长效多肽及其生产和施用方法
【专利说明】
[0001] 本发明是申请日为2007年2月5日，申请号为200780012026. 6,标题为"长效多 肽及其生产和施用方法"的专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明提供包括至少两个与感兴趣的肽连接的绒毛膜促性腺激素的羧基末端肽 (CPT)的多肽以及编码所述多肽的多核苷酸。也提供包括本发明的多肽和多核苷酸的药物 组合物及其使用方法。
【背景技术】
[0003] 多肽在血液、肝脏或肾脏中都容易被变性或酶降解。因此，多肽一般都具有短的循 环半衰期，通常是数个小时。由于它们的低稳定性，通常需要按持续的频率来转运肽药物， 以便保持活性肽的有效的血浆浓度。此外，因为通常需要通过输注来施用肽药物，因此频繁 的注射肽药物会给对象带来相当多的不适。因此，需要延长药物性多肽的半衰期同时保持 其高药物疗效的技术。这种期待中的肽药物也应当满足增强血清稳定性、高活性以及当被 注射到对象体内时诱导不必要的免疫应答的低可能性的要求。
[0004] 不利的药物动力学例如短半衰期可以妨碍许多其他有希望的药物候选物的药物 开发。血清半衰期是分子的一种经验特征，必须要通过实验地测定出每种新的潜在药物的 半衰期。例如，对于低分子量多肽药物而言，生理清除机制例如肾脏滤过可以使得保持药物 的治疗水平变为难以实现，主要是因为所需给药方案的价格或频率。相反地，长的血清半衰 期也是不利的，因为这样的药物或其代谢物具有毒性副作用。
【发明内容】
[0005] 在一个实施方式中，本发明提供了包括至少两个与感兴趣的多肽序列相连接的绒 毛膜促性腺激素羧基末端肽（CTP)氨基酸序列的多肽。
[0006] 在另一个实施方式中，本发明提供了包括与感兴趣的多肽序列的氨基末端连接的 第一个绒毛膜促性腺激素 CTP氨基酸（AA)序列以及与感兴趣的多肽序列的羧基末端连接 的第二个CTP氨基酸序列的多肽。
[0007] 在另一个实施方式中，本发明提供了包括两个与感兴趣的多肽序列的羧基末端连 接的绒毛膜促性腺激素 CTP序列的多肽。
[0008] 在另一个实施方式中，本发明提供了包括与感兴趣的多肽序列的氨基末端连接的 第一个绒毛膜促性腺激素 CTP AA序列以及与感兴趣的多肽序列的羧基末端连接的第二个 和第三个CTP AA序列的多肽。
[0009] 在另一个实施方式中，本发明提供了包括至少三个与感兴趣的多肽序列相连接的 绒毛膜促性腺激素 CTP AA序列的多肽。
[0010] 在另一个实施方式中，本发明提供了包括编码多肽的序列的多核苷酸，所述多肽 包括至少两个与感兴趣的多肽序列相连接的绒毛膜促性腺激素 CTP AA序列。
[0011] 在另一个实施方式中，本发明提供了包括编码与感兴趣的多肽序列的氨基末端连 接的第一个绒毛膜促性腺激素 CTP AA序列以及与感兴趣的多肽序列的羧基末端连接的第 二个CTP AA序列的核苷酸序列的多核苷酸。
[0012] 在另一个实施方式中，本发明提供了包括编码两个与感兴趣的多肽序列的羧基末 端连接的绒毛膜促性腺激素 CTP AA序列的序列的多核苷酸。
[0013] 在另一个实施方式中，本发明提供了包括编码与感兴趣的多肽序列的氨基末端连 接的第一个绒毛膜促性腺激素 CTP AA序列以及与感兴趣的多肽序列的羧基末端连接的第 二个和第三个CTP AA序列的序列的多核苷酸。
[0014] 在另一个实施方式中，本发明提供了包括编码至少三个与感兴趣的多肽序列相连 接的绒毛膜促性腺激素 CTP AA序列的序列的多核苷酸。
[0015] 在另一个实施方式中，本发明提供了治疗对象的生长、体重相关性病变或代谢性 病变的方法，所述方法包括给对象施用治疗有效量的CTP-hGH的步骤，据此治疗患有生长 或体重相关性病变的对象。hGH-般是用于治疗生长疾病，特别是生长激素缺乏相关性疾 病。在我们的实施例中，我们证实了垂体切除小鼠（不再分泌生长激素）在注射CTP-hGH 之后重新得到了生长。
