细胞或含有免疫细胞的体液一起温育，d)同时和/或特异性检测和/或量化针对来自步骤a)的所述多肽为特异性的多肽特异性免疫细胞的各种亚型。优选地，含有APC的体液是全血和/或液体(liquor)。在依照本发明的检测方法的一个实施方案中，所述含有APC的细胞培养物包括PBMC群(白细胞除去物 (leukapheresate))、分离的单核细胞和/或分离的APC群，优选地包含树突细胞(优选地朗格汉斯细胞)、单核细胞、巨噬细胞和/或B细胞。如本文中所使用的，术语“含有APC的细胞培养物1Π此不仅意指包含在培养基中在体外保持并增殖的APC的细胞，而且还指自先证者(proband)、患者或动物采集并且含有纯化的APC的细胞群。例如，可以从健康血液供体或患者采集血液或另一种含有APC的体液。可以在依照本发明的方法的步骤b)中直接使用体液，或者可以将含有APC的细胞群纯化，然后使用。自血液或其它含有APC的体液纯化含有APC的细胞群是现有技术，并且是本领域技术人员已知的。在存在尿素溶液的情况中将含有APC的细胞培养物或体液与氨甲酰化的多肽一起温育后，将细胞与免疫细胞或含有免疫细胞的体液一起温育。优选地，自含有APC的细胞培养物或体液所来源的相同健康血液供体、患者或动物获得免疫细胞或含有免疫细胞的体液。或者，自具有与含有APC的细胞培养物或体液相容的MHC样式的健康血液供体、患者或动物获得免疫细胞或含有免疫细胞的体液。含有多肽特异性免疫细胞的体液可以是全血和 /或液体。多肽特异性免疫细胞可以是T细胞，优选地⑶4+T细胞、⑶8+T细胞、⑶4+⑶SdimT 细胞和/或CD4+调节性T细胞，和/或它们可以是其它免疫学细胞群，优选地CD56+CD8+、 CD56XD57+CD8+NKT 细胞和 / 或 CD56+NK 细胞。用于获得并纯化限定的APC和免疫细胞群的方法是现有技术。步骤b)中所使用的含有APC的细胞培养物或体液，例如全血、液体或纯化的PBMC 可以已经含有要检测的免疫细胞群。在此情况中，不再必须添加步骤c)中的免疫细胞或含有免疫细胞的体液。步骤c)中的温育在合适的培养条件下，例如于37°C在湿润大气中以5至8% CO2 在T细胞培养基(RPMI 1640，其具有2至10%热失活的(30分钟，56°C)人血清或胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺和100mg/ml卡那霉素或庆大霉素(所有组分来自PanSystems， Aidenbach)中进行约1分钟至约240小时或更长，优选地约2至约6小时或约6至约12小时或约12至约36小时，或约36至72小时，或72至约240小时。然而，还可以使用在培养基组成、温度、空气湿度、温育时间方面具有变化的本领域中已知的其它合适的条件。多肽特异性免疫细胞的限定群体的检测基于如下的发现，即在特异性识别与APC 表面上的MHC II和/或I类蛋白共同呈递的多肽后，免疫细胞显示特征性细胞因子，特别是 IFN-Y 和 / 或 TNF 和 / 或 IL-2、或 IL-4 和 / 或 IL-5、或 IL-17 或 IL-10 和 / 或 TGF-β 的表达增强。由于对限定免疫细胞群特征性的表面蛋白和细胞因子的共同分析，可以自不同免疫细胞群的混合物检测多肽特异性免疫细胞的限定群体的存在和/或浓度。如此，经由表面蛋白和细胞因子的同时检测发生步骤d)中的检测和/或量化。如此，在依照本发明的检测方法的一个实施方案中，依靠检测多肽特异性免疫细胞的特定表面标志物和标志物细胞因子诸如IL-2、TNF、IFNy、IL4或IL5、IL10、TGF-β的生成来实施检测和/或量化。可以通过ELISA、ELISpot或FACS分析来实施检测和/或量化。或者，依靠测量CD107a，b的瞬时表面表达或者依靠T细胞增殖，或者如果例如检测或量化CD8+T细胞，那么依靠经典的铬释放测试或适当的非放射性方法来实施检测和/或量化。此外，可以例如经由对于T辅助细胞的⑶4、对于细胞毒性T细胞的⑶8、对于 CD4+CD8dim和CD4+CD8+T细胞的CD4和CD8、对于NK细胞的CD56、对于iTreg细胞的CD4和 ⑶25和对于多种NKT细胞群的⑶56和CD8或⑶57和CD8实施经由特定表面蛋白的限定细胞群检测。此外，可以通过检测其它表面蛋白(例如，⑶69、⑶45R0、⑶45RA、CCR7)和胞内蛋白(例如，粒酶、穿孔蛋白、FoxP3)、胞内细胞因子(例如IL-2、TNF、IFN-y、IL-4、IL-5、 IL-10、TGF-β)或表面暴露蛋白诸如⑶107a，b来测定细胞群(未处理的(naive)对活化的细胞对记忆细胞)的特定状态和可活化性的程度。如此，依照本发明的方法，特定细胞群的特异性检测是有可能的。限定细胞群的所列出的特征性表面标志物及使用例如FACS技术来检测并表征不同免疫细胞群是本领域中已知的。免疫细胞的特异性活化在其与依照步骤b)获得的含有APC的细胞培养物或体液一起温育后检测，其通过测量活化的免疫细胞的任何增加的细胞因子生成来进行。例如，CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、CD4+CD8dim 和 CD4+CD8+T 细胞、CD56+NK 细胞、和 CD56+CD8+ 或 ⑶57+CD8+NKT细胞在特异性刺激后生成增加的IFN- Y，而T辅助2型(Th_2)的⑶4+T辅助细胞显示细胞因子IL-4和IL-5的生成增加。调节性T细胞(Treg、Th3、Trl细胞)显示 IL-10和/或TGF-β的表达增加。可以仅通过本领域中已知的方法在胞内或者在一些情况中使用商品化方法，例如FACS(例如通过胞内细胞因子染色，或者细胞因子分泌测定法)、 ELISA或ELIspot技术于分泌后在上清液中测定所生成的细胞因子。检测依靠免疫细胞的特异性活化后生成的其它细胞因子或所生成的其它标志物也是有可能的。例如可以使用流式细胞术(FACS 荧光激活细胞扫描)来测定并表征活化的免疫细胞。此方法容许使用流式细胞仪测量混合细胞群中的个别细胞的荧光强度。然后，使用 FACS 系统例如 FACS Epics XL MCL 流式细胞仪和 Expo 32 软件(Becton Coulter)或 FACS Canto II流式细胞仪和Diva 6. 1. 1.软件(Beckton Dickinson)来进行对细胞的流式细胞术分析。例如与R-藻红蛋白(R-PE)、多甲藻素(peridin)-叶绿素c (PerCP)、荧光素 (FITC)、德克萨斯红(TX)、别藻蓝蛋白(APC)、Amcyane、太平洋蓝(Pacific Blue)、串联 PE-TX、串联PE_Cy5、PE_Cy7或串联APC_Cy7、多种多样的Alexa荧光团、一抗或二抗偶联的荧光适合于使用FACS技术检测先前所描述的特征性表面蛋白和细胞因子，并且是商品化的(例如来自 Becton Dickinson, Dako, Coulter, eBioscience, Biolegend)。在 FACS 法夕卜，适合于测定来自免疫细胞的生成的其它方法，例如ELISA法、Elispot法、生物传感器和表达序型分析也适合于检测多肽特异性免疫细胞。这些是本领域中已知的。依照本发明的另一种方法是一种用于引发、扩增和/或再活化多肽特异性T细胞的方法，包括下列步骤a)在包含氰酸根离子的溶液中温育多肽，其中所述氰酸根离子以范围为约0. 2至约9000mmol/l的浓度存在，并b)在存在尿素的条件下及在没有或存在免疫调节性物质的情况中将细胞与步骤 a)的所述多肽一起温育。在所述方法中，多肽特异性T细胞优选地是⑶4+T细胞和/或⑶8+T细胞。可以在体内、体外和/或离体(ex vivo)实施用于引发、扩增和/或再活化多肽特异性T细胞的方法。步骤b)中温育的细胞可以是APC和/或T细胞，其自包含所述APC和/或T细胞的血液、外周血单核细胞(PBMC)或其它体液纯化。或者，在步骤b)中直接使用包含APC和 /或T细胞的血液、PBMC或其它体液。包含APC和/或T细胞的血液、PBMC或其它体液可
16以是先前自人或动物患者获得的样品。在依照本发明的用于引发、扩增和/或再活化多肽特异性T细胞的方法的一个实施方案中，将步骤b)的温育实施数次，优选地2，3，4，5，6，7，8，9，10或甚至更多次。对于用于扩增多肽特异性T细胞的方法，重复步骤b)是特别优选的。依照本发明的所有方法基于发明性教导，S卩如果将用氰酸盐预处理的多肽在存在尿素的条件下与细胞一起温育，则显著改善多肽向所述细胞中的转移。如此，以下教导指依照如上文所描述的本发明的所有方法。多肽可以合成生成或者依靠通常的原核或真核表达系统在多种细胞中表达。适合的表达系统的例子是细菌诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(E.coli)、 酪链球菌(Streptococcus cremoris)或淡青紫链球菌(Streptococcus lividans)、酵母细胞诸如白念珠菌(Candida albicans)、麦芽糖念珠菌(Candida maltosa)、多形汉逊
