专利名称：生产肽的方法
技术领域：
本发明涉及生产肽或者其盐的方法，该肽具有从下丘脑分泌的黄体生成素释放激素(LHRH)的激动剂的活性。本发明还涉及中间产物肽，其生产方法，其晶体以及生产所述晶体的方法。
背景技术：
对应于日本专利申请公开公报No.50-059370/1975的美国专利4008209描述了生产下列分子式的肽的下列方法(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr(或Phe)-X-Leu(或Ile或Nle)-Arg-Pro-HH-R，其中除非另外说明，每个氨基酸残基都是L-构型；X代表D-Leu,D-Nle,D-NVa,D-Ser,D-Abu,D-Phg,D-Phe或α-Aibu；R代表可任选地含有羟基的烷基。
在反应方案中，所有符号均具有与上述定义相同的含义。
日本专利申请公开公报No.51-6926/1996对应于美国专利3997516，其中描述了生产含有胍基的肽的方法，该方法包括用低级烷氧基苯磺酰基或三(低级)烷基-苯磺酰基保护含胍基的肽的胍基。
此外，日本专利申请公开公报No.51-100030/1996对应于美国专利No.3997516，其中描述了生产含有胍基的肽的方法，该方法包括用低级烷氧基苯磺酰基或三(低级)烷基-苯磺酰基保护含胍基的肽的胍基，并在肽缩合反应后，用卤代磺酸或低级烷基磺酸或路易斯酸去除保护基。
为了以商业规模生产肽，各种参数如(1)原料质量，(2)生产成本，(3)施工性能(4)对于操作者的安全性和(5)污染的防治应符合特定的实际可接受水平，而且在实验室水平上效果较好的每种方法在工厂水平上未必也是令人满意的。因此，生产肽的商业方法的设计涉及许多问题，这些问题必须解决以满足各种要求如肽链延伸方式；片段缩合位点的选择；在片段缩合中抑制异构化的方法；选择用于α-位置和侧链功能基的保护基；最终去除所述保护基的方法；纯化终产物肽的方法；以及这一系列步骤的适用性等。
此外，可考虑通常用于肽合成的多种方法和各种反应条件，但通常情况是，由于不能结晶，无法将该方法中所用的许多中间产物充分纯化或者是需要耗时的分级分离过程，因而结果是许多方法在质量和产率的重现性方面不太令人满意。因此，在许多情况下，作为相应生产阶段的关键因素的中间产物的物理特征如可结晶性、稳定性以及溶解性决定了一种方法是否具商业可行性。
就生产具有下列分子式的肽的方法而言(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr(或Phe)-X-Leu(或Ile或Nle)-Arg-Pro-HH-R，在美国专利4008209(对应于日本专利申请公开公报50-059370/1975)公开的方法中，用硝基保护Arg的胍基，因此，用于保护α-氨基的Z基团几乎不能被选择性地还原性去除，以致要用HBr-AcOH除去Z基团。在该方法中，不可避免地产生了大量高催泪性的苄基溴副产物，此外，还必须用大量醚来分离终产物。另外，尽管通常是以氢溴化物的形式回收终产物的，但必须通过例如离子交换树脂除去溴化氢以便在片段缩合时可抑制不利的异构化。此外，尽管在最终产物-上述肽的色谱纯化中要使用梯度洗脱方法，但是浓缩梯度的较低重现性要求有精确的定性检测，结果是不能将稳定生产均一质量的理想产物的操作方法标准化。因此，该方法不适于工业化生产。
此外，在美国专利3997516中的一种反应方案产生了具有下列分子式的肽(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg(MBS)-Pro-NH-C2H5，其中MBS表示对甲氧基苯磺酰基。但是，在该美国专利中，仅描述了反应方案，而未述及其他详细资料如反应条件。
因此，仍需要安全便宜、高产率并具良好重现性的工业上有用的方法以生产具有LHRH激动剂活性的肽或者其盐。
本发明人努力研究了上述问题并成功地建立了通过在水解反应步骤中抑制氨基酸残基的异构化来有效生产中间产物肽(Ⅱ)(下述)的方法，用于结晶肽(Ⅱ)以及对下述工业规模肽(Ⅰ’)进行脱保护的方法；和用于工业规模纯化目标肽(Ⅰ)(下述)的方法。因此，本发明人得到了以安全、高产和良好重现性生产所述肽(Ⅰ)的方法，并完成了本发明。
本发明公开本发明涉及(1)生产下式的肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-R4-Arg-Pro-R6(Ⅰ)(SEQ ID NO:6)其中R1代表His,Tyr,Trp或p-NH-Phe,R2表示Tyr或Phe,R3表示任选地取代的Gly或任选地取代的α-D-氨基酸残基，R4表示Leu,Ile或Nle,R6表示(1)Gly-NH-R7，其中R7表示氢或可任选地用羟基取代的烷基或(2)NH-R8，其中R8表示氢或可任选地用羟基或脲基(-NH-CO-NH2)取代的烷基，或者其盐的方法，该方法包括将下式肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-OH (Ⅱ)(SEQ ID NO:4)其中R1,R2和R3具有与上述定义相同的含义，或者其盐与下式肽H-R4-R5-Pro-R6(Ⅲ)其中R4和R6具有与上述定义相同的含义，R5表示被保护的Arg，或者其盐反应，以产生下式肽
5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-R4-R5-Pro-R6(Ⅰ’)(SEQ ID NO:5)其中R1,R2,R3,R4,R5和R6具有与上述相同的含义，或者其盐，然后，将所得肽(Ⅰ’)进行脱保护基反应；(2)根据(1)的方法，其中R1是His,R2是Tyr,R3是可以用C1-4烷基取代的Gly、D-Leu、D-Trp、D-Val，或者是可用C1-4烷氧基、萘基或2-甲基吲哚基取代的D-Ser、D-Ala，或者可用C7-10芳烷基取代的D-His,R4是Leu,R5是用选自下列的基团保护的Arg:C1-6烷氧基苯磺酰基、三-C1-6烷基苯磺酰基和硝基，R6是下式基团NH-R8’，其中R8’是氢原子或可任选地用羟基取代的烷基；(3)根据(1)的方法，其中R1是His,R2是Tyr,R3是D-Leu,R4是Leu,R5是用C1-6烷氧基苯磺酰基保护的Arg,R6是下式基团NH-R8”，其中R8”是可任选地用羟基取代的C1-3烷基；(4)根据(1)的方法，其中肽(Ⅱ)或者其盐与肽(Ⅲ)或者其盐的反应在大约0-40℃下进行约30-60小时；(5)根据(1)的方法，其中在脱保护基反应中使用了一种酸；(6)根据(5)的方法，其中所述酸是C1-6链烷磺酸；(7)根据(5)的方法，其中将所述酸以肽(Ⅰ’)约5-25倍(重量)的比例使用；(8)回收并纯化上述(1)中所定义的肽(Ⅰ)的方法，该方法包括将含有产生的游离形式油状产物的反应混合物进行柱色谱纯化，所述反应混合物是通过在存在酸的条件下，对肽(Ⅰ’)进行脱保护基反应，然后用碱中和而得到的；(9)下式的肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-OR9(Ⅳ)(SEQ ID