[0016] 在另一个实施方式中，本发明提供了提高感兴趣的多肽序列的生物半衰期的方 法，包括将至少两个绒毛膜促性腺激素 CTP AA序列连接于感兴趣的多肽序列的步骤。
[0017] 在另一个实施方式中，本发明提供了给所需治疗的对象施用感兴趣的多肽序列的 方法，包括将至少两个绒毛膜促性腺激素 CTP AA序列连接于感兴趣的肽系列的步骤。
[0018] 在另一个实施方式中，本发明提供了包括至少两个与EPO肽相连接的绒毛膜促性 腺激素 CTP AA序列的多肽。
[0019] 在另一个实施方式中，本发明提供了包括与EPO肽的氨基末端连接的第一个绒毛 膜促性腺激素 CTP AA序列以及与EPO肽的羧基末端连接的第二个CTP AA序列的多肽。
[0020] 在另一个实施方式中，本发明提供了包括两个与EPO肽的羧基末端相连接的绒毛 膜促性腺激素 CTP AA序列的多肽。
[0021] 在另一个实施方式中，本发明提供了包括与EPO肽的氨基末端连接的第一个绒毛 膜促性腺激素 CTP AA序列以及与EPO肽的羧基末端连接的第二个和第三个CTP AA序列的 多肽。
[0022] 在另一个实施方式中，本发明提供了包括至少三个与EPO肽相连接的绒毛膜促性 腺激素 CTP AA序列的多肽。
[0023] 在另一个实施方式中，本发明提供了包括编码至少两个与EPO肽相连接的绒毛膜 促性腺激素 CTP AA序列的核苷酸序列的多核苷酸。
[0024] 在另一个实施方式中，本发明提供了包括编码与EPO肽的氨基末端连接的第一个 绒毛膜促性腺激素 CTP AA序列以及与EPO肽的羧基末端连接的第二个CTP AA序列的核苷 酸序列的多核苷酸。
[0025] 在另一个实施方式中，本发明提供了包括编码两个与感兴趣的多肽序列的羧基末 端连接的绒毛膜促性腺激素 CTP AA序列的核苷酸序列的多核苷酸。
[0026] 在另一个实施方式中，本发明提供了包括编码与感兴趣的多肽序列的氨基末端连 接的第一个绒毛膜促性腺激素 CTP AA序列以及与感兴趣的多肽序列的羧基末端连接的第 二个和第三个CTP AA序列的核苷酸序列的多核苷酸。
[0027] 在另一个实施方式中，本发明提供了包括编码至少三个与感兴趣的多肽序列相连 接的绒毛膜促性腺激素 CTP AA序列多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
[0028] 在另一个实施方式中，本发明提供了治疗或降低对象的贫血发生率的方法，包括 给对象施用治疗有效量的EPO-CTP的步骤，据此治疗患有贫血的对象。
【附图说明】
[0029] 图1A-1F是显示六个EPO-CTP构建体的图。
[0030] 图IA是多肽SEQ ID NO: 1的图。
[0031] 图IB是多肽SEQ ID NO:2的图。
[0032] 图IC是多肽SEQ ID NO:3的图。
[0033] 图ID是多肽SEQ ID NO:4的图。
[0034] 图IE是多肽SEQ ID NO:5的图。
[0035] 图IF是多肽SEQ ID NO:6的图。
[0036] 图2是显示经转染的DG44细胞表达EPO-CTP变体的照片。如在"样品制备"中所 述的制备出来自转染细胞的最终测试样品，并在SDS-PAGE上跑胶。用免疫印迹检测蛋白。
[0037] 图3是显示重组hEPO衍生物和EP0-3 (SEQ ID N0:3)的体内生物学活性的图表。 ICR 小鼠（每组7 只）接受每周单次 IV 注射（15yg/kg)EP0-3、rhEP0-WT(SEQ ID N0:16)、 Recormon (商品化ΕΡ0)或每周3次Recormon (5 μ g/kg)共3周。对照动物IV注射PBS。每周 收集血样3次，检测出红细胞压积水平。每个点都代表红细胞压积的组内平均值（％ ) 土 SE。