(Hansenula polymorphs)、月危 11 会(Kluyveromyces fragilis) > (Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、或角军月旨耳口氏酵母(Yarrowia lipolytica)、昆虫细胞诸如埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿银纹夜蛾 (Autographa californica)、家香(Bombvx mori)、黑腹果妮(Drosophila melanogaster)、 草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、或植物细胞。可以通过常规的分子生物学方法，例如通过细胞破坏、核酸消化、用于浓缩蛋白质的方法、亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤、或者与多肽变性方法，例如酸沉淀、尿素处理、碱处理、热处理、用十二烷基硫酸钠(SDQ处理或超声处理组合来纯化多肽。此外，这些用于纯化多肽的方法可以以任意的方式组合。多肽可以是合成的，S卩非天然存在的多肽或者它们可以存在于任意的生物中，例如在哺乳动物诸如人、灵长类、小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、牛、猪中或者在任何动物、寄生物、微生物或病毒中。然而，它们也可以源自植物和藻类。另外，它们可以源自朊病毒蛋白质。依照本发明的方法的步骤a)中所使用的多肽可以就其进入细胞，特别是APC的胞质溶胶的固有特性分成两组。第一组多肽具有进入细胞，特别是APC的胞质溶胶的固有特性。因此，此类蛋白质在没有任何进一步帮助的情况中经由MHC I类路径加工并呈递。所述固有特性可以由所述蛋白质的转导域(PTD)引起。所述转导域可以是天然存在的转导域(PTD)或重组添加的转导域。具有天然存在的转导域的蛋白质的例子是HIV转录反式激活物(Tat)和Rev蛋白、 单纯疱疹病毒VP22和果蝇触角足同源蛋白(antp) (Sugita等Q008)Br J Pharmacol. 153 1143-1152)。然而，所述固有特性也可以由多肽的特定链诸如破伤风毒素的重链的固有功能引起。具有进入细胞胞质溶胶的固有功能的多肽的其它例子是毒素诸如白喉毒素。在这里，移位是由移位或“T域”介导的。另外，已经证明了成纤维细胞生长因子的疏水性信号序列(又称为膜转导序列(MTS))是另一种类型的细胞渗透肽(CPP)。另外，多肽与微珠、抗体、脂质、热休克蛋白和富含精氨酸的蛋白质转导域(PTD)的偶联赋予向APC的HLA I类加工机构的投递。
第二组多肽没有进入细胞，特别是APC的胞质溶胶的固有特性。此类蛋白质在没有任何帮助的情况中不进入APC的胞质溶胶，而是保留于所述APC的内体/内溶酶体区室中。因此，所述蛋白质通常不经由MHC I类路径加工并呈递，而是仅经由MHC II类路径加工并呈递。第二组包括大多数天然存在的和重组生成的人、微生物、病毒、动物或植物蛋白质且特别是各自的可溶性多肽和细胞裂解物、组织、细菌、病毒和寄生物的多肽。在本发明的方法的一个实施方案中，用如上文所描述的第一组多肽，并且如此用具有进入细胞，特别是APC的胞质溶胶的固有特性的多肽实施本发明的方法。由此，本发明的方法进一步促进将多肽转移入细胞，特别是APC的胞质溶胶中。如此，可以通过依照本发明的方法对所述多肽提高多肽转移的效率。在本发明的方法的另一个实施方案中，用如上文所描述的第二组多肽，并且如此用天然地没有进入细胞，特别是APC的胞质溶胶的固有特性的多肽实施本发明的方法。对于此类多肽，本发明提供了一种用于将多肽非常有效地转移入细胞，特别是APC的胞质溶胶中的方法。第二组优选的多肽是所有种类的如下多肽，其具有T细胞表位，但是缺乏⑴天然的蛋白质转导域和/或(ii)引起多肽移位入细胞，特别是APC中的与所述多肽重组连接的任何载体或域。第二组多肽的例子是微生物蛋白质，特别是下列的蛋白质(i)人免疫缺陷病毒(HIV)诸如gpl20、gpl60、p24、gag、聚合酶、逆转录酶和nef，(ii)埃巴病毒(EBV)诸如 ^ΝΑΙ、^ΝΑ2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C、EBNA4, EBNA6、 BZLFl、BMLFl、BMRFl、BHRFl、BARFO, BRLFl、Bi，LF4、gp85、gpllO、gp220/350、VCA pl50、 EBNA-LB, LMP-I 和 LMP-2 (例如记载于 Khanna 等(2000)，Annu. Rev, Microbiol. 54 :19-48 的)，(iii)巨细胞病毒(CMV)诸如 UL123 (IEl)、UL122(IE-2)、UL83(pp65)、UL82、HL99、 UL28、UL33、UL37、US3、UL94、UL16、UL55 (gB)、UL85、UL25、US18、UL45 和 UL32 (ppl50)(例如记载于 Crough 等(2009)Clin Microbiol Rev. 22 :76-98 的)，(iv)水痘带状疱疹病毒(VZV)诸如 ORFl、0RF4、0RF10, 0RF14、0RF29, 0RF62 禾口 0RF68(gE)，(ν)结核分枝杆菌(Μ. tuberculosis)诸如 CFP10、ESAT6、ΤΒ7· 7、ΤΒ37· 6、ΜΡΤ63(vi)布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorfer)诸如 OSP A 和 OSP C(vii)乙肝病毒诸如 HBsAg 和 HBcAgjP(viii)腺病毒诸如AdV5六邻体(Hexon)另外，人蛋白质是所述第二组的优选多肽，例如肿瘤抗原诸如前列腺特异性抗原 (PSA)、HER-2/neu、MUC-1、点突变或野生型过表达的p53、MAGE抗原和CEA (癌胚抗原)。 代表自身免疫病中的自身攻击性T细胞的相关靶物的蛋白质也是所述第二组优选的多肽。 关于自身免疫病多发性硬化的此类蛋白质的例子是髓磷脂碱性蛋白(MBP)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓磷脂、MBP/PLP融合蛋白(MP4)、髓磷脂相关糖蛋白(MAG)。关于自身免疫病I型糖尿病的此类蛋白质的例子是胰岛素B、前胰岛素原(pre-pro-insulin ；PPI)、IA-2、GAD65、IGRP、cd4、嗜铬粒蛋白 A(ChgA)(如例如记载于 Velthuis等O010)DiabeteS的)。还优选的是上文所提及的蛋白质的片段用于依照本发明的方法的用途。为了确定多肽是否是如上文所描述的第一或第二组的多肽，可以例如依赖荧光显微术来测试进入真核细胞，特别是APC的胞质溶胶的能力，其中细胞区室和多肽可以是荧光缀合的。各自的方法是本领域技术人员已知的，并且例如记载于Kaplan等(Journal of Controlled Release 102(2005)247-253)及 TO 99/55899 中。可以以任何任意的浓度使用依照本发明的方法中的步骤a)的多肽。优选地，浓度位于约0. 01至约200μ g/ml或更高的范围、约0. 01至约0. 1 μ g/ml的范围、约0. 1至约0. 5 μ g/ml的范围、约0. 5至约2 μ g/ml的范围、约2至约10 μ g/ml的范围、约10至约 50 μ g/ml的范围或约50至约200 μ g/ml的范围。最优选的是约0. 1至约50 μ g/ml的多肽浓度，更优选地范围为约1至约40 μ g/ml、约3至约30 μ g/ml、或约5至约20 μ g/ml。特别优选的是约10 μ g/ml的多肽浓度。依照本发明的方法中的步骤a)中用氰酸盐预处理多肽导致多肽的氨基基团的氨甲酰化。氨甲酰化是氨甲酰基从含有氨甲酰基的分子(例如，氨甲酰磷酸)转移到接受模块诸如氨基基团、羧基基团、硫氢基基团、磷酸基团、羟基基团或咪唑基团。氨甲酰基是具有结构NH2-CO-的酰基基团。然而，氨甲酰化也可以通过具有结构NH2-CS-的硫代氨甲酰基基团发生。依照本发明的多肽的氨甲酰化可以是氨基基团、羧基基团、硫氢基基团、磷酸基团、羟基基团或咪唑基团的氨甲酰化。优选地，依照本发明的多肽的氨甲酰化是多肽的伯氨基团，特别是赖氨酸残基的ε-氨基基团和末端氨基基团的氨甲酰化。或者/另外，酪氨酸的羟基基团、半胱氨酸的硫氢基基团、天冬氨酸和谷氨酸的羧基基团和组氨酸的咪唑基团可以是氨甲酰化的。可以通过在包含氰酸盐的溶液中温育多肽来实施氨甲酰化反应。在本发明的一个实施方案中，氰酸盐浓度范围为约0. 3至约5000mmol/l，更优选地范围为约0. 4,0. 5、
0.6,0. 7,0. 8或约0. 9至约5000mmol/l,范围为约1、2或约5至约5000mmol/l，范围为约 2至约5000mmol/l，范围为约10至约4000mmol/l，范围为约25至约3000mmol/l，范围为约 100mmol/l至约2000mmol/l或范围为约500mmol/l至约1000mmol/l。最优选的是范围为约lmmol/1至约1000mmol/l，更优选地范围为约5mmol/l至约900mmol/l，约10mmol/l至约 800mmol/l，约20mmol/l至约700mmol/l或约50mmol/l至约600mmol/l的氰酸盐浓度。特别地，约100mmol/l至约500mmol/l的氰酸盐浓度是优选的，诸如约100mmol/l、约150mmol/
1、约200mmol/l、约 250mmol/l、约 300mmol/l、约;350mmol/l、约 400mmol/l、约 450mmol/l 或约500mmol/l的氰酸盐浓度。依照本发明的方法的步骤a)的温育时间可以是约数分钟多至数小时、数天、数周或数月。温育可以在范围为约-20°C至约100°C，优选地范围为约室温至约96°C或范围为约 40°C至约96°C的温度发生。在低温温育需要较长的温育时间，而高温温育需要较短的温育时间，特别地因为若将多肽于高温温育长时间的话，它们会降解。优选的是范围为约室温至约60°C，范围为约30°C至50°C或范围为约37°C至45°C的温育温度。特别优选的是约40°C 的温育温度。由此，约5分钟至约M小时或约30分钟至约2小时的温育时间是优选的。特别优选的是约1小时的温育时间。在本发明的一个实施方案中，在包含氰酸盐的尿素溶液中温育多肽以进行氨甲酰
19化。优选地，所述尿素溶液的尿素浓度范围为约0. Olmol/升至约Smol/升、约0. 1至约