NO:3)其中R1是His、Tyr、Trp或p-NH2-Phe,R2是Tyr或Phe,R3是可任选地取代的Gly或可任选地取代的α-D-氨基酸残基，R9是保护基，或者其盐；(10)根据(9)的肽或者其盐，其中R1是His,R2是Tyr,R3是可用C1-4烷基取代的Gly、D-Leu、D-Trp、D-Val，或者是可用C1-4烷氧基、萘基或2-甲基吲哚基取代的D-Ser、D-Ala，或者是可用C7-10芳烷基取代的D-His,R9是C1-6烷基、C6-10芳基或C7-12芳烷基；(11)根据(9)的肽或者其盐，其中R1是His,R2是Tyr,R3是D-Leu,R9是C1-6烷基；(12)用于生产下式肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-OH(Ⅱ)(SEQ ID NO:4)其中R1是His,Tyr,Trp或p-NH2-Phe,R2是Tyr或Phe,R3是可任选地取代的Gly或可任选地取代的α-D-氨基酸残基，或者其盐的方法，该方法包括水解下式肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-OR9(Ⅳ)(SEQ ID NO:3)其中R1,R2和R3具有与上述定义相同的含义，R9是保护基；(13)下式肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-OH (Ⅱ)(SEQ ID NO:4)其中R1是His、Tyr、Trp或p-NH2-Phe,R2是Tyr或Phe,R3是可任选地取代的Gly或可任选地取代的α-D-氨基酸残基，或者其盐的晶体；(14)下式肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-OH (Ⅱ)(SEQ ID NO:4)其中R1是His、Tyr、Trp或p-NH2-Phe,R2是Tyr或Phe,R3是可任选地取代的Gly或可任选地取代的α-D-氨基酸残基，或者其盐的晶体的生产方法，该方法包括对肽(Ⅱ)或者其盐的溶液进行老化(aging)；以及(15)根据(14)的方法，其中在温度为约10-70℃下，对浓度为约0.01-0.05摩尔/升的肽(Ⅱ)或者其盐的溶液进行老化约10-70小时。
附图简述
图1是本发明优选方法的通用流程图。
完成本发明的最佳方式各符号和/或缩写的含义如下R1表示His、Tyr、Trp或p-NH2-Phe，优选His。
R2表示Tyr或Phe，优选Tyr。
作为可任选地取代的α-D-氨基酸残基中的α-D-氨基酸残基，是指D-Leu、D-Ile、D-Nle、D-Val、D-Nva、D-Ser、D-Abu、D-Phe、D-Phg、D-Thr、D-Met、D-Ala、D-Trp或α-Aibu。作为α-D-氨基酸残基，优选D-Leu、D-Val、D-Ser、D-Trp、D-Ala、D-Abu和α-Aibu，更优选D-Leu。
在Gly或α-D-氨基酸残基上的取代基指(1)单-C1-4烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基，(2)二C1-4烷基，例如二甲基、二乙基，(3)三C1-4烷基，例如三甲基、三乙基，(4)C1-4烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基，(5)C6-10芳基，例如苯基、萘基，(6)C7-10芳烷基，例如苄基、苯乙基，(7)吲哚基(8)甲基吲哚基，和(9)苄基咪唑基等。其中优选甲基、二甲基、三甲基、叔丁基、叔丁氧基，2-萘基、吲哚-3-基、2-甲基吲哚基和苄基咪唑-2-基等。更优选三甲基、叔丁基、叔丁氧基、2-萘基、吲哚-3-基、2-甲基吲哚基和苄基咪唑-2-基。
R3的优选实例是指可用C1-4烷基取代的Gly、D-Leu、D-Trp,D-Val，可用C1-4烷氧基、萘基或2-甲基吲哚基取代的D-Ser、D-Ala，或可用C7-10芳烷基取代的D-His。
R3的更优选实例是指Gly、D-Leu、D-Trp、3-甲基-D-Val、D-Ser、叔丁氧基-D-Ala、2-萘基-D-Ala、2-甲基吲哚基-D-Ala、苄基咪唑-2-基-D-Ala(=Nim-苄基-D-His)。
R4表示Leu、Ile或Nle。作为R4,Leu是优选的。
作为被保护Arg中的保护基R5，是指烷氧基苯磺酰基或三烷基苯磺酰基。
优选的烷氧基苯磺酰基是C1-6烷氧基取代的苯磺酰基，例如对甲氧基苯磺酰基、对乙氧基苯磺酰基、对异丙氧基苯磺酰基等，更优选对甲氧基苯磺酰基。
三烷基苯磺酰基中的烷基部分优选是C1-6烷基，可以是相同或不同的，例如甲基、乙基、丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、叔戊基等。三个烷基可存在于苯磺酰基苯环上的任选取代位置上但优选在相对于磺酰基的2-、4-和6-位上。具体地说，通常可以是2,4,6-三甲基苯磺酰基，2,4,6-三乙基苯磺酰基，2,4,6-三丙基苯磺酰基，2,4,6-三异丙基苯磺酰基，2,4,6-三-叔丁基苯磺酰基等。
作为被保护Arg中的保护基R5的优选实例，指C1-6烷氧基苯磺酰基，更优选对甲氧基苯磺酰基、对乙氧基苯磺酰基、对丙氧基苯磺酰基、对异丙氧基苯磺酰基，甚至更优选对甲氧基苯磺酰基。
R7和R8中述及的“可任选地含有羟基的烷基”的烷基是可在任何可取代位置上含有羟基的C1-4烷基如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基，优选乙基。
可任选地含有羟基的烷基的优选实例指羟甲基、2-羟基乙基、3-羟基正丙基、4-羟基正丁基等，更优选2-羟基乙基。
作为R9的保护基，指C1-4烷基例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、正己基等，C7-10芳烷基例如苄基、苯乙基等。R9优选是C1-3烷基，更优选为乙基。
在整个说明书及所附的权利要求书中，根据IUPAC-IUB生物学命名委员会的缩写或本领域常用的俗名来表示氨基酸和肽。若氨基酸存在光学异构体，除非特别说明，均指L化合物。
还应理解，在本发明说明书中有时还使用下列缩写Gly甘氨酸Ala丙氨酸Val缬氨酸Leu亮氨酸Ile异亮氨酸Ser丝氨酸Thr苏氨酸Arg精氨酸Phe苯丙氨酸Tyr酪氨酸His组氨酸Trp色氨酸Pro脯氨酸NLe正亮氨酸NVa正缬氨酸Abu 2-氨基丁酸Phg 苯甘氨酸α-Aibu α-氨基异丁酸P-NH2-Phe对氨基苯丙氨酸Z苄氧基羰基Pd 钯Pd-C 钯碳Et 乙基AcOH 乙酸HF 氟化氢HBr 溴化氢DCHA 二环己胺DMF N,N-二甲基甲酰胺DMA N,N-二甲基乙酰胺THF 四氢呋喃MSA 甲磺酸MBS 对甲氧基苯磺酰基DCC N,N’-二环己基碳二亚胺HONB N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺HOSu N-羟基琥珀酰亚胺HOBt 1-羟基苯并三唑EDA 乙基-3-(3-二甲基氨基)丙基碳二亚胺氢氯化物NP 对硝基苯基HPLC 高效液相色谱生产肽(Ⅰ)的方法如下可用各种合成方法生产式(Ⅰ)的肽或者其盐，可就氨基保护基和羧基保护基、形成酰胺键的方法、脱保护的方法以及在用于纯化相应合成方法中得到的肽的方法进行多种组合。