[0038] 图4是显示重组hEPO衍生物和EP0-1(SEQ ID NO: 1)的体内生物学活性的图表。 ICR 小鼠（每组7 只）接受每周单次 IV 注射（15yg/kg)EP0-l、rhEP0-WT(SEQ ID N0:16)、 Recormon (商品化ΕΡ0)或每周3次Recormon (5 μ g/kg)共3周。对照动物IV注射PBS。每周 收集血样3次，检测出红细胞压积水平。每个点都代表红细胞压积的组内平均值（％ ) 土 SE。
[0039] 图5是显示重组hEPO衍生物和EP0-2(SEQ ID NO: 2)的体内生物学活性的图表。 ICR 小鼠（每组7 只）接受每周单次 IV 注射（15yg/kg)EP0-2、rhEP0-WT(SEQ ID N0:16)、 Recormon (商品化ΕΡ0)或每周3次Recormon (5 μ g/kg)共3周。对照动物IV注射PBS。每周 收集血样3次，检测出红细胞压积水平。每个点都代表红细胞压积的组内平均值（％ ) 土 SE。
[0040] 图 6 是显示在单次推注剂量 EP〇-〇(SEQ ID N0:16)、EP0-3(SEQ ID N0:3)和 Aranesp之后的网织红细胞水平变化的时距图。
[0041] 图 7 是显示在单次推注剂量 EP〇-〇(SEQ ID N0:16)、EP0-3(SEQ ID N0:3)和 Aranesp之后的血红蛋白水平变化（表示为相对于基线水平的变化）的时距图。
[0042] 图 8 是显示在单次推注剂量 EP〇-〇(SEQ ID N0:16)、EP0-3(SEQ ID N0:3)和 Aranesp之后的红细胞压积水平变化（表示为相对于基线水平的变化）的时距图。
[0043] 图 9 是显示 IV 注射后的 EPO-O (SEQ ID NO: 16)、EP0-3 (SEQ ID NO: 3)和 Aranesp 的血清浓度的图。
[0044] 图 10 是显示 M0D-4020(SEQ ID N0:36)、M0D-4021(SEQ ID N0:37)、M0D-4022(SEQ ID NO :38)、M0D-4023 (SEQ ID NO :39)和 M0D-4024 (SEQ ID NO :40)的分子量和身份的免疫 印迹。照片表明与商品化和野生型的hGH -样，抗hGH抗体可以识别出M0D-7020-4变体。
[0045] 图11是显示垂体切除小鼠在施用本发明的GH-CTP多肽之后的体重增长的条线 图。
【具体实施方式】
[0046] 在一个实施方式中，本发明描述了长效多肽以及生产和使用所述多肽的方法。在 一个实施方式中，长效多肽包括人绒毛膜促性腺激素（hCG)的羧基末端肽（CTP)。在一个实 施方式中，CTP作为保护剂起到抗蛋白降解或抗源自所述蛋白的肽降解的作用。在一个实 施方式中，CTP延长了蛋白或源自所述蛋白的肽的循环半衰期。在一个实施方式中，CTP增 强了蛋白或源自蛋白的肽的效力。
[0047] 在另一个实施方式中，"CTP肽"、"羧基末端肽"和"CTP序列"在此可以互换使用。 在另一个实施方式中，羧基末端肽是全长CTP。在另一个实施方式中，羧基末端肽是截短的 CTP。每种可能性都代表着本发明的独立的实施方式。
[0048] 在另一个实施方式中，"ΕΡ0肽"和"ΕΡ0序列"在此可以互换使用。在另一个实施 方式中，EPO肽是EPO蛋白。在另一个实施方式中，羧基末端肽是截短的EPO蛋白。每种可 能性都代表着本发明的独立的实施方式。
[0049] 在另一个实施方式中，"信号序列"和"信号肽"在此可以互换使用。在另一个实施 方式中，当涉及多核苷酸时，"序列"可以指的是编码部分。每种可能性都代表着本发明的独 立的实施方式。
[0050] 在另一个实施方式中，"感兴趣的肽"和"感兴趣的多肽序列"在此可以互换使用。 在另一个实施方式中，感兴趣的肽是全长蛋白。在另一个实施方式中，感兴趣的肽是蛋白片 段。每种可能性都代表着本发明的独立的实施方式。
[0051] 在一个实施方式中，提供了包括至少两个与感兴趣的多肽序列相连接的绒毛膜促 性腺激素的羧基末端肽（CTP)序列的多肽，其中至少两个CTP序列中的第一个CTP序列与 感兴趣的多肽序列的氨基末端连接以及至少两个CTP序列中的第二个序列与感兴趣的多 肽序列的羧基末端连接。在另一个实施方式中，羧基末端肽（CTP)序列是人绒毛膜促性腺 激素的CTP序列。