0.5mol/升、约0. 5至约5mol/升或约5至约8mol/升。新鲜制备的尿素溶液的氰酸盐浓度小于0. 2mmol/L·然而，根据依照本发明的方法的步骤a)，多肽必须在具有至少0. 2mmol/l的氰酸盐浓度的溶液中温育。优选的是具有范围为约0. 2至约50mmol/l、更优选地范围为约0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8或约0. 9至约 50mmol/l、约 1 至约 50mmol/l、约 2 至约 45mmol/l、约 5 至约 40mmol/l、约 10 至约 40mmol/
1、约20至约40mmol/l或约30至约40mmol/l的氰酸盐浓度的包含尿素的溶液。为了提高尿素溶液的氰酸盐浓度，存在着数种可能性。在本发明的一个实施方案中，通过在特定温育条件下温育所述尿素溶液来提高尿素溶液的氰酸盐浓度。用氰酸铵平衡溶液中的尿素。与多肽的氨基基团起反应的形式是异氰酸。异氰酸与多肽的氨基端和赖氨酸和精氨酸残基的侧链起反应。如此，可以通过提高所述尿素溶液的氰酸盐浓度，并且如此通过操作尿素和氰酸铵的平衡反应来增强尿素溶液中的多肽氨甲酰化。可以通过加热和/或通过温育时间来影响所述平衡反应。Marier 及同事(Marier 等(1964) Analytical Biochemistry 7 :304)已经详细分析了尿素水溶液中的氰酸盐积累。他们描述了于25°C在约60天中达到最大氰酸盐水平。 在给定的尿素浓度，于25°C的最大氰酸盐水平是于38°C (7天)获得的最大氰酸盐水平的约60%，并且是于85°C (50分钟)获得的最大氰酸盐水平的约23%。为了提高尿素溶液的氰酸盐浓度，可以将尿素溶液温育约数分钟多至数小时、数天、数周或数月。温育可以于范围为约-20°C至约100°C、约室温至约98°C、约37°C至约 96 V、约40 V至约96 V、或约70、80或约90至约96 V的温度发生。为了提高氰酸盐浓度，显而易见的是，低温温育需要长温育时间，其中高温温育需要较短的温育时间。例如，于-20°C 的温育可能需要约数周多至数月的温育时间，其中于96°C的温育可能需要约数分钟，多至约1小时或数小时的温育时间。如果在依照本发明的方法中的步骤a)的温育中使用如上文所描述的经预处理的尿素溶液，那么优选地于范围为约室温至约100°c、约30°C至约70°C、或约37°C至约40°C的温度发生步骤a)的温育。由此，约5分钟至约48小时的温育时间是优选的。然而，更优选的是约30分钟至约M小时的温育时间。在本发明的另一个实施方案中，在依照本发明的方法的温育步骤a)过程中提高尿素溶液的氰酸盐浓度。因此，可以将多肽在尿素溶液中温育约数分钟多至数小时、数天、 数周或数月。温育可以于范围为约-20°C至约100°C、约室温至约96°C或约40°C至约96°C 的温度发生。为了提高氰酸盐浓度，显而易见的是，低温温育需要长温育时间，其中高温温育需要较短的温育时间。然而，还必须考虑多肽于较高温度的降解。优选的是例如约20分钟至约4小时，或约30分钟至约2小时的温育时间。特别优选的是于约96°C的温度的约1 小时的温育时间。还优选的是于约60至约90°C，特别优选地约70至约80°C的温度的约1 小时至3小时，优选地2小时的温育时间。可以通过测量氰酸盐浓度来鉴定适合于提高单独的尿素溶液或包含多肽的尿素溶液的氰酸盐浓度的温育条件。用于测量溶液的氰酸盐浓度的方法是本领域中本领域技术人员已知的(参见例如 Marier 等(1964) Analytical Biochemistry 7:304)。依照本发明的方法中的步骤a)的pH值优选地是约3. 0至约9. 0，更优选地约3. 9、6.8或8.7。特别地，可以通过提高pH值来提高磷酸基团的氨甲酰化。然而，赖氨酸基团的氨甲酰化优选地在酸性PH值发生。在本发明的又一个实施方案中，通过由Angel及同事(Angel等Q007)Rapid Commun. Mass Spectrom. 21 1623)所描述的用于多肽定量氨甲酰化的策略来实现多肽的氨甲酰化。相应地，将多肽在100μ 1 8Μ尿素、200mM Tris_HCl，pH 7. 4中溶解。将此溶液用 20mM二硫苏糖醇(DTT)于50°C还原2小时，接着用45mM碘乙酰胺(IDA)于室温进行氨甲酰甲基化达1小时。将变性、还原、并烷基化的多肽的溶液用50mM碳酸氢铵以1 8稀释以调节尿素浓度至1M，并于37°C温育过夜。消化后，将溶液干燥，并在300 μ 1 8Μ尿素、200mM Tris-HCl,pH 8. 5中溶解。然后，将样品涡旋振荡，直至完全溶解，然后于80°C温育4小时， 期间周期性涡旋振荡样品。在本发明的一个实施方案中，将氰酸盐添加至依照本发明的方法的步骤a)的尿素溶液。由此，范围为约lmmol/1至约lOOOmmol/1的氰酸盐终浓度是优选的。更优选的是范围为约 5mmol/l 至约 900mmol/l、约 10mmol/l 至约 800mmol/l、约 20mmol/l 至约 700mmol/ 1或约50mmol/l至约600mmol/l的氰酸盐浓度。特别地,约100mmol/l至约500mmol/l的氰酸盐浓度是优选的，诸如约100mmol/l、约150mmol/l、约200mmol/l、约250mmol/l、约 300mmol/l、约 350mmol/l、约 400mmol/l、约 450mmol/l 或约 500mmol/l 的氰酸盐浓度。在本发明的一个实施方案中，通过将多肽与碱性介质中的碱金属氰酸盐、有机异氰酸盐或有机异硫氰酸盐一起温育来实现步骤a)的多肽的氨甲酰化。温育时间可以是数分钟至约36小时，优选地约30分钟至约M小时，优选地约1小时至约12小时。温育温度优选地是至少约20 V、约30 V、约40 V或约50 V。pH值优选地是约7至11，更优选地约8 至约10。优选的是使用氰酸钾、氰酸钠、氰酸银或β-雌二醇6肟(一种BSA异氰酸荧光素缀合物)。然后，使用氨甲酰化的多肽来温育依照本发明的方法的步骤b)中的细胞。约IO6 个细胞所使用的多肽量应当在约0. 1至约200 μ g或更高、约0. 1至约200 μ g、约0. 1至约 2μ g、约0. 1至约10μ g、约10至约50 μ g或约50至约200 μ g多肽的范围中。在依照本发明的方法的一个实施方案中，步骤b)中的尿素浓度范围为约0.001至约0. 8mol/L，优选地范围为约0. 001至约0. 2mol/L，约0. 001至约0. lmol/L，约0. 001至约 0. 01mol/L,约 0. 01 至约 0. 2mol/L,约 0. 01 至约 0. lmol/L 或约 0. 1 至约 0. 8mol/L。然而， 尿素浓度也可以小于0. OOlmol/L。若存在着总数高的活细胞和活细胞占优势的活细胞与死细胞比率，则步骤b)中的尿素浓度应当小于约0. 8mol/L，优选地小于约0. 3mol/L。最优选的是范围为约 0. 01mol/L至约 0. lmol/L、约 0. 015mol/L 至约 0. 09mol/L、约 0. 02mol/L 至约 0. 08mol/L、约 0. 025mol/L 至约 0. 07mol/L、约 0. 03mol/L 至约 0. 06mol/L 或约 0. 035mol/ L至约0. 05mol/L的步骤b)中的尿素浓度。特别优选的是约0. 04mol/L的步骤b)中的尿素浓度。此外，依照本发明的方法的步骤b)的尿素溶液可以另外包含NaCl，优选地其具有范围为约0. 25mmol/L至约200mmol/L、或约0. 25mmol/L至约75mmol/L的浓度。或者/另夕卜，依照本发明的方法的步骤b)的尿素溶液可以包含DTE或DTT，优选地其具有范围为约 0. 25nmol/L 至约 200nmol/L，或约 0. 25nmol/L 至约 75nmol/L 的浓度。此外，DTE 或 DTT 浓度可以小于0. 25nmol/L或大于200nmol/L。
将氨甲酰化的多肽与本发明的步骤b)中的细胞一起温育，优选地持续约1分钟至约MO小时或更长，优选地约2至约6小时或约6至约12小时或12至约36小时，或约36 至约240小时。在依照本发明的方法的另一个实施方案中，在包含LPS的培养基中实施步骤b)的温育。步骤b)中的LPS活性优选地范围为约0. 001至约10000U/mL、约0. 01至约8000U/ mL、约 0. 2 至约 6000U/mL、约 1 至 1000U/mL、或约 10 至 100U/mL。步骤a)中的多肽的温育导致多肽的分子量增加和/或多肽的PKi值向更酸性的 PKi值转变。为了确定步骤a)的经处理的多肽是否是氨甲酰化的，并且与非氨甲酰化的多肽相比是否展现出增加的分子量，可以使用本领域技术人员已知的标准方法。例如，可以通过在SDS-PAGE上的分离、MALDI-T0F MS (基质辅助激光解吸/离子化-飞行时间质谱学)分析或NMR光谱学(核磁共振光谱学)来分析分子量的比较。MALDI-T0F MS是一种通过毫微秒激光脉冲照射UV-光吸收基质和生物分子共沉淀物的技术。基质吸收大部分的激光能量，这阻止对生物分子不想要的片段化。离子化的生物分子在电场中加速，并进入飞行管。在此管中飞行期间，不同分子依照其质荷比分离， 并且在不同时间到达检测仪。这样，每个分子产生独特的信号。使用该方法来检测并表征具有400-350，OOODa的分子量的生物分子，诸如蛋白质、肽、寡糖和寡核苷酸。例如，可以通过二维电泳来分析PKi值的比较。依照本发明的用于检测多肽特异性T细胞的方法适合于许多不同科学和医学应用，例如在分析、诊断和治疗中。使用依照本发明的方法，可以同时鉴定多肽特异性免疫细胞的不同群体，例如以监测治疗性和预防性疫苗接种诱导免疫细胞的效率、用于测定治疗性处理牵涉免疫细胞的疾病的效率、用于筛选引起免疫细胞无变应性删除或引起全身免疫抑制(general immune suppression)的药物的安全性和效率、用于监测和诊断牵涉免疫细胞的由微生物和寄生物诱导的疾病、用于监测和诊断牵涉免疫细胞的慢性炎症、用于监测和诊断肿瘤抗原特异性免疫细胞、用于监测和诊断在移植排斥中发挥作用的免疫细胞、用于诊断自身免疫病或者用于特异性选择血液供体以进行疫苗试验及测试治疗性处理。优选地，在体外或离体实施依照本发明的用于检测的方法。可以在具有免疫细胞，特别是T细胞的所有脊椎动物中，特别在人、灵长类和啮齿类中使用依照本发明的方法。可以例如自患有微生物感染、肿瘤疾病、慢性炎性疾病、移植排斥或自身免疫病的患者或者不然自治疗或预防性试验的健康血液供体或参与者检测并量化多肽特异性免疫细胞。另外，可以使用通过依照本发明的方法获得的细胞，优选地使用在拥有表位特异性免疫细胞的灵长类或其它动物中获得的APC来检测表位特异性T细胞。可以使用依照本发明的用于检测多肽特异性免疫细胞的方法来诊断微生物感染、 自身免疫病、移植排斥和肿瘤。与至今所描述的用于检测多肽特异性免疫细胞的方法形成对比，依照本发明的方法的特征在于下列优点(1)可以同时检测多肽特异性免疫细胞的不同群体。(2)可以以小样品体积实施多肽特异性免疫细胞的不同群体的检测。(3)可以同时检测多肽特异性免疫细胞的不同群体的数量和质量。