在这些可选用的合成方法中，图1是优选的实例之一。因此，本发明的生产技术包括(1)用保护基保护Arg8的胍基，(2)合成两种关键的中间产物片段，例如肽(Ⅱ)和肽(Ⅲ)，以及(3)对从Arg8的胍基缩合所述肽后得到的前体肽(Ⅰ’)脱保护以得到目的肽(Ⅰ)或者其盐。
本发明肽的盐指与有机酸例如甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、乙醇酸(glucollic acid)、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、甲磺酸、磷酸等，无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸等形成的盐。
1．生产肽(a)的方法用在“Peptide Gousei-no-Kiso-to-Jikken”(肽合成基础和试验(Basis and Experiment of Peptide Synthesis),Nobuo Izumiya等编，Maruzen Publishers,Japan；或“The Peptide”，第1卷，76-136页，Ebehard Schroder and Klaus Lubke中所述的方法，或与其相似的方法生产结构为Z-R2-R3-OR9的式(a)的肽。
2．从肽(a)生产肽(b)的方法在本发明的生产方法中，通过将二肽(a)与Z-Ser缩合来合成图1所示的肽(b)Z-Ser-R2-R3-OR9。
首先，去除肽(a)的Z基团以得到脱Z的肽(a)(肽(a)减去“Z”)。作为去除反应，优选采用使用催化剂如Pd,Pd-C的催化还原反应以及HBr/AcOH处理。
催化还原反应中的溶剂可以是醇例如甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇、叔丁醇等，醚例如THF、二噁烷等，酰胺例如DMF、DMA等。其中使用DMF、DMA或THF是有利的，因为在此后反应步骤的预备阶段不需进行浓缩。反应温度为约0-50℃，优选约20-40℃。反应时间为约3-15小时，优选约5-10小时。该反应优选在常压下完成。
另外，为了在还原反应中减少二酮哌嗪的出现，优选在催化还原反应前对脱Z的肽(a)进行加质子反应。在加质子反应中，将一种酸加到反应系统中。所说酸指无机酸或有机酸，优选盐酸、硫酸、对甲苯磺酸。其中更优选对甲苯磺酸。酸的量优选为脱Z的肽(a)量的约0.8-1.5倍(mol/mol)，更优选为1-1.1倍(mol/mol)。
将肽(a)与HBr以及不含任何溶剂的饱和乙酸反应来完成HBr/AcOH处理。反应温度为约-10至30℃，优选约10至20℃。反应时间为约10分钟至2小时，优选约30分钟至1小时。通过加入醚、乙酸乙酯等后回收出现的沉淀，然后将其干燥，由此从反应混合物中回收目标肽。
在引入Z-Ser基团的反应中使用了活性酯方法，即将所述肽转变成活性酯，并通过优化反应温度而成功地抑制分子内的脱氢反应。在本发明方法中，可用于引入Z-Ser的活性酯包括可用于肽合成的各种活性酯，例如含有酯化剂的酯，如N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺(HONB)、N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)、N-羟基苯并三唑等。特别优选的是HONB酯。
为了制备Z-Ser-OH的活性酯，在溶剂如醚例如二乙醚、异丙醚、THF、二噁烷等，酰胺例如DMF、DMA等，乙腈，酸酯例如甲酸甲酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯等中，于约-5-20℃，优选约0-5℃下，将Z-Ser-OH与活性酯化剂反应约5-15小时，优选约7-10小时。
脱Z的肽(a)与Z-Ser-OH活性酯的反应是在惰性溶剂中完成的。可以使用在前面步骤的还原反应中所用的溶剂。其中优选酰胺例如DMF、DMA。在较低的温度例如-10至10℃，优选约-5至5℃经约5至20小时，优选约7至12小时完成反应。
3．从肽(b)生产肽(c)的方法通过对肽(b)进行脱Z反应而得到的肽(脱Z的肽(b))与肽Z-Trp-OH进行缩合反应来生产肽(c)Z-Trp-Ser-R2-R3-OR9(SEQ ID NO:1)。
通过使用催化剂如Pd,Pd-C的催化还原反应或通过用HBr/AcOH处理来进行脱Z反应。通过与由肽(a)生产肽(b)的方法中述及的相似途径完成催化还原反应和HBr/AcOH处理。
通过将肽(b)与Z-Trp-OH的活性酯反应而将Z-Trp引入由肽(b)进行脱Z反应而得到的肽中，所述Z-Trp-OH的活性酯是通过在存在缩合剂如DCC、EDA等的条件下，将Z-Trp-OH与活性酯化剂如HONB、HOBt、HOSu反应而预先产生的。另外，在存在活性酯的条件下，通过使用缩合剂将二者反应，可以缩合肽(b)和Z-Trp-OH。
作为活性酯，优选HONB；作为缩合剂，优选DCC。生产Z-Trp-OH活性酯的方法与上述方法相似。
存在缩合剂的条件下，将肽(b)和Z-Trp-OH活性酯的反应在约0-20℃，优选约5-10℃进行约5-20小时，优选约7-10小时。
4．从肽(c)和肽(d)生产肽(e)的方法可通过Hatanaka等[Takeda Research Report,35,16(1976)；生物化学和生物物理研究通讯(Biochemical and Biophysical ResearchCommunications,60,1345(1974)]的方法，或与上述相似的方法来生产肽(d):Z-5-氧代-Pro-R1-OH。
通过将肽(c)与肽(d)缩合来生产肽(e)Z-5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-OR9(SEQ ID NO:2)。在缩合反应中，必须注意His残基的异构化。可以使用用于肽片段缩合的任何已知的抗异构化方法。抑制这种异构化的常用方法中除使用缩合剂外，还使用抗异构化试剂。缩合剂例如可以是DCC或EDA，抗异构化试剂例如可以是HONB,HOSu,HOBt,(HOSu)等。可以以任何需要的组合方式来使用这两种试剂。常用的组合是DCC-HONB,DCC-HOSu,DCC-HOBt和EDA-HOSu等。特别优选DCC-HONB。尽管反应温度是控制异构化的主要因素，但是优选的反应温度是约0-20℃，优选约5-15℃，时间为30分钟至100小时，优选约50-80小时。在反应中，使用酰胺例如DMF、DMA等，醚例如2-甲基吡咯烷酮、THF、二噁烷等作为溶剂。
5．从肽(e)生产肽(Ⅳ)的方法从肽(e)Z-5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-OR9(SEQ ID NO:2)去除Z，得到肽(Ⅳ)。通过例如使用催化剂(如Pd,Pd-C)进行的催化还原反应等，或者通过HBr/AcOH处理等方法完成脱Z反应。
在催化还原反应中，所用的溶剂是酰胺例如DMF、DMA等，醚例如2-甲基吡咯烷酮、THF、二噁烷等，或者叔丁醇，温度为约0至50℃，优选约25至40℃，反应时间为约1至10小时，优选约3至6小时。
HBr/AcOH处理通过在从肽(a)制备肽(b)的反应中提到的类似方法完成。