[0052] 在另一个实施方式中，羧基末端肽（CTP)经连接物与感兴趣的多肽序列相连接。 在另一个实施方式中，连接CTP序列和感兴趣的多肽序列的连接物是共价键。在另一个实 施方式中，连接CTP序列和感兴趣的多肽序列的连接物是肽键。在另一个实施方式中，连接 CTP序列和感兴趣的多肽序列的连接物是取代肽键。
[0053] 在另一个实施方式中，术语"感兴趣的多肽序列"指的是任一多肽序列，例如具有 生物学活性的多肽序列。在另一个实施方式中，肽是糖基化的肽。在另一个实施方式中，肽 是非糖基化的肽。从延长其循环半衰期中获益的多肽实例包括但不限于促红细胞生成素 (EPO)、干扰素、人生长激素（hGH)和胰高血糖素样肽-I(GLP-I)。
[0054] 在另一个实施方式中，人绒毛膜促性腺激素（hCG)的羧基末端肽（CTP)与蛋白融 合。在另一个实施方式中，人绒毛膜促性腺激素（hCG)的羧基末端肽（CTP)与糖蛋白融合。 在另一个实施方式中，人绒毛膜促性腺激素（hCG)的羧基末端肽（CTP)与糖蛋白激素融合。 在另一个实施方式中，人绒毛膜促性腺激素（hCG)的羧基末端肽（CTP)与源自糖蛋白激素 的肽融合。在一些实施方式中，糖蛋白激素包括EP0、FSH、或TSH以及源自上述激素的肽。
[0055] 在一些实施方式中，多肽的氨基末端以及多肽的羧基末端的CTP序列提供了增强 的抗蛋白降解的保护性。在一些实施方式中，多肽的氨基末端以及多肽的羧基末端的CTP 序列为所连接的蛋白提供了延长的半衰期。
[0056] 在一些实施方式中，多肽的氨基末端的CTP、多肽的羧基末端的CTP序列、以及至 少一个额外的与羧基末端的CTP序列串联连接的CTP序列提供了增强的抗蛋白降解的保护 性。在一些实施方式中，多肽的氨基末端的CTP、多肽的羧基末端的CTP序列、以及至少一 个额外的与羧基末端的CTP序列串联连接的CTP序列为所连接的蛋白提供了延长的半衰 期。多肽的氨基末端的CTP、多肽的羧基末端的CTP序列、以及至少一个额外的与羧基末端 的CTP序列串联连接的CTP序列为所连接的蛋白提供了增强的活性。
[0057] 在一些实施方式中，多肽的氨基末端的CTP、多肽的羧基末端的CTP序列、以及至 少一个额外的与氨基末端的CTP序列串联连接的CTP序列提供了增强的抗蛋白降解的保护 性。在一些实施方式中，多肽的氨基末端的CTP、多肽的羧基末端的CTP序列、以及至少一 个额外的与氨基末端的CTP序列串联连接的CTP序列为所连接的蛋白提供了延长的半衰 期。多肽的氨基末端的CTP、多肽的羧基末端的CTP序列、以及至少一个额外的与氨基末端 的CTP序列串联连接的CTP序列为所连接的蛋白提供了增强的活性。
[0058] 在另一个实施方式中，本发明的羧基末端肽（CTP)包括如SEQ ID NO: 17所示的来 自人绒毛膜促性腺激素第112到145位氨基酸（AA)的AA序列。在另一个实施方式中，本 发明的羧基末端肽（CTP)包括如SEQ ID NO: 18所示的来自人绒毛膜促性腺激素的第118 到145位AA的AA序列。在另一个实施方式中，CTP序列也可以开始于人绒毛膜促性腺激 素的第112到118位之间的任一位点以及终止于第145位。在一些实施方式中，CTP序列 肽是 28、29、30、31、32、33、或3444长度并开始于〇^4八序列的第112、113、114、115、116、 117 或 118 位。
[0059] 在另一个实施方式中，CTP肽是绒毛膜促性腺激素 CTP的变体，其与天然CTP有着 1到5个保守AA取代的不同，如美国专利5, 712, 122所述。在另一个实施方式中，CTP肽是 绒毛膜促性腺激素 CTP的变体，其与天然CTP有着1个保守AA取代的不同。在另一个实施 方式中，CTP肽是绒毛膜促性腺激素 CTP的变体，其与天然CTP有着2个保守