2
(4)可以使用许多诊断实验室中常规使用的商品化设备(FACS、ELISA-, ELISpot 阅读器)来容易地实施该方法。(5)可以通用地使用所述方法来检测反应性多肽特异性免疫细胞，而不管血液供体 / 患者的 HLA 丛(constellation)。(6)依照本发明的诊断方法适合于患者特异性地测定针对复杂多肽的淋巴细胞反应性。在此情况中，不必要知道这些免疫细胞的目标结构以实施所述方法。(7)与基于用肽、可溶性蛋白质、细胞裂解物、表达质粒或RNA刺激T细胞的常规诊断方法相比，用于多肽特异性免疫细胞的此检测方法可以普适地使用，更容易操作，显著更便宜，不太费时且更灵敏。可以对诊断性、治疗性和预防性应用使用依照本发明的用于改善的引发、扩增和/ 或再活化多肽特异性T细胞的方法。特别地，多肽特异性T细胞的再活化是为了诊断目的检测和/或量化多肽特异性T细胞的最重要的步骤。相反，可以使用多肽特异性T细胞的扩增来制备供治疗性应用或供研究目的用的细胞。特别地，可以使用依照本发明的方法的步骤a)中所获得的多肽来在体内引发并再活化多肽特异性T细胞，以例如治疗或预防疾病。优选地，可以使用依照本发明的方法的步骤a)的多肽作为预防性或治疗性疫苗。因此，优选地，将依照本发明的方法的步骤a)中所获得的多肽针对含有尿素的缓冲液透析，所述尿素优选地范围为约0. 001至约0. 2mol/ L，更优选地范围为约0. 01至约0. lmol/L。此外，缓冲液优选地包含PBS。更优选地，所述缓冲液不包含二价离子。如此，本发明进一步涉及一种药物组合物，其包含步骤a)中所获得的且优选地如上文所描述的那样在含有尿素的缓冲液中透析的多肽，所述尿素优选地范围为约0.001至约0. 2mol/L,更优选地范围为约0. 01至约0. lmol/L。此外，缓冲液优选地包含PBS。更优选地，所述缓冲液不包含二价离子。此外，优选地，所述药物组合物包含佐剂或免疫刺激性物质。优选地，所述药物组合物适合于对受试者施用，优选地通过注射进行。优选地，可以使用药物组合物作为疫苗或用于治疗或预防传染病和/或肿瘤。此外，本发明涉及依照依照本发明的方法获得的细胞对于不同应用的用途。可以在动物和人的疾病的研究、诊断学和治疗及预防领域中使用用依照本发明的方法处理的细胞。例如，使用依照本发明的方法获得的APC适合于用于对抗传染病和肿瘤的预防性和治疗性应用。本发明的又一方面涉及依照本发明的方法在多种不同科学、医学和诊断应用中的用途，例如用于(a)研究这些多肽在细胞过程中的重要性，(b)在实验性动物和人中诱导体液和细胞免疫应答，(c)为诊断性、治疗性和预防性应用获得血清和抗体，(d)诱导合适的免疫应答以针对微生物感染和肿瘤疾病提供保护或治疗微生物感染和肿瘤疾病，(e)预防性和治疗性疫苗或(f)为了诊断性、治疗性和预防性目的而离体刺激T细胞，(g)鉴定细胞毒性T细胞的新的靶结构(表位)。
23
如此，本发明涉及氨甲酰化的多肽用于在动物中，特别在哺乳动物中，例如在小鼠、大鼠、兔、绵羊、山羊、马、牛、猪、犬、猫和灵长类中诱导特异性T细胞的用途。还可以使用所述氨甲酰化的多肽来在人中诱导细胞免疫应答。在此情况中，可以单独或与免疫刺激剂(“佐剂”)或免疫调节性物质(例如，脂多糖(LPQ)组合和/或与尿素组合施用所述氨甲酰化的多肽。特别适合于增强所描述的疫苗/疫苗组合的效率的佐剂和免疫调节性刺激剂包括例如(1)凝胶样佐剂诸如铝盐(Alum)，诸如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝和磷酸钙；(2)微生物佐剂诸如细菌核酸和合成的寡脱氧核苷酸(ODN)，其包含CpG基序(例如CpG 1668或 CpG 2216 ； (Waibler 等(2008)，Europ. J. Immunol. 38 :3127)、内毒素诸如例如单磷酰基脂质A、外毒素诸如例如白喉、霍乱、破伤风类毒素、大肠杆菌的热不稳定性肠毒素和胞壁酰二肽诸如例如MDP ； (3)油乳剂和基于乳剂的疫苗诸如例如不完全弗氏佐剂(IFA)、MF59、SAF 和 Ribi 佐剂体系(RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton,Mont.) ； (4)特定的佐剂诸如例如免疫刺激性复合物(ISCOM)、脂质体、PLG聚合物、生物可降解性微球体和皂苷01S-21)、和合成的佐剂诸如非离子型嵌段聚合物、胞壁酰肽类似物、聚磷腈(polyphosphazene)和合成的多核苷酸和(5)细胞因子，诸如例如白介素(IL-1、IL-2、IL-12等)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，及肿瘤坏死因子(TNF)。在佐剂夕卜，可以使用具有免疫刺激效果以增强所描述的疫苗组合物的效率的所有其它物质。已经汇编了合适的可用佐剂的列表，并且可以经由万维网在以下地址(http://www.bvl.bimd. de/nn_510850/EN/04_PlantProtection Products/03—PlantResistanceImproversAndAd juvants/04—ListAdjuvants/ListA djuvants—node, html—nnn = true)找至丨J。将所描述的疫苗组合(例如，与药学可接受载体组分和/或佐剂结合的氨甲酰化的多肽)添加至稀释溶液，诸如例如水、盐溶液、甘油、乙醇。另外，其它附属组分诸如湿润和乳化剂、PH缓冲物质和相似的组分可以存在于这些组合物中。疫苗组合可以在初次-加强方案中与其它疫苗，例如肽、重组蛋白、DNA表达载体、 重组病毒和细菌和活的减毒病原体组合。这些疫苗组合通常以可注射形式，作为液体溶液或悬浮液存在。可以将免疫原组合物同等地乳化或掺入脂质体中，以在药学可接受载体组分意义上实现增强的佐剂特性。可以通过合适的施用路径来施用疫苗组合物。此情况中可能的是口服、表面/局部(topical)、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、皮下、鼻内、皮内或皮肤施用路径，等等。以适合于适应症的剂量使用疫苗组合物。确定适合于各种生物体的剂量是现有技术。可以预防性或治疗性使用所描述的疫苗组合。此外，使用氨甲酰化的多肽修饰的 APC适合于治疗性和预防性应用。已经多次公开了用于获得和离体扩增APC，及在生物体中再输注经离体修饰的APC的方法，并且所述方法是现有技术。本发明使用以下实施例来解释，并且不限于这些实施例1 通过于高温用尿素处理来使多肽氨甲酰化。将纯化的HIV 壳体蛋白 p24(0. 84mg/ml ；溶解于 150mM NaCl, 50mM NaP, pH 7. 6 中)、商品化牛血清清蛋白(BSA ；清蛋白级分V，AppliChem)；(在H2O中的lmg/mL)或细小病毒 B19 VP2 颗粒(Lindner 等(2008), Journal of Infectious Diseases, 198 :1677)；(溶解于38% (w/v)CsCl中的0. 64mg/ml)与或者是H2O和30mM Tris pH 3. 9或者是6M新鲜制备的尿素溶液和30mM Tris pH 3. 9以1 1 1 (vol/vol/vol)混合，然后于96°C在热摇床(300rpm)上温育60分钟。然后，将蛋白质通过12. 5% (HIV p24)或10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) (BSA，细小病毒B19 VP2)分离，并依靠考马斯亮蓝染色来显现蛋白质。实施通过SDS PAGE的蛋白质分离和蛋白质染色，如实验室手册“Molecular cloning =A laboratory manual,第三版(Sambrook 等(2001), Cold Spring Harbor Laboratory, New York)中所记载的。这些实验显示了于高温与尿素一起温育导致对多肽的化学修饰，如通过SDA聚丙烯酰胺凝胶中改变的迁移行为所显示的。在本文中，不同多肽例如HIV p24、BSA和细小病毒B19 VP2在观察到的质量迁移上展现了显著差异，这取决于氨甲酰化侧的数目和氨甲酰化的效率。種· 2 怀醜嚇輔化将商品化BSA(在 H2O 中的 lmg/mL)与 H20/HC1 (pH 3. 6)和 3OmM Tris pH 3. 6 或者与6M尿素溶液和30mM Tris pH 3. 6以1 1 1 (vol/vol/vol)混合，并将样品于96°C在热摇床(300rpm)上温育0分钟、30分钟或60分钟。或者，遵循由Angel及同事(Angel等 (2007) Rapid Commun. Mass Spectrom. 21 1623)描述的蛋白质氨甲酰化方案来处理BSA。 将 IOnmol BSA 在 100 μ 1 8Μ 尿素 /200mM Tris-HCl, pH 7. 4 中溶解。用 20mM 二硫苏糖醇 (DTT)于50°C将此溶液还原2小时，接着用45mM碘乙酰胺(IDA)于室温进行氨甲酰甲基化达1小时。