6．从肽(Ⅳ)生产肽(Ⅱ)的方法通过水解肽(Ⅳ)，并在需要时中和反应混合物可产生肽(Ⅱ)。该水解反应优选在较低的温度下，于水和醇的混合物中完成。可使用的醇包括甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇等，在水-醇混合物中，醇的比例为约1-30％(v/v)，优选约1-10％(v/v)。在相同的时间内，醇的比例越大，水解反应的速度就越低，同时，His2和Ser4异构化的比率显著增加(当R1是His时)。甚至通过在纯化中所用的柱色谱系统也不能有效除去这些异构体，因此，降低了终产物肽(Ⅰ)的质量。
反应溶剂可含有上游步骤中的溶剂，即DMF、THF等，但其比例不应高到会显著地延缓反应，即优选约1-20％(v/v)，优选约5-10％(v/v)。
存在碱的条件下进行水解。所用的碱是氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化钡。His在2-位、Ser在4-位的水解和异构化反应速度取决于碱的用量和其在溶液中的浓度。碱用量优选为肽(Ⅳ)的约2.5至2倍(mol/mol)，优选约3-4倍(mol/mol)。具体地说，反应开始时碱在反应系统中的浓度优选为约0.05-0.3摩尔/升，最佳为约0.1-0.2摩尔/升。应将反应温度保持在约-10至10℃，优选约-5至5℃，直到后处理即中和结束。为了保持反应温度的恒定，优选搅拌反应系统。该反应通常在1.5至3小时内完成。为了使不利的异构化降至最低限度，优选在反应后立即进行中和过程。该中和反应中使用酸(例如盐酸、硫酸等)在-5至5℃，优选-2至2℃下进行。
将肽(Ⅱ)通过下列方法结晶因此，将在(Ⅳ)水解后，对反应混合物进行中和而形成的凝胶加热使其溶解，然后使其逐渐冷却，以结晶出肽(Ⅱ)。通过加热的溶解是在搅拌下，于约60至80℃，优选约65至75℃进行的。在冷却期中，通过加入晶种来促进结晶。至于晶种加入的时间，则可以在该期的任何时间，只要此时加入的晶种不会溶于溶液中并且热溶液不会再产生凝胶即可。优选的时期为溶液温度在约35至45℃时。在15至30℃的温度下，经约1至3小时完成逐渐冷却。
为了完成结晶，优选对产物进行老化处理。为得到肽(Ⅱ)晶体(具有优秀的特性，而且高产)，老化时间为约30至150小时，优选约60至100小时。老化温度优选为约10至35℃，更优选为约10至30℃，甚至更优选是约15至25℃。
在老化开始时，肽(Ⅱ)在溶液中的浓度为约0.01-0.05摩尔/升，优选约0.02-0.04摩尔/升。
在老化过程中，优选间断地搅拌含肽(Ⅱ)的溶液，以便缩短老化时间和/或得到高产率的晶体。因此，优选开始反应后5小时，以约30-35rpm搅拌溶液约1分钟。此后，大约每5小时，以约30-35rpm搅拌溶液约1分钟，直到老化过程完成2/3。此后，大约每0.5小时，以约30-35rpm搅拌溶液约1分钟直到老化完成。
具体地说，例如老化时间是60小时，在开始反应后5小时，每5小时以33rpm搅拌溶液约1分钟直到40小时，然后，从老化开始后40小时，每隔0.5小时以33rpm搅拌溶液约1分钟直到老化的最后步骤。
通过上述肽(Ⅱ)的结晶方法，完全避免了去除影响终产物质量的杂质的耗时操作，所述杂质例如在肽(c)的片段缩合反应至肽(e)，肽(Ⅳ)到肽(Ⅱ)的水解反应中形成的副产物His异构体，以及在肽(Ⅳ)到肽(Ⅱ)的水解反应中形成的副产物Ser异构体，也可避免分离肽(Ⅳ)的过程。
可将肽(Ⅱ)以碱金属例如锂、钠、钾、钙、钡等的盐形式或有机碱例如三乙胺、环己胺、二环己基胺的盐形式用于下步反应例如结晶中，也可用已知方法例如结晶分离或以溶液形式使用。
7．肽(Ⅲ)的制备可用Fujino等，生物化学和生物物理学文献，154,488(1973)；化学和制药通报，23,229(1975)的方法或用于肽合成的任何其他已知方法生产肽(Ⅲ)或者其盐。
可将肽(Ⅲ)以盐酸、氢溴酸、硫酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸或甲磺酸盐的形式用于下步反应，也可用已知的分离方法例如结晶法分离，或以溶液形式使用。但在所述情况下，形成酰胺键的反应之前应用碱中和或用离子交换树脂处理来除去碱(酸)。
8．从肽(Ⅱ)和肽(Ⅲ)生产肽(Ⅰ’)在不影响反应的溶剂中，缩合肽(Ⅱ)与肽(Ⅲ)，得到肽(Ⅰ’)。可使用的溶剂包括N,N-二甲基甲酰胺(DMF),N,N-二甲基乙酰胺(DMA),N-甲基吡咯烷酮，二氯甲烷，二氯乙烷，四氢呋喃，二噁烷等，并且可将这些溶剂以适宜的混合物使用。优选的是N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二-甲基乙酰胺。
肽(Ⅲ)相对肽(Ⅱ)的比例为约0.5至2摩尔当量，优选约1至1.5摩尔当量。
反应温度通常为约0至40℃，优选约5至25℃。温度范围对于抑制R3的异构化是很重要的。反应时间通常为约30至60小时，优选约40至50小时。
在肽(c)与肽(d)的缩合反应中，必须要注意R3的异构化，但可以使用用于肽片段缩合的任何已知的抗异构化方法。抑制该异构化(外消旋)的通用方法包括除缩合剂外，还使用抗异构化试剂。缩合剂可以是例如DCC或EDA，抗异构化试剂可以是例如HONB,HOSu,HOBt等。可将这两种试剂以任何需要的组合使用。典型的组合是DCC-HONB,DCC-HOSu,DCC-HOBt和EDA-HOSu等。特别优选DCC-HONB。
以肽(Ⅱ)1-3倍(摩尔/摩尔)的比例，优选1-2倍(摩尔/摩尔)的比例使用缩合剂。抗异构化剂的用量为肽(Ⅱ)的1-4倍(摩尔/摩尔)，优选1.5-2.5倍(摩尔/摩尔)。肽(Ⅱ)的起始浓度为约0.05-0.2摩尔/升，优选0.08-1.5摩尔/升。以肽(Ⅱ)0.8-2倍(摩尔/摩尔)，优选1-1.3倍(摩尔/摩尔)的量使用肽(Ⅲ)。
9．从肽(Ⅰ’)生产肽(Ⅰ)在不影响反应的溶剂中，或不存在溶剂的条件下，用酸完成从肽(Ⅰ’)的Arg残基除去保护基的脱保护反应。不影响该脱保护反应的溶剂包括但不限于二氯甲烷、二氯乙烷，二噁烷和三氟乙酸，并且可将这些溶剂以适宜的混合物使用。
可用于该脱保护反应的酸包括但不限于C1-6链烷磺酸例如甲磺酸、乙磺酸等，卤代磺酸例如氯磺酸、氟磺酸、溴磺酸等，以及路易斯酸例如三(三氟乙酸)硼等。其中优选C1-3链烷磺酸，特别优选甲磺酸。
用于该脱保护反应中的酸的比例为肽(Ⅰ’)重量的约5-25(w/w)倍，优选约10-20(w/w)倍。
脱保护反应的温度通常为约0-20℃，优选约5-15℃。
脱保护反应的时间通常为约2-8小时，优选约4-6小时。
优选在不存在溶剂的条件下，用甲磺酸完成所述脱保护反应。
在完成该脱保护反应的过程中，可加入适宜量的基团清除剂(例如酚、苯甲醚等)和/或抗氧化剂(例如巯基乙酸)。以上述反应产物计，它们的用量均为约0.8-2(w/w)倍，优选约0.05-2(w/w)倍。
当用C1-6链烷磺酸完成脱保护反应时，通过例如下述方法，可从反应混合物中除去链烷磺酸，所述方法包括用醚洗涤反应混合物，将洗涤物溶解在水中，并在阴离子交换树脂柱上对所得溶液过柱。但是，将该方法用于商业规模的生产时，从所需硬件、可加工性和安全性来看，由于链烷磺酸在醚中的溶解度很低，使用大量醚带来的危险、将大量链烷磺酸与水混合并在离子交换树脂柱上对溶液过柱时突然释放的热所带来的危险，以及由于释放的热使目的肽分解，导致该方法不太适宜。