将变性、还原、并烷基化的蛋白质的溶液用50mM碳酸氢铵以1 8稀释以调节尿素浓度至1M，并于37°C温育过夜。然后，将所述溶液干燥，并在300 μ 1 8Μ尿素/200mM Tris-HCl,pH 8. 5中溶解。然后，将样品涡旋振荡，直至完全溶解，然后于80°C温育4小时， 期间周期性涡旋振荡该样品(Angel 等 Q007) Rapid Commun. Mass Spectrom. 21 :1623)。然后，将氨甲酰化的蛋白质通过10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)来分离，并依靠考马斯亮蓝染色来显现。此研究显示了遵循不同氨甲酰化方案将BSA与尿素一起温育导致蛋白质氨甲酰化的不同效率。在本文中，于96°C将BSA与尿素一起温育60分钟比用尿素处理30分钟诱导更有效的BSA氨甲酰化，如通过SDS聚丙烯酰胺凝胶中的迁移减少所显示的。与于高温用经放置尿素处理相比，Angel及同事的氨甲酰化方案诱导了更有效的BSA氨甲酰化。然而，Angel及同事的方案导致对BSA的降解增加。这些实验的结果表明可以使用不同氨甲酰化方案来控制多肽氨甲酰化的效率，由此改变起始产物和/或温育时间。实施例3 遵循不同氨甲酰化方案用尿素使BSA氨甲酰化导致展现改变的PlC倌的经修饰的BSA蛋白。将商品化BSA(在 H2O 中的 lmg/ml)与 H20/HC1 (pH 3. 6)和 3OmM Tris pH 3. 6 或与 6M尿素溶液和30mM Tris pH 3. 6以1 1 1 (vol/vol/vol)混合，并将样品于96°C温育0 分钟、30分钟或60分钟。或者，遵循由Angel及同事(Angel等Q007)Rapid Commun. Mass Spectrom. 21 :1623)所描述的蛋白质氨甲酰化方案处理BSA，如实施例2中所描述的。然后， 将经修饰的BSA蛋白通过在IEF条上以26350Vh的等电聚焦，接着进行10% SDS-PAGE电泳来分离，并通过银染色来显现蛋白质。使用Multiphor II电泳系统(Pharmacia)和电泳电源EPS 3500 XL来实施2-D电泳，如基本上在手册“ImmobilineK DryStrip Kit for 2_D electrophoresis with ImmobilineE DryStrip and ExcelGel SDS”18-1038_63 Edition
25AB (Pharmacia Biotech)巾Midi^白勺。 这些实验表明通过不同甲酰胺化方案得到的BSA化学修饰结果降低BSA的等电点。在本文中，等电点的降低与氨甲酰化的程度相关联。在本文中，遵循Angel及同事的方案处理蛋白质诱导了 BSA等电点的最强迁移，接着于96°C在尿素中加热BSA达60分钟或者于96°C在尿素中加热BSA达30分钟。另外，在尿素中于96°C加热BSA达60分钟导致了出现两种形式Otwo forms)的部分甲酰胺化的BSA蛋白。 _2] t施例4 :DH倌对诵过用2M尿素溶液处理来# BSA M甲酰化的影口向。在此实验中，将牛血清清蛋白(BSA ；在H2O中的lmg/mL)与6M尿素溶液和30mM Tris pH 3.9或30福 Tris pH 6. 8 或 30mM Tris ρΗ 8. 7 以 1 1 1 (vol/vol/vol)混合或备选地将 BSA (在 H2O 中的 lmg/mL)与 H2O 和 30mM Tris pH 3. 9 或 30mM Tris pH 6. 8 或30mM Tris pH 8，7以1 1 1 (vol/vol/vol)混合。然后，将所述样品于96°C在热摇床(300rpm)上温育2小时，并通过10% SDS-PAGE分离。通过用考马斯亮蓝染色来显现蛋白质。这些实验显示了用2M尿素、IOmM Tris于96°C处理2小时后观察到的对BSA的化学修饰(部分氨甲酰化)基本上不受范围为pH 3. 9至pH 8. 7的pH值影响。t施彻丨5:温育时间在尿素介导的BSA M甲酰仆冲的作用。将BSA (在 H2O 中的 lmg/mL)与 6M 尿素和 30mM Tris pH 3. 9 以 1 1 1 (vol/ vol/vol)混合，并于96°C温育0至60分钟(0，2，3，4，5，20，30，45，60分钟)。在一个独立的实验中，将BSA与6M尿素和30mM Tris pH 3，9以1 1 1 (vol/vol/vol)混合，并于 96°C 温育0 至8 小时(0,0. 5,0. 75,1,1. 5,2,2. 5，3，4，5，6，7，8 小时)。然后，将样品通过 10% SDS-PAGE分离，并通过依靠考马斯亮蓝染色的染色来显现蛋白质。这些实验显示了用6M尿素和30mM Tris pH 3. 9于96°C处理BSA导致了 BSA氨甲酰化程度的时间依赖性升高，如通过SDS聚丙烯酰胺凝胶中的经修饰的BSA蛋白的沉降降速所显示的。在本文中，已经在温育2至3分钟后观察到了 BSA分子量的可检出的增加。 在温育多至2小时观察到BSA分子量的增加。在后来的时间点，于96°C用尿素处理BSA导致了可检出的BSA蛋白的量的减少，有力说明了对经修饰的BSA的降解的增加。实施例6 温育时间在尿素介导的BSA氨甲酰化中的影响。将BSA (在 H2O 中的 lmg/mL)与 6M 尿素和 30mM Tris pH 3. 9 以 1 1 1 (vol/ vol/vol)混合，并于范围为 0 至 96°C (0,4,18, 30,40, 50,60, 70,80,90,96°C )的温度温育 2小时。然后，将样品通过10% SDS-PAGE分离，并通过依靠考马斯亮蓝染色的染色来显现蛋白质。在所描述的测试条件，在大于60°C的温育温度看到BSA的可检出氨甲酰化。实施例7 通过用经放置尿素(于96°C加热超过1小时，然后于室温温育7至14 天)处理来调控人巨细胞病毒(CMV)IEl蛋白的等电点。将100 μ 1 IEl蛋白(在磷酸盐缓冲盐水(PBS) (Lonza)中的0. 89 μ g/ml)或与8M 经放置尿素(于96°C加热超过1小时，然后于室温温育7至14天)以1 1(V01/V01)混合的IEl (在PBS中)于40°C温育过夜。然后，将蛋白质通过在IEF条(Immobiline DryStrip pH 3-10,11cm, GE Healthcare)上以 37500Vh 的等电聚焦，接着进行 10% SDS-PAGE 来分离。通过银染色来显现蛋白质。
这些实验的结果显示了与经放置尿素一起温育诱导降低CMV IEl的等电点的化学修饰。实施例8 对未处理的和氨甲酰化的BSA的MALDI-TOF MS分析。为了制备MALDI-T0F-靶物，使用了干燥液滴法(dried droplet method)。因此， 将多肽在缓冲液(50%乙腈(ACN)，LC/NS级(J. T. Baker)、0· 01 %三氟乙酸(TFA)，多肽测序级(Applied biosystems)中溶解，然后以1 1至10 1的基质与样品比率用包含 a-氰基-4-羟基肉桂酸的基质溶液直接溶解。随后，将1 μ 1基质-样品混合物应用于样品板上，于室温干燥，并使用来自Applied Biosystems的MALDI TOF 4800plus分析仪来分析。在装备有2GHz LeCroy数字转换器和337nm N2激光的反射器Bruker反射V延迟提取 MALDI-T0F质谱仪上使用下列参数记录质谱阳极性、加速电压20kV ；IS/2 17kV ；聚焦透镜电压8.90kV ；提取延迟400ns。检测仪是门控的。通常，从样品点内的3至5个不同位置积累100次射击。使用MASCOT(Matrixkience)并通过搜索蛋白质数据库中的匹配的肽质量指纹来获得蛋白质鉴定结果。所使用的搜索标准是氨甲酰甲基化半胱氨酸的固定修饰、甲硫氨酸氧化的可变修饰，并考虑实验与理论Pl和分子量的精确性。在P值小于0. 05 (ρ值是观察到的匹配是随机事件的可能性)时蛋白质得分是显著的。自未修饰的BSA ；双重同位素质子化质量33230. 3和与经放置的8M尿素(于96°C 加热超过1小时，然后于室温温育7至14天)混合(1 1 ；vol/vol)后的BSA ；双重同位素质子化质量33497获得的谱。如此，在这些反应条件，用尿素处理BSA诱导了 226. 7道尔顿的质量迁移，对应于12. 4士2个氨甲酰化。实施例9 通过核磁共振(NMR)谱学来分析多肽氨甲酰化凭借未标记的蛋白质，通常的规程是记录一组2D同核NMR实验=COSY. TOCSY和 NOESY。因此，在 5mm 匪R-管(Norell 502)中提供 190 μ L 多肽溶液、190 μ L PBS(Lonza) 和20 μ L标准溶液S5 (D2O加三甲基甲硅烷基-2，2，3，3-四氘代丙酸(TSP))。通过温和地倒转密闭管来将样品混合得均质，并通过Bruker AVANCE II+600MHz NMR质谱仪用下列参数来分析温度283K(10°C)样品头TXI方法500-XXX-Lif600-TXI-VlNS (瞬态):128(10-谱讣2胃.16(20-谱)SffH (if ) :9591Hz (等于 l6ppm)Dl (瞬态间的时间)2s实施例10 温育温度和温育时间在尿素诱导的BSA氨甲酰化中的作用。在此实验中，将BSA (在H2O中的lmg/mL)与新鲜制备的4M尿素溶液或4M尿素(其于96°C预处理1小时，然后快速冷却至40°C，并于40°C保持10分钟)以1 1 (vol/vol) 混合。然后，将样品于40°C在热摇动仪(300rpm)中温育0、2、4或17小时。然后，将蛋白质通过10% SDS-PAGE来分离，并通过用考马斯亮蓝染色来显现蛋白质。这些实验显示了新鲜制备的4M尿素溶液在BSA氨甲酰化方面比加热的尿素效率低。另外，BSA的分子量的显著增加在与新鲜制备的和预加热的尿素温育17小时后，而非2 和4小时后均是可检出的。在所描述的条件下，经尿素处理的BSA展现了其分子量仅有微弱增加，表明BSA的部分氨甲酰化。^MM 11 诵i寸经放置尿素来# BSA M甲酰化。将BSA (在H2O中的lmg/mL)与经放置的4M尿素(其于96°C预处理1小时，然后于室温温育8天)以1 l(vol/Vol)混合，然后于40°C温育0至对小时(0，2，4，6，8，10， M小时)。然后，将样品通过10% SDS-PAGE分离，并通过用考马斯亮蓝染色来显现蛋白质。在这些实验中，在与经放置尿素一起温育M小时时，而非2至10小时时观察到 BSA分子量的可检出增加。種· 12:鹏OTMiMBSA眺( 嚇幻赫臓的经修饰的BSA蛋白。将BSA (在 H2O 中的 lmg/mL)与 H20/HC1 (pH 3. 6)和 30mM Tris pH 3. 6 或与 6M 尿素溶液和30mM Tris pH 3. 6以1 1 1 (vol/vol/vol)混合，并于96°C将样品温育0分钟、30分钟或60分钟。或者，将IOmM BSA与4M经放置尿素(于96°C加热1小时，然后于室温保持3个月)以1 1 (vol/vol)混合，并于40°C温育20小时。然后，将蛋白质通过在 IEF 条(Immobiline DryStrip pH 3-10,11cm,GE Healthcare)上以洸!350Vh 的等电聚焦，接着进行10% SDS-PAGE来分离，并通过银染色来显现蛋白质。这些实验表明尿素/BSA混合物的加热和将BSA与经放置尿素一起温育都导致展现改变的等电点的经修饰的BSA蛋白。在所描述的条件，在与于40°C将BSA与经放置尿素一起温育相比时，于96°C加热BSA/尿素混合物导致等电点更强的降低。另外，延长加热BSA/ 尿素混合物导致了 BSA等电点的连续降低，表明BSA的氨甲酰化升高。^MM 13 诵过用氰酸钾处理来# BSA化学M甲酰化。在这些实验中，将BSA (在H2O中的lmg/mL)与25、100、500或IOOOmM氰酸钾一起在热摇床(300rpm)上于40°C温育1小时。然后，将样品通过12. 5% SDS PAGE来分离，并依靠考马斯亮蓝染色来显现。在这些调查中，与氰酸钾一起温育诱导了通过氨甲酰化得到的BSA分子量的显著增加。实施例14 通过用氰酸钾处理来使BSA化学氨甲酰化。在这些实验中，将BSA(在 H2O 中的 lmg/mL)于 40°C与 OmM、lmM、5mM、10mM、20mM、 50mM、100mM、200mM或500mM氰酸钾一起在热摇床(300rpm)上温育19. 5小时。然后，将样品通过10% SDS PAGE来分离，并依靠考马斯亮蓝染色来显现。在这些调查中，与氰酸钾一起温育诱导了通过氨甲酰化得到的BSA分子量的显著增加。实施例15 大肠杆菌中的人巨细胞病毒(CMV)IEl蛋白的生成和纯化。为了生成人巨细胞病毒IEl蛋白，将质粒pGEX-KG-IEl转化入大肠杆菌菌株 M15[pRep4]中。为了构建 pGEX-KG-IEl，使用限制酶 Hindlll/EcoRI 自质粒 pcDNA-IEl 切出编码IEl蛋白的基因，并用Klenow酶处理。然后，将获得的片段克隆入经Smal/EcoRI 消化的质粒pGEX-KG中，将所述质粒pGEX-KG用碱性磷酸酶处理，之后再进行连接以避免载体的自身退火。为了生成pcDNA-IEl，用KpnI/BamHI自质粒pCGN_IEl (Nevels等 (2004)，J. Virol. 78 7803)切出IEl蛋白的编码区，并将其插入经KpnI/BamHI消化的质粒 pcDNA3 (Invitrogen)中。实施所有克隆步骤，如基本上在实验室手册“Molecular cloning A laboratory manual,第三版(Sambrook等(2001),Cold Spring Harbor Laboratory,New York)所记载的。
pRep4质粒编码lac启动子(IacItl)的阻抑物，并且如此容许在没有蛋白质表达诱导物的情况中几乎完全阻抑PGEX表达载体的蛋白质生成。对于CMV IEl的生成，将经 pGEX-KG-IEl转化的大肠杆菌菌株M15 [pRep4]的过夜培养物在LBampZkma培养基中稀释，并用ImM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导IEl表达16小时。诱导的细胞生成水平升高的具有约80和32kDa的分子量(其对应于谷胱甘肽S转移酶(GST)-IEl和GST蛋白的分子量) 的IEl蛋白和具有较低分子量的其它蛋白质(其代表GST-IEl和GST蛋白的降解产物)。 使用IEl特异性小鼠抗CMV IEl单克隆抗体((克隆1B12) (Zhu等1995，J. Virol. 69 :7960) 通过免疫印迹来确认这些蛋白质的身份。因此，用质粒pGEX-KG-IEl转染M15[pR印4]细胞，IPTG诱导之前和IPTG诱导16小时后将细胞的等分试样裂解。然后，将细胞裂解物进行 10% SDS-PAGE，并将分离的蛋白质转移至硝酸纤维素。然后，使用抗IEl单克隆抗体(克隆1BU)来显现IEl蛋白。实施通过SDS PAGE的蛋白质分离及随后通过免疫印迹对蛋白质的分析，如在实验室手册“Molecular cloning :A laboratory manual，第三版(Sambrook 等(2001)，Cold Spring Harbor Laboratory, New York)所记载的。为了纯化IEl蛋白，在IPTG诱导16小时后通过以IlOOOrpm在Eppendorf离心机 5417R中离心10分钟来将经pGEX-KG-IEl转化的M15 [pRep4]细胞沉降，并将沉淀物在没有二价离子的 PBS(Lonza) (140mM NaCl、2. 7mM KClUOmM Na2HPO4 ； 1. 8mM KH2PO4)中重悬。另夕卜，添加蛋白酶抑制剂混合物(完全的，Roche，在50mL PBS(Lonza)中的1片)以阻止蛋白质降解。然后，使用法式压榨机(french press) (1. 5kbar,4°C )来将细胞完全裂解，并通过离心(15000rpm，30分钟，4°C在Sorvall SS34转子中)来沉降细胞碎片。然后，使用GST 柱来纯化包含GST-IEl融合蛋白的细胞裂解物的可溶性级分。在本文中，通过结合谷胱甘肽％ 11￡11~0紹 ，随后用还原性谷胱甘肽(50mM Tris/HCl，IOmM还原性谷胱甘肽，pH 8. 5)洗脱来实现GST-IEl融合蛋白的富集。在2mL级分中收集洗脱物，并通过测量^Onm的光密度来在每个级分中测定蛋白质含量。将含有蛋白质的级分通过12. 5% SDS PAGE来分析，并依靠考马斯亮蓝染色来显现。合并含有GST-IEl融合蛋白的级分，并将其与凝血酶(7U/mg GST-IEl融合蛋白)一起温育3小时以分离GST标签。然后，使用HQ-PoroSK柱(Applied Biosystems)通过阴离子交换层析来分离IEl与GST-IEl融合蛋白。在本文中，GST和IEl 在其等电点方面显示显著的差异(GST:6.52;IE1 :4. 58)。虽然GST不结合柱，并且可以在流过物中检出，但是IEl结合，并且可以使用线性NaCl梯度(50mM至1M)用MOmM NaCl自柱洗脱。在2mL级分中收集洗脱物，并通过测量^Onm的光密度来测定每个级分中的蛋白质含量。将含有蛋白质的级分通过12. 5% SDS PAGE和用考马斯亮蓝染色来分析。合并含有IEl蛋白的级分。对于残留的GST-IEl融合蛋白的分离，将组合抗原进行GST柱上的第二次分离。在本文中，GST-IEl结合谷胱甘肽kpharose 基质，而IEl不结合，并且可以在流过物中检出。为了分析纯度和身份，将获得的IEl进行12. 5% SDS-PAGE，并通过用考马斯亮蓝染色来分析凝胶。另外，将蛋白质从不同凝胶转移至硝酸纤维素，并使用IEl特异性单克隆抗体(克隆1B12)通过免疫印迹来特异性显现IEl蛋白。获得的IEl蛋白揭示大于90%的纯度。使用Amicon浓缩装置和具有25kDa截留的滤器来浓缩蛋白质。通过测定摩尔消光系数来测定纯化的IEl的浓度。在本文中，OD28tl 值21500涉及lmol IEl蛋白。自IL培养液获得4至8mg纯化的IEl。实施例16 氨甲酰化的IEl蛋白和YIL肽特异性再活化⑶舻和/或⑶8呻细胞的能力。在这里，依靠流式细胞术来分析氨甲酰化的IE-I蛋白和YIL肽在I和II类MHC 分子上呈递的合适性及随后再活化多肽特异性CD4+和CD8+T细胞的能力。这基于如下的观察结果，即几乎所有的HLAA2-阳性、CMV-阳性血液供体拥有CD8+细胞毒性T细胞，其识别 CMV 蛋白 IEl 内的特定表位(YILEETSVML(SEQ ID NO 4)；氨基酸 315-324)，(Prod' homme 等(2003)，J. Immunol. 170 :2030)。对于对照，用肽ElOF刺激样品，所述肽ElOF覆盖HIV_1 (_)Gag的pM壳体区内的鼠 CTL 表位(aa291-300) (Wild 等· (2004) Vaccine. 2004 ；22 :1732-1743)。因此，将血清阳性供体的肝素化全血以Iml等分试样在无菌!^1(011管(BD)中与未修饰的和氨甲酰化的IE-I蛋白和YIL肽一起温育。对于氨甲酰化，将纯化的IEl蛋白 (在PBS(Lonza)中的0.89μβ/πιυ或纯化的YIL肽与8Μ经放置尿素(于96°C预温育过夜)以1 1 (Vol/Vol)混合，并于40°C温育过夜。然后，实施以下刺激1 对照肽未修饰的HIV Pr55gag衍生的肽(10 μ g/ml)2 未修饰的 IEl 蛋白(10 μ g/mL)3 氨甲酰化的IEl蛋白(10 μ g/mL)4 未修饰的IEl衍生的肽HL (10 μ g/mL)5 氨甲酰化IEl衍生的肽HL (10 μ g/mL)在蛋白质或肽外，以终浓度1 μ g/mL添加针对共刺激分子⑶观和⑶49d的单克隆抗体(Becton Dickinson)。