作为不存在上述问题的商业上有利的方法，有一种从反应混合物中通过直接用碱性含水介质中和而去除链烷磺酸的技术。但是，在涉及中和大量强酸的所述中和过程中，尽管进行大规模处理是可行的，但还会释放大量中和热。除必须处理大量中和溶液所产生的问题外，由于在碱性含水介质中，目的肽的肽键裂解和氨基酸异构化而对终产物质量的不利影响是不可避免的，以致在迄今为止所涉及的肽生产中，均认为该方法不实用。
但是，本发明人研究了用于吸收在该中和反应中所释放的中和热的方法以及该方法的程序，并努力优化该反应条件。结果，他们令人惊奇地发现，可以以良好的产率得到质量合格的目的化合物，并确定了用于所述中和的规模化生产方法。因此，根据本发明，在保持的低温下，将反应混合物滴加到冷的无机或有机碱含水溶液以中和链烷磺酸。在所述操作方式中，可以成功地抑制目的肽中组成性氨基酸残基的异构化，而且可以以固体或油状的形式得到所述目的化合物。
可用于该目的的无机碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙等，可以使用的有机碱包括吡啶，三乙胺等，碳酸钾是优选的。当用碳酸盐作为所述碱时，由于二氧化碳的释放，会有很多的泡沫，但在预先加入适宜比例的有机溶剂如乙酸乙酯或苯即可控制这种泡沫。所述无机或有机碱的用量只要足以中和链烷磺酸即可，但优选相当于链烷磺酸的约1-1.3当量。
为了抑制氨基酸的异构化和肽链的水解裂解并避免所述无机或有机碱含水溶液的冷冻，优选将中和系统的温度控制在约-15至15℃，优选约-5至5℃。
中和后，通常从中和系统中以固体或油状分离出目的化合物，因此，可用适宜的已知方法例如过滤或滗出来回收所述化合物。
可用本身已知的方法从中和系统中分离出目的化合物。在相对少量的目的化合物的纯化中，液相色谱是一种可选用的方法。为了纯化大量的目的化合物，根据具体化合物的离子性质、极性和其他溶液特性、芳香性和分子量，可将数种已知柱色谱结合使用。
从工业化的角度看，优选的分离纯化技术包括正确组合使用了下列多孔(hyperporous)树脂例如Amberlite XAD-2(Rohm&Haas Co.,USA)或Diaion HP-20(Mitsubishi Chemical,Japan)、羧甲基纤维素(CMC,CM-23(whatman,USA))、离子交换树脂例如Amberlite CG-50(Rohm & Haas Co.,USA)和分子筛树脂例如Sephadex LH-20(Pharmacia Fine Chemicals,Sweden)的柱色谱系统。该方法程序上简单安全，并在产率和质量上均可提供良好的重现性，另外，还很经济。
一种举证性的柱色谱系统组合可以是连续组合的Diaion HP-20(上述)(第一次分离)→CM-23(上述)→Diaion HP-20(第二次分离)→Sephadex LH-20(上述)(第三次分离)。当将含肽的溶液浓缩时，会出现大量泡沫，并需使用冻干机，或加入防泡剂。但是，所述柱色谱组合是一种有利的方法，即可免除对在各柱色谱步骤中得到的有效级分特别是对在CM-23柱色谱中得到的含有效级分的大量含水溶液的浓缩步骤。因此，就操作性和经济性以及高质量而言，上述色谱组合是一种工业上有用的方法，所述的操作性和经济性以及高质量取决于抑制因浓缩而引起的肽降解。
就主要目的而言，Diaion HP-20(第一次分离)柱色谱必须在脱保护反应后从反应混合物中分离的含粗目的化合物的固体或油中去除无机杂质和在脱保护步骤中加入的基团清除剂以及其反应产物，任选地加入的抗氧化剂，少量产生的目的化合物的异构体。此外，就DiaionHP-20(第一次分离)柱色谱而言，相对于目的化合物，以约20-40(v/w)倍，优选约25-35倍的比例使用Diaion HP-20。通常用丙酮、甲醇或乙醇的含水溶液进行目的化合物和杂质的洗脱。在下述示例性的描述中，使用的是乙醇。首先，将含目的化合物的水溶液过Diaion HP-20柱，用计划量的乙酸钠/水(已用乙酸将pH预调至5-7)、乙酸铵/水和10％(v/v)乙醇连续灌柱以洗脱有关的化合物。然后，用15％(v/v)乙醇和35％(v/v)乙醇洗脱目的化合物并收集程序级分。
CM-23柱色谱的主要目的是除去目的化合物的非离子化等同物(ionically non-equivalent)副产物。相对于目的化合物，通常以35至60倍(v/v)，优选40-55倍(v/w)的比例使用CM-23柱。在蒸馏掉来自DiaionHP-20(第一次分离)的程序洗出液的乙醇后，将溶液过CM-23柱并先用水清洗柱。然后用0.015M乙酸铵/水和0.03M乙酸铵/水连续洗脱目的化合物并收集程序级分。
Diaion HP-20(第二次分离)柱色谱的主要目的是除去洗脱CM-23柱中所用的乙酸铵并浓缩大量的洗出液。可将CM-23柱色谱后的程序洗出液(会在浓缩时产生大量泡沫的大量含水溶液)直接过Diaion HP-20(第二次分离)柱，而无需先浓缩。将所述Diaion HP-20(第二次分离)柱用乙酸钠/水(已用乙酸将pH预调至5-7)、乙酸铵/水和水以所述顺序连续灌柱。然后，用15％(v/v)乙醇和35％(v/v)乙醇洗脱目的化合物并收集程序级分。将由此从Diaion HP-20(第二次分离)柱得到的程序洗出液(已经被浓缩至来自CM-23柱的程序洗出液体积的约1/3)进行减压浓缩，将剩余物过Sephadex LH-20柱。
Sephadex LH-20柱色谱是所述连续柱色谱的最后步骤，其目的是除去发热物质、无机物以及其他痕量杂质。相对于目的化合物，以约20-60倍(v/w)，优选约30-50倍(v/w)的比例使用Sephadex LH-20。用0.005N乙酸/水展开LH-20柱，并收集程序洗出液。如果需要的话，将所述程序洗出液浓缩、用活性炭处理，进行膜过滤并将其冻干以得到作为终产物的目的化合物(乙酸盐)。
由此得到的肽(Ⅰ)具有LHRL激动剂活性，并可将其以与例如美国专利4008209中所述相似的方式使用。
实施例下列实施例仅仅是为了更详细地描述本发明，而不对本发明的范围构成限制。参考实施例1．Z-Tyr-D-Leu-OEt的生产在0-10℃，约300ml乙酸乙酯中，用1N硫酸对Z-TyrOH·DCHA(58.8g)脱盐。分离有机层并在无水硫酸钠(Na2SO4)上干燥。过滤除去Na2SO4后，将24.3g D-Leu-OEt,12.6g三乙胺和26.8gDCC加到滤液中，在约5℃搅拌混合物约2小时，然后在10℃再搅拌5小时。向所述反应混合物中加入60ml 1N盐酸并过滤混合物。放置滤液并用NaCl水溶液和NaHCO3水溶液洗涤有机层，蒸发掉乙酸乙酯。向剩余物中加入异丙醚，通过过滤收集所得的晶体物，将其在乙酸乙酯-异丙醚中再结晶并干燥。产率41.6g(77％)m.p.116-118℃旋光度[α]D25=-3.4°(c=1,DMF)参考实施例2．Z-Ser-Tyr-D-Leu-OEt的生产在约300ml DMF中溶解40.5g Z-Tyr-D-Leu-OEt和16.9g对甲苯磺酸一水合物，在20-35℃，约5克5％Pd-C存在的条件下，完成氢化反应。反应完成后，过滤除去催化剂。
分别将23.3g Z-Ser-OH和19.2g HONB溶解在300ml DMF中，然后加入22.1g DCC，在0-5℃，搅拌混合物约7小时。向该混合物中加入上述还原反应混合物。将混合物冷却到约0℃，滴加9克三乙胺。然后在-5至5℃搅拌混合物约10小时，然后在室温下放置过夜。
过滤除去已形成的晶体，然后减压浓缩滤液。将剩余物溶解在乙酸乙酯中。用1N盐酸、氯化钠水溶液和碳酸氢钠水溶液以所述顺序洗涤所述乙酸乙酯溶液，然后在Na2SO4上干燥。过滤除去硫酸钠后，减压浓缩滤液并用异丙醚稀释。过滤收集所得粗晶体物，在乙酸乙酯中再结晶并干燥。产率37.6g(77％)m.p.134-136℃旋光度[α]D25=-4.8°(c=1,DMF)参考实施例3．Z-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-OEt(SEQ ID NO:7)(ETSTLE)的生产在300ml DMF中溶解36.2g Z-Ser-Tyr-D-Leu-OEt，在25-35℃，约5克5％Pd-C存在的条件下，完成氢化反应。反应完成后，过滤除去催化剂。
分别将21.4g Z-Trp-OH和11.9g HONB溶解在300ml DMF中，然后加入13.7g DCC。在5-10℃，搅拌混合物约7小时。向该混合物中加入上述还原反应混合物。在10-15℃下，搅拌混合物约7小时，然后在室温下放置过夜。
过滤除去形成的晶体，然后减压浓缩滤液。将剩余物溶解在乙酸乙酯中。用1N盐酸、氯化钠水溶液和碳酸氢钠水溶液以所述顺序洗涤所述乙酸乙酯溶液，然后在硫酸钠上干燥。过滤除去硫酸钠后，减压浓缩滤液并将异丙醚加到剩余物中。过滤收集所得粗晶体物，从乙酸乙酯-异丙醚中再结晶并干燥。产率41.3g(85％)旋光度[α]D25=-10.0°(c=1,EtOH)参考实施例4．Z-5-氧代-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-OEt(SEQ IDNO:8)的生产在约350ml DMF中溶解55.7g Z-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-OEt(ZTSTLE)，在约30℃，约12克5％Pd-C(湿)存在的条件下，完成氢化反应。反应完成后，过滤除去催化剂。向由此得到的滤液中加入32.6g Z-5-氧代-Pro-His-OH·1.5 H2O和27.4g HONB，冷却到2-8℃后，加入20.5g DCC。在约8℃，搅拌混合物约60小时。在约40℃再搅拌该反应混合物约2小时，然后过滤，减压浓缩滤液。在约60℃下，向剩余物中加入约1L乙酸乙酯。在20-25℃下搅拌混合物。过滤收集所得粗晶体，将其悬浮在DMF(约230ml)-乙酸乙酯(约530ml)中，搅拌并过滤回收。对由此得到的纯化晶体(ZPGLE)无需进行干燥，而直接用于下步还原反应。参考实施例5．5-氧代-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-OEt(SEQ IDNO:9)的合成将参考实施例4中得到的ZPGLE溶解在约900ml DMF中，在约30℃，约15克5％Pd-C(湿的)存在的条件下，完成氢化反应。反应完成后，过滤除去催化剂并将滤液浓缩至约180ml，然后进行下步水解反应。参考实施例6．Z-Leu-ONP的生产将125克Z-Leu-OH和65.5g对硝基苯酚溶解在1.2L乙酸乙酯中，然后在0-5℃滴加107克DCC的乙酸乙酯溶液，并在10-25℃搅拌混合物。反应完成后，过滤除去晶体，减压浓缩滤液。将剩余物溶解在乙醇中，过滤收集形成的晶体并真空干燥。产率142g(78％)m.p.92-94℃旋光度[α]D25=-42.5°(c=1,CH3OH)参考实施例7．Z-Arg(MBS)-Pro-NHC2H5的生产将34.1g Z-Arg(MBS)-OH·DCHA悬浮在400ml乙酸乙酯中，然后在0-10℃加入57ml 1N硫酸。搅拌混合物并静置，用硫酸钠水溶液洗涤有机层，并减压浓缩。另一方面，将15.7g Z-Pro-NHC2H5溶解在30ml N,N-二甲基乙酰胺中，在2.3g 5％Pd-C存在的条件下，完成氢化反应。反应完成后，过滤除去催化剂。在滤液中溶解含Z-Arg(MBS)-OH的浓缩剩余物和9.4g HONB。向该溶液中滴加12.8g DCC的N,N-二甲基乙酰胺溶液，然后在10-20℃搅拌混合物。反应完成后，过滤除去形成的晶体并减压浓缩滤液。将剩余物溶解在450ml乙酸乙酯中，并用1N盐酸，氯化钠水溶液和碳酸氢钠水溶液以所述顺连续洗涤。减压蒸发去除乙酸乙酯，然后用乙酸乙酯-乙醇处理剩余物。从乙醇中再结晶所得到的粗晶体物并真空干燥。产率22.4g(72％)旋光度[α]D25=-33.0°(c=1,CH3OH)参考实施例8．Z-Leu-Arg(MBS)-Pro-NHC2H5(ZLAP)的生产将20.3g Z-Arg(MBS)-Pro-NHC2H5和6.4g对甲苯磺酸一水合物溶解在160ml DMF中，并在存在2.3g 5％Pd-C的条件下完成氢化反应。反应完成后，过滤除去催化剂，将3.4g三乙胺加到冰冷的滤液中。向所述混合物中加入13.6g Z-Leu-ONP，并在10-15℃搅拌混合物。反应完成后，减压浓缩反应混合物并将剩余物溶解在120ml乙酸乙酯中。用稀释的盐酸、碳酸氢钠水溶液和水连续洗涤该溶液。然后蒸发去除乙酸乙酯并将剩余物过硅胶柱。用乙酸乙酯-异丙醚(1∶1)和乙酸乙酯-甲醇(3∶2)连续展开柱，收集目的级分并将其减压浓缩。将剩余物溶解在乙酸乙酯中，用异丙醚处理并过滤回收所得沉淀，真空下干燥。产率22.2g(92％)旋光度[α]D25=-39.0°(c=1,CH3CH2OH)实施例1．5-氧代-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-OH(SEQ IDNO:10)(PGLOH)的生产在-3至0℃，向在参考实施例5中得到的浓缩物中滴加在1L水中的8.3g氢氧化钠溶液。在约0℃，搅拌混合物约2小时。确定反应完成后，在约0℃，通过滴加210ml 1N盐酸来中和反应混合物。加热溶解形成的晶体，并在加热时加入1.5g活性炭。搅拌后，过滤除去活性炭。使滤液冷却并在15-25℃搅拌35小时。过滤收集所得晶体，在约60℃下真空干燥。产率39.99(59.2％，以参考实施例3中所得的ZTSTLE计)旋光度[α]D25=-21.5°(c=0.5,DMF)(1)同时，在使用上述溶剂系统的反应进行1小时后，His 2-位和Ser在4-位上令人讨厌的异构化在反应温度为20℃时分别为1.3％和4.8％，而在反应温度为0℃时分别为0.2％和0.44％。(2)尽管本发明的结晶过程可有效地除去各种结构相关的化合物，但在下文列出的所述除去效果的几个实例主要集中在His-异构化和Ser-异构化产物上，这两种异构化产生现最显著相关的化合物。[表1]反应混合物 晶体[D-His2]化合物0.88％★)0.18％[D-Ser4]化合物0.44％ 0.08％★)包括在用于从肽(c)生产肽(e)之方法的片段缩合步骤中产生的[D-His2]异构体副产物。实施例2．5-氧代-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-OH(SEQ ID NO:10)(PGLOH)晶体的生产在-3至0℃，向在参考实施例5中得到的浓缩物中滴加在1L水中的8.3g氢氧化钠溶液，在约0℃，搅拌混合物约2小时。