然后，将细胞于37°C温育2小时。然后，将10 μ g/mL布雷菲德菌素A添加至样品以阻止细胞因子分泌。然后，将样品彻底地涡旋振荡，并于37°C再温育7 小时。温育9小时后，添加100 μ 1冰冷的EDTA溶液(在PBS (Lonza)中的EDTA，20mM)。 将样品短暂涡旋振荡，然后于室温温育10分钟。然后，将样品彻底地涡旋振荡，并于室温与 9ml FACS裂解溶液(BD) —起温育10分钟。然后，将样品以340g于4°C离心8分钟。小心地倾去上清液，并用9ml FACS缓冲液(PBS (Lonza) +0. 1 % w/v NaN3+1 % w/v FCS)将细胞清洗两次。然后，将细胞在小体积的FACS缓冲液中重悬，以对表面分子染色。因此，将缀合有荧光团的针对表面分子(⑶3 FITC、⑶4 E⑶和⑶8 APC)的单克隆抗体依照制造商的方案添加，并于室温在黑暗中温育20分钟。然后，如先前所描述的，用FACS缓冲液清洗细胞，经由添加0.5ml 2%低聚甲醛(在PBS(Lonza)中的2%)来固定，并在黑暗中温育10分钟。 然后，将细胞转移至FACS管(BD)，并用:3ml FACS缓冲液清洗。接着，实施透化和胞内染色。 因此，将10 μ 1透化溶液(在PBS中的2 %皂苷)和缀合有荧光团的单克隆IFN- y -PE抗体(依照制造商的方案)移液至细胞上。将样品彻底地涡旋振荡，并于室温在黑暗中温育 30分钟。然后，将细胞用:3ml 0. 皂苷溶液(在PBS(Lonza)中的0. 皂苷)清洗两次， 并在0.5ml低聚甲醛(在PBS(Lonza)中的1%)中固定。将染色的细胞在FACS Epics XL MCL 流式细胞仪(Beckman Coulter)上运行，并使用 CellQuest 软件(Becton Dickinson) 来评估结果。结果显示可以通过用氨甲酰化多肽刺激来恢复显著更多的⑶3和⑶8表达细胞。实施例17 经尿素-和经氰酸盐-氨甲酰化的肽特异性再活化CDSiT细胞的能力。在肽特异性温育后使用对胞内IFN-Y生成的流式细胞术分析来分析氨甲酰化的肽再活化肽特异性⑶8+T细胞的能力。因此，将全血与YIL肽的不同配制剂一起温育9小时，并依照已经在实施例16中所描述的方案来对PBMC染色。在这些实验中，将YIL肽(在 100% DMSO中的10 μ g/μ 1)与8Μ经放置尿素(于96 °C预温育过夜)或200mM KOCN以
1 1 (Vol/Vol)混合，并于40°C温育过夜。然后，实施下列刺激1:10μ g/mL 对照肽 HIV p24 衍生的肽 ElOF2 10 μ g/mL CMV IEl 衍生的肽 YIL3 :10μ g/mL用IOOmM KOCN氨甲酰化的CMV IEl衍生的肽YIL (包括经刺激的血液样品中终浓度200 μ M的K0CN)4 :10μ g/mL用4M尿素氨甲酰化的CMV IEl衍生的肽YIL (包括经刺激的血液样品中终浓度8mM的尿素) 5 200 μ M KOCN(经刺激的血液样品中的终浓度)6 =SmM尿素(经刺激的血液样品中的终浓度)结果显示了凭借200mM K0CN，氨甲酰化的YIL肽比非氨甲酰化的YIL肽显著再活化更多的⑶8+T细胞。^MM 18 经植避盐氨甲酰化_太禾口蛋白质特尉牛再活化CD81细胞调能力。在此实验中，分析经氰酸盐氨甲酰化的CMV YIL肽和pp65蛋白特异性再活化 ⑶8+T细胞的能力。因此，将全血与YIL肽的不同配制剂一起温育6小时，并依照已经在实施例16中所描述的方案来对PBMC染色。在这些实验中，将YIL肽(在100% DMSO中的
2μ g/ μ 1)与 200mM、400mM 或 IOOOmM 在 H2O 中的 KOCN 以 1 1 (Vol/Vol)混合，并于 40°C 温育过夜。将 CMV(AD169 株)pp65 的免疫优势区(aa 862-1048 ；RecMol UL83_Pp65，产品目录编号 1B023A)在包含 140mM NaCU2. 7mM KClUOmM Na2HPO4U. 8mM ΚΗ2Ρ04&范围为 0 至500mM的不同浓度的KOCN的H2O中溶解，并于40°C温育过夜。实施下列刺激1 非刺激的细胞(阴性对照)2 :10 μ g/mL CMV IEl 肽 YIL3 10 μ g/mL用IOOmM KOCN氨甲酰化的CMV IEl肽YIL (包括在经刺激的血液样品中终浓度ImM的K0CN)4 10 μ g/mL用200mM KOCN氨甲酰化的CMV IEl肽YIL (包括在经刺激的血液样品中终浓度2mM的K0CN)5 10 μ g/mL用500mM KOCN氨甲酰化的CMV IEl肽YIL (包括在经刺激的血液样品中终浓度5mM的K0CN)6 :10 μ g/mL CMV pp65 蛋白(免疫优势区)7 :10μ g/mL用IOOmM KOCN氨甲酰化的CMV pp65蛋白(包括在经刺激的血液样品中终浓度ImM K0CN)8 10 μ g/mL用200mM KOCN氨甲酰化的CMV pp65蛋白(包括在经刺激的血液样品中终浓度2mM K0CN)9 10 μ g/mL用500mM KOCN氨甲酰化的CMV pp65蛋白(包括在经刺激的血液样品中终浓度5mM K0CN)结果显示了在存在0. 04M尿素情况中的经氰酸钾氨甲酰化的YIL肽和pp65蛋白分别展现了比非氨甲酰化YIL肽和pp65蛋白升高的特异性再活化CD8+T细胞的能力。在本
31文中，用范围为100至500mM的浓度渐增的氰酸钾处理pp65与pp65特异性活化⑶8+T细胞以进行IFN-Y生成的能力升高直接相关联。与之相对，对于YIL肽，用IOOmM和200mM氰酸钾的预处理比用500mM氰酸钾预处理YIL更有效地提高YIL特异性刺激⑶8+T细胞的效力。实施例19:与CdG ODN 1668组合的经尿素修饰的HIV D24壳体抗原活化小鼠中的HIV p24特异件CDS1T细胞的能力。在BALB/c小鼠模型中分析氨甲酰化HIV p24壳体蛋白刺激pM特异性⑶8+T细胞的能力。因此，于40°C用经放置尿素(于96°C预处理1小时)将纯化的重组p24的等分试样处理过夜，然后针对PBS (Lonza)中的0.04M尿素广泛透析。用IOyg未修饰的pM在没有(组4)或存在50 μ g/剂CpG 00附668(组幻的情况中或用经尿素处理的、经修饰的 p24 (up24)在没有(组2、或存在50 μ g/剂CpG 0DN1668 (组幻的情况中肌肉内免疫六只 40至60天龄的雌性BALB/c小鼠。以PBS (Lonza)中的总体积100 μ g施用免疫原。对于对照，用PBS(Lonza)中总体积100 μ 1的0. 04Μ尿素溶液(组1)或10 μ g HIV昆虫细胞衍生的HIV Gag病毒样颗粒(VLP) (Deml等2005,Mol. Immunol. 42 :259)免疫六只小鼠的组。在第0周时免疫所有动物，并且它们在第2周和第4周时接受用相同免疫原的加强注射。在第3周和第6周时，通过颈脱位来处死每组的三只小鼠，并在无菌条件下取出脾。然后，将脾放置于含有IOml脾细胞培养基(RPMI培养基、5 %热灭活的胎牛血清(FCS)、20mM HEPES、50 μ M 2-巯基-乙醇、1 % Pen/Step 溶液)的 50mlFalcon 管(BD Heidelberg, Germany)中，并于室温保持(不长于15分钟)。用相同体积的新鲜脾细胞培养基替换培养基，并将脾转移至70 μ M细胞滤器(BD产品目录编号352350)上，所述细胞滤器放置于50ml i^lcon管上。通过用5ml注射器的柱塞针对细胞滤器研磨脾，直至大部分纤维组织仍然留下来生成单细胞悬浮液。通过重复添加2ml脾细胞培养基自细胞滤器吸出单一化的细胞。通过于室温以300g离心5分钟来使获得的细胞悬浮液沉降，并通过用IOmL 或25mL塑料移液管温和但彻底地移液来将沉淀的细胞在5mL/脾ACK溶血缓冲液(150mM NH4ClUmM KHCO3>0. ImM Na2EDTA (Titriplex III)；用 IN HCl 调节 pH 7· 2 至 7· 4)中重悬。 然后，将细胞悬浮液以300g于室温离心5分钟，并用IOmL/脾脾细胞培养基清洗三次。在每个清洗步骤，将细胞悬浮液与聚集的纤维组织分离。最后，将细胞在5ml/脾脾细胞培养基中重悬，计数，并调节至脾细胞培养基中终浓度MlO6个细胞/ml，并于37°C保存(不长于30分钟)，直至使用。将hlO6个鼠脾细胞于37°C在平底96孔板上在每孔100 μ 1脾细胞培养基中培养。用IOyg HIV C型ρΜ肽(AMQILKDTI (SEQ ID NO 1)；在经ρΜ免疫的小鼠的情况中为 aa197_2Q5)或 HIVlai A9I 肽(AMQMLKETI (SEQ ID NO :2)；在经 VLP 刺激的小鼠的情况中为aa 197-205(Wild等^)04)，Vaccine 22 :1732))或者对于阴性对照用无关肽刺激细胞，所述无关肽代表人前列腺特异性抗原内的HLA A2限制性CTL表位(PSA 141-150 FLTPKKLQCV(SEQ ID NO 3) ；Chakraborty 等(2003)，Cancer Immunol. Immunother. 52 497)。PMA(佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯)和伊屋诺霉素(Ionomycin)的组合充当阳性对照。重复实施每个多肽刺激。如下混合刺激物免疫原阴性对照1.5ml脾细胞培养基+3 μ 1布雷菲德菌素A (5 μ g/μ 1)+3 μ 1 PSA-肽(10 μ g/μ 1)阳性对照1ml脾细胞培养基+2 μ 1布雷菲德菌素A (5 μ g/μ 1)+1 μ 1 PMA (1 Ug/ ml)+1伊屋诺霉素(iyg/μ )HIV C-型pM肽溶液1. 5ml脾细胞培养基+3 μ 1布雷菲德菌素Α(5 μ g/ μ 1)+3μ 1 肽(10 μ g/μ 1)HIVlai Α9Ι肽溶液0.5ml脾细胞培养基+Ιμ 布雷菲德菌素A(5yg/yl) +肽 (10 μ g/μ 1)然后，将平板在标准的培养箱中于37°C温育。