确定反应完成后，在约0℃，通过滴加210ml 1N盐酸来中和反应混合物。将形成的晶体通过加热溶解，并在加热时加入1.5g活性炭。搅拌后，过滤除去活性炭。使滤液在18-22℃老化80小时。过滤收集所得晶体，在约60℃下真空干燥。产率42.9g(63.6％，以参考实施例3中所得的ZTSTLE计)旋光度[α]D25=-21.8°(c=0.5,DMF)实施例3．5-氧代-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg(MBS)-Pro-NHC2H5(SEQ ID NO:11)(简称MBSTAP)的生产将35.6g ZLAP溶解在350ml DMF中，存在7.3g 5％Pd-C的条件下完成氢化反应。反应完成后，过滤除去催化剂，并将36.9g PGLOH和16.2g HONB溶解在滤液中，然后在-4至8℃滴加14克DCC的DMF溶液。在约8℃，搅拌混合物15小时，在约20℃再搅拌约30小时。反应完成后，过滤除去所得晶体，减压浓缩滤液并将其溶解在约200ml乙醇中。然后加入2.3L乙酸乙酯，过滤回收所得晶体。将所述粗产物溶解在约220ml乙醇中，并加入约900ml乙酸乙酯。过滤回收所得固体并用二氯甲烷洗涤以得到作为湿产物的MBSTAP。无需将所述湿产物干燥，而将其直接用于下步去除MBS的反应。HPLC分析表明MBSTAP的产率为51.5g(82％)。实施例4．5-氧代-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHC2H5·CH3COOOH(SEQ ID NO:12)(简称TAP-144)的生产(1)MBS的去除将60克苯酚溶解在800克甲磺酸中，在冷却下将在实施例1中所得的湿MBSTAP(相当于51.1g MBSTAP)加到所述溶液中。在约10℃，搅拌混合物5小时。
分别将690克碳酸钾溶解在2升水中，并与约400ml乙酸乙酯混合。将该混合物冷却到-2至0℃，以得到碱溶液。在约0℃，向所述碱溶液中滴加上述去除MBS的反应混合物。滴加完成后，放置混合物并将缓冲液(pH4)(约3升0.1N乙酸钠和约58ml乙酸)加到上层(油-乙酸乙酯层)以溶解油。放置所述混合物并用乙酸乙酯洗涤水层。
用20％(w/w)碳酸钾溶液调节经洗涤的水层的pH到约6，除去分离出的油以得到TAP-144水溶液。
(2)粗TAP-144的纯化将上述TAP-144水溶液过DIAIONTMHP-20柱(约1.2升)。用约2.5L 0.3M乙酸钠/水(已用乙酸将pH调到6.2)，约3L 0.025M乙酸铵/水，和4.3L 10％乙醇连续洗涤柱。此后，使9.5L 15％乙醇和9.5L 35％乙醇以所述顺序通过，然后收集目的级分并减压浓缩以除去乙醇(S1-TAP)。
将所述S1-TAP过CMTM-23柱(约1.7L)，用2升水洗涤柱后，用15升0.015M乙酸铵/水和15升0.03M乙酸铵/水连续洗脱目的化合物，收集目的级分(S2-TAP)。
将上述所得S2-TAP过DIAIONTMHP-20柱(约0.7升)。用约2.1升0.3M乙酸钠(已用乙酸将pH调到6.2)，约3.2升0.01M乙酸铵/水，和0.7升水连续洗涤柱后，用4.3升15％乙醇和5.4升35％乙醇以所述顺序洗脱。收集目的级分并减压浓缩至约200ml。将剩余物过SephadexTMLH-20柱(约10升)，用0.005N乙酸/水洗脱。收集目的级分并用活性炭处理，超滤，浓缩并冻干以得到31.8g(67.6％)TAP-144。含量99.8g(HPLC，内标准)旋光度[α]D20=-39.0°(c=1,1％乙酸)吸收值57(281nm),55(289nm)工业实用性本发明的方法有许多优点即ⅰ)使水解步骤中His2和Ser4的异构化降至最低水平，ⅱ)可以合格的晶体形式得到肽(Ⅱ)，而且可成功地去除缩合和水解中产生的异构体副产物，ⅲ)在用链烷磺酸处理除去烷氧基苯磺酰基后，可以以商业规模分离产物化合物，ⅳ)可将终产物以商业规模纯化，ⅴ)可以良好产率得到中间产物肽(b)，同时可以控制副产物的形成，ⅵ)可以免去中间产物肽(e)和肽(Ⅰ’)的干燥和中间产物肽(Ⅳ)的分离步骤。因此，提供了一种用于生产具有LHRH激动剂活性的肽的工业方法。序列表SEQ ID NO:1长度4个氨基酸类型氨基酸拓扑结构线性分子类型肽特征位置1其他特征Xaa=Z-Trp位置3其他特征Xaa=Tyr或Phe位置4其他特征Xaa=任选地取代的Gly-OR(R=保护基)或任选地取代的α-D-氨基酸残基-OR(R=保护基)序列Xaa-Ser-Xaa-Xaa1SEQ ID NO:2长度6个氨基酸类型氨基酸拓扑结构线性分子类型肽特征位置1其他特征Xaa=Z-5-氧代-Pro位置2其他特征Xaa=His,Tyr,Trp或p-NH2-Phe位置5
其他特征Xaa=Tyr或Phe位置6其他特征Xaa=任选地取代的Gly-OR(R=保护基)或任选地取代的α-D-氨基酸残基-OR(R=保护基)序列Xaa-Xaa-Trp-Ser-Xaa-Xaa1 5SEQ ID NO:3长度6个氨基酸类型氨基酸拓扑结构线性分子类型肽特征位置1其他特征Xaa=5-氧代-Pro位置2其他特征Xaa=His,Tyr,Trp或p-NH2-Phe位置5其他特征Xaa=Tyr或Phe位置6其他特征Xaa=任选地取代的Gly-OR(R=保护基)或任选地取代的α-D-氨基酸残基-OR(R=保护基)序列Xaa-Xaa-Trp-Ser-Xaa-Xaa1 5SEQ ID NO:4长度6个氨基酸类型氨基酸拓扑结构线性分子类型肽特征位置1其他特征Xaa=5-氧代-Pro位置2其他特征Xaa=His,Tyr,Trp或p-NH2-Phe位置5其他特征Xaa=Tyr或Phe位置6其他特征Xaa=任选地取代的Gly或任选地取代的α-D-氨基酸残基序列Xaa-Xaa-Trp-Ser-Xaa-Xaa1 5SEQ ID NO:5长度9个氨基酸类型氨基酸拓扑结构线性分子类型肽特征位置1其他特征Xaa=5-氧代-Pro位置2其他特征Xaa=His,Tyr,Trp或p-NH2-Phe位置5其他特征Xaa=Tyr或Phe
位置6其他特征Xaa=任选地取代的Gly或任选地取代的α-D-氨基酸残基位置7其他特征Xaa=Leu,Ile,Nle位置8其他特征Xaa=已被保护的Arg位置9其他特征Xaa=Pro-NHR(R=(1)Gly-NH-R’，其中R’表示氢原子或可任选地用羟基取代的烷基或(2)NH-R”，其中R”表示氢原子，或可任选地用羟基或脲基(-NH-CO-NH2)取代的烷基序列Xaa-Xaa-Trp-Ser-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa1 5SEQ ID NO:6长度9个氨基酸类型氨基酸拓扑结构线性分子类型肽特征位置1其他特征Xaa=5-氧代-Pro位置2其他特征Xaa=His,Tyr,Trp或p-NH2-Phe位置3其他特征Xaa=Tyr或Phe位置4其他特征Xaa=选择性取代的Gly或选择性取代的α-D-氨基酸残基位置7其他特征Xaa=Leu,Ile,Nle位置9其他特征Xaa=Pro-NHR(R=(1)Gly-NH-R’，其中R’表示氢原子或可任选地用羟基取代的烷基或(2)NH-R”，其中R”表示氢原子，或可任选地用羟基或脲基(-NH-CO-NH2)取代的烷基序列Xaa-Xaa-Trp-Ser-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Xaa1 5SEQ ID NO:7长度4个氨基酸类型氨基酸拓扑结构线性分子类型肽特征位置1其他特征Xaa=Z-Trp位置4其他特征Xaa=D-Leu-O-C2H5序列Xaa-Ser-Tyr-Xaa1SEQ ID NO:8长度6个氨基酸类型氨基酸拓扑结构线性分子类型肽特征位置1其他特征Xaa=Z-5-氧代-Pro位置6其他特征Xaa=D-Leu-O-C2H5序列Xaa-His-Trp-Ser-Tyr-Xaa1 5SEQ ID NO:9长度6个氨基酸类型氨基酸拓扑结构线性分子类型肽特征位置1其他特征Xaa=5-氧代-Pro位置6其他特征Xaa=D-Leu-O-C2H5序列Xaa-His-Trp-Ser-Tyr-Xaa1 5SEQ ID NO:10长度6个氨基酸类型氨基酸拓扑结构线性分子类型肽特征位置1