6小时后，将样品转移至含有Iml FACS 缓冲液(PBS(Lonza)、1% (v/v)FCS,0. 1 % w/v NaN3)的 FACS 管中。然后，于 4°C 以 300g将样品离心5分钟。然后，小心地倾去上清液，并用Iml FACS缓冲液再清洗细胞，并以 300g再离心8分钟。然后，将细胞在小体积(约100 μ 1)FACS缓冲液中重悬，并且首先于 4°C与抗-FcRII/III mAb (PharMingen, Hamburg, Germany) 一起温育 10 分钟以阻断缀合有荧光的抗体的非特异性结合。然后，使用下列抗体依照制造商的方案在染色体积100μ 1中在冰上对表面标志物染色30分钟⑶3 FITC、⑶4 PerCP和⑶8 APC0然后，将细胞用5ml FACS缓冲液清洗，并以300g离心5分钟。之后，用250 μ 1 Cytofix/Cytoperm(4% (w/v) PFA+1% (w/v)皂苷)将细胞在冰上固定20分钟。然后，将细胞用5ml perm/洗液(0. 1% 在PBS(Lonza)中的(w/v)皂苷)清洗两次，并在每次清洗步骤后以500g于4°C离心5分钟。将细胞在100 μ 1 perm/洗液中重悬，并使用IFN-γ-PE抗体依照制造商的方案在冰上在黑暗中将胞内IFN-Y染色20分钟。随后，将细胞用5ml FACS缓冲液清洗两次，并在每个清洗步骤后以300g离心5分钟。最后，将细胞在200μ1 低聚甲醛(PFA)溶液中重悬。在FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson, Germany)上实施FACS分析，每个样品获得30，000个⑶8+T细胞。然后，使用CellQuest软件来分析FACS数据。结果清楚地表明，与在没有和存在CpG ODN 1668的情况中用未修饰的pM或在没有CpG ODN 1668的情况中用氨甲酰化pM免疫的小鼠相比，用与CpG ODN 1668组合的氨甲酰化的PM免疫小鼠诱导显著更多的CD8+T细胞。实施例20 成熟树突细胞中HIV p24壳体蛋白的摄取为了测定HIV pM壳体蛋白是否具有进入成熟树突细胞的胞质溶胶的固有特性并且其是否因而必须分类成如上所述的第一或第二组多肽，已经实施了以下测试将在R10(RPMI 1640，10 %人AB血清)中的6_9X IO5个/ml成熟树突细胞与 10yg/ml重组HIV pM壳体蛋白于37°C —起温育15分钟。随后，将333 μ 1细胞悬浮液放入细胞旋转载玻片(Hettich，Tuttlingen)上，并以300g将载玻片离心3分钟。在将载玻片干燥60分钟后，用低聚甲醛(在PBS中的4% )覆盖细胞以进行固定，并于37°C温育 15分钟。然后，将细胞用IOml PBS清洗三次然后用凡士林环绕固定了细胞的区域。然后， 用150 μ 1(5 μ g/ml) Alexa Fluor染料Qnvitrogen,USA)将细胞的细胞质膜染色10分钟。 在用10ml PBS将载玻片清洗两次后，用4°C冷丙酮覆盖细胞以透化细胞。然后，将细胞用 150 μ 1 RlO饱和30分钟。除去RlO后，将ρΜ检测荧光抗体KC57-FITC(Coulter Clone, USA)依照制造商的方案给予至细胞上达2小时。然后，将载玻片用10ml PBS清洗三次。然后，用 150μ l(10ng/ml)4，，6 二氨基-2-苯基吲哚(DAPI) (Roche, Mannheim)标记细胞核。 然后，将载玻片用10ml PBS清洗，并干燥60分钟。然后，在载玻片上给予15 μ 1 MobiGlow
33封固剂(MoBiTec，G0ttingen)，并用盖玻片覆盖。 然后，使用LEICA-DMRX显微镜(Leica，ffetzlar)来实施荧光显微术。使用 Image-Pro Plus 6· 2 软件(MediaCybernetics,USA)来解读结果。显微照片指示，HIV p24 壳体蛋白没有进入树突细胞的胞质溶胶。如此，HIV pM壳体蛋白是依照如上所述的第二组多肽的多肽。
权利要求
1.一种用于将多肽转移入细胞中的方法，包括下列步骤a)在包含氰酸盐离子的溶液中温育多肽，其中所述氰酸盐离子以范围从约1至约 1000mmol/l的浓度存在，并b)在存在尿素的条件下将细胞与步骤(a)的所述多肽一起温育。
2.依照权利要求1的方法，其中所述细胞是原核细胞，优选细菌，或真核细胞，优选真菌，优选酵母或丝状真菌，昆虫，鸟，爬行动物，鱼，两栖动物或哺乳动物细胞，优选鼠或人细胞，其中所述哺乳动物细胞优选抗原呈递细胞(APC)，优选树突细胞(优选朗格汉斯细胞)、 单核细胞、巨噬细胞、B细胞或血管上皮细胞和上皮、间充质细胞和脑的小胶质细胞。
3.一种用于检测多肽特异性免疫细胞的方法，包括下列步骤a)在包含氰酸盐离子的溶液中温育多肽，其中所述氰酸盐离子以范围从约1至约 1000mmol/l的浓度存在，并b)在存在尿素的条件下将含有APC的细胞培养物或体液与步骤(a)的所述多肽一起温育，c)将依照步骤b)获得的所述含有APC的细胞培养物或体液与免疫细胞或含有免疫细胞的体液一起温育，d)同时和/或特异性检测和/或量化针对来自步骤a)的所述多肽具有特异性的免疫细胞的各种亚型。
4.依照权利要求3的方法，其中所述含有APC的细胞培养物是PBMC群(白细胞除去物)、分离的单核细胞或分离的APC群，优选包含树突细胞(优选朗格汉斯细胞)、单核细胞、巨噬细胞或B细胞，而所述含有APC的体液是全血或液体，和/或其中所述多肽特异性免疫细胞是T细胞，优选⑶4+T细胞、⑶8+T细胞、⑶4+CD8dimT细胞或⑶4+调节性T细胞，或其它免疫细胞群体，优选⑶56+⑶8+、⑶56_CD57+⑶8+NKT细胞或⑶56+NK细胞，或它们的混合物和/或其中所述含有免疫细胞的体液是全血和/或液体。
5.依照权利要求3或4的方法，其中所述检测和/或所述量化是依靠检测所述多肽特异性免疫细胞的特异性表面标志物和标志物细胞因子TNF、IFN y、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、 IL-17或TGF-β的生成来实施的。
6.一种用于引发、扩增和/或再活化多肽特异性T细胞的方法，包括下列步骤a)在包含氰酸盐离子的溶液中温育多肽，其中所述氰酸盐离子以范围从约1至约 1000mmol/l的浓度存在，并b)在存在尿素的条件下并在不存在或存在免疫调节性物质的条件下将细胞与步骤a) 的所述多肽一起温育，其中所述多肽特异性T细胞优选是CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。
7.依照前述权利要求中任一项的方法，其中所述氰酸盐离子以范围从约5mmol/l至约 900mmol/l、从约 10mmol/l 至约 800mmol/l、从约 20mmol/l 至约 700mmol/l、从约 50mmol/l 至约600mmol/l或从约100mmol/l至约500mmol/l的浓度存在。
8.依照前述权利要求中任一项的方法，其中步骤a)的所述溶液另外包含尿素，优选范围从约0. Olmol/升至约8mol/升、从约0. 1至约0. 5mol/升、从约0. 5至约5mol/升、或从约5至约8mol/升。
9.依照权利要求8的方法，其中所述尿素已经通过温育预处理，其中所述温育参数优选为热度和/或时间。
10.依照前述权利要求中任一项的方法，其中步骤b)中的尿素浓度范围从约0.001至约 0. 8mol/l、从约 0. 01 至约 0. lmol/1、从约 0. 015mol/l 至约 0. 09mol/l、从约 0. 02mol/l 至约 0. 08mol/l、从约 0. 025mol/l 至约 0. 07mol/l、从约 0. 03mol/l 至约 0. 06mol/l 或从约 0. 035mol/l至约0. 05mol/l，且特别地其中步骤b)中的尿素浓度是约0. 04mol/l。
11.依照权利要求8至10中任一项的方法，其中所述尿素溶液另外含有具有范围从约 0. 25mmol/l至约200mmol/l、或从约0. 25mmol/l至约75mmol/l的浓度的NaCl和/或具有范围从约0. 25nmol/l至约200nmol/l、或从约0. 25nmol/l至约75nmol/l的浓度的DTE或 DTT。
12.依照前述权利要求中任一项的方法，其中所述多肽(i)在步骤a)中以范围从约0.1至约50yg/ml、从约1至约40yg/ml、从约3至约 30 μ g/ml、或从约5至约20 μ g/mL的浓度且特别地以约10 μ g/ml的浓度存在；和/或(ii)在步骤b)中以对于约106个细胞范围从约0.1至约200 μ g或更高、或从约0. 1 至约200 μ g、或从约0. 1至约2 μ g、或从约0. 1至约10 μ g、或从约10至约50 μ g或从约 50至约200 μ g的量存在。
13.依照前述权利要求中任一项的方法，其中步骤a)中的所述多肽的温育导致所述多肽的分子量增加和/或所述多肽的PKi值向更酸性的PKi值转变。
14.与尿素组合的权利要求1的步骤a)中获得的多肽用于研究、诊断或治疗和预防动物和人中的疾病的用途。
15.与尿素组合的权利要求1的步骤a)中获得的多肽，其用作药物，优选用于预防和治疗传染病和肿瘤。
全文摘要
本发明涉及一种用于将多肽转移入细胞中的方法。本发明进一步涉及多肽特异性免疫细胞的检测和多肽特异性T细胞的引发、扩增和再活化。此外，本发明涉及与尿素组合的本发明方法的多肽及其用于研究、诊断或治疗和预防动物和人疾病的用途。
文档编号G01N33/50GK102460161SQ201080025527
公开日2012年5月16日 申请日期2010年4月9日 优先权日2009年4月9日
发明者K.埃德迈耶, L.戴姆尔, S.巴拉巴斯 申请人:洛菲厄斯生物科学有限责任公司