其他特征Xaa=5-氧代-Pro序列Xaa-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu1 5SEQ ID NO:11长度9个氨基酸类型氨基酸拓扑结构线性分子类型肽特征位置1其他特征Xaa=5-氧代-Pro位置8其他特征Xaa=已被对甲氧基苯磺酰基保护的Arg位置9其他特征Xaa=Pro-NH-C2H5序列Xaa-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Xaa-Xaa1 5SEQ ID NO:12长度9个氨基酸类型氨基酸拓扑结构线性分子类型肽特征位置1其他特征Xaa=5-氧代-Pro位置9
其他特征Xaa=Pro-NH-C2H5序列Xaa-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Xaa1 权利要求
1．生产具有下式肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-R4-Arg-Pro-R6(Ⅰ)其中R1表示His、Tyr、Trp或p-NH2-Phe,R2表示Tyr或Phe，R3表示任选地取代的Gly或任选地取代的α-D-氨基酸残基，R4表示Leu、Ile或Nle,R6表示(1)Gly-NH-R7，其中R7表示氢或可任选地用羟基取代的烷基或(2)NH-R8，其中R8表示氢或可任选地用羟基或脲基(-NH-CO-NH2)取代的烷基，或者其盐的方法，该方法包括将下式肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-OH(Ⅱ)其中R1,R2和R3具有与上述定义相同的含义，或者其盐与下式肽H-R4-R5-Pro-R6(Ⅲ)其中R4和R6具有与上述相同的含义，R5表示被保护的Arg，或者其盐反应，以产生下式肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-R4-R5-Pro-R6(Ⅰ’)其中R1,R2,R3,R4,R5和R6具有与上述相同的含义，或者其盐，然后将所得肽(Ⅰ’)进行脱保护基反应。
2．根据权利要求1的方法，其中R1是His,R2是Tyr,R3是可用C1-4烷基取代的Gly、D-Leu、D-Trp、D-Val，或可用C1-4烷氧基、萘基或2-甲基吲哚基取代的D-Ser、D-Ala，或可用C7-10芳烷基取代的D-His,R4是Leu,R5是用选自下列的基团保护的Arg:C1-6烷氧基苯磺酰基、三-C1-6烷基苯磺酰基和硝基，R6是具有下式的基团NH-R8’，其中R8’是氢原子或可任选地用羟基取代的烷基。
3．根据权利要求1的方法，其中R1是His,R2是Tyr,R3是D-Leu,R4是Leu,R5是用C1-6烷氧基苯磺酰基保护的Arg,R6是具有下式的基团NH-R8”，其中R8”是可任选地用羟基取代的C1-3烷基。
4．根据权利要求1的方法，其中肽(Ⅱ)或者其盐与肽(Ⅲ)或者其盐的反应在大约0-40℃的温度下进行约30-60小时。
5．根据权利要求1的方法，其中在脱保护基反应中使用酸。
6．根据权利要求5的方法，其中所述酸是C1-6链烷磺酸。
7．根据权利要求5的方法，其中将所述酸以肽(Ⅰ’)的约5-25倍(重量)的比例使用。
8．回收并纯化权利要求1中所定义的肽(Ⅰ)的方法，该方法包括将含有油状游离形式产物的反应混合物进行柱色谱纯化，所述反应混合物是通过在存在酸的条件下，对肽(Ⅰ’)进行脱保护基反应，然后用碱中和而得到的。
9．下式肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-OR9(Ⅳ)其中R1是His、Tyr、Trp或p-NH2-Phe,R2是Tyr或Phe,R3是任选地取代的Gly或任选地取代的α-D-氨基酸残基，R9是保护基，或者其盐。
10．根据权利要求9的肽或者其盐，其中R1是His,R2是Tyr,R3是可用C1-4烷基取代的Gly、D-Leu、D-Trp、D-Val，或可用C1-4烷氧基取代的D-Ser、D-Ala，或可用萘基或2-甲基吲哚基取代的D-Ala，或可用C7-10芳烷基取代的D-His,R9是C1-6烷基、C6-10芳基或C7-12芳烷基。
11．根据权利要求9的肽或者其盐，其中R1是His,R2是Tyr,R3是D-Leu,R9是C1-6烷基。
12．用于生产下式肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-OH (Ⅱ)其中R1是His,Tyr,Trp或p-NH2-Phe,R2是Tyr或Phe,R3是任选地取代的Gly或任选地取代的α-D-氨基酸残基，或者其盐的方法，该方法包括水解下式肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-OR9(Ⅳ)其中R1,R2和R3具有与上述定义相同的含义，R9是保护基，或者其盐。
13．下式肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-OH (Ⅱ)其中R1是His,Tyr,Trp或p-NH2-Phe,R2是Tyr或Phe,R3是任选地取代的Gly或任选地取代的α-D-氨基酸残基，或者其盐的晶体。
14．下式肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-OH(Ⅱ)其中R1是His,Tyr,Trp或p-NH2-Phe,R2是Tyr或Phe,R3是任选地取代的Gly或任选地取代的α-D-氨基酸残基，或者其盐的晶体的生产方法，该方法包括对肽(Ⅱ)或者其盐的溶液进行老化。
15．根据权利要求14的方法，其中在温度为约10-70℃下，将浓度为约0.01-0.05摩尔/升的肽(Ⅱ)或者其盐的溶液老化约10-70小时。
全文摘要
以工业化规模生产具有下式肽:5－氧代－Pro－R
文档编号C07K7/23GK1222916SQ97195678
公开日1999年7月14日 申请日期1997年6月19日 优先权日1996年6月21日
发明者畑中千年, 阿部保明, 山野光久 申请人:武田药品工业株式会社