多肽、其生产方法及应用的制作方法

专利名称：多肽、其生产方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及G蛋白偶联受体蛋白质APJ的新的配体多肽，以及包括编码该配体多肽之DNA的DNA序列。
背景技术：
许多激素和神经递质通过存在于细胞膜上的特异性受体介导生物学功能。其中许多受体本身是通过激活偶联的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(以下有时简称为G蛋白)参予细胞内信号转导的，并且这些受体都有包括7个跨膜区的共同结构。因此，这些受体被统称为G蛋白偶联受体或七跨膜受体。
通过这些激素或神经递质与G蛋白偶联受体的相互作用而发挥各种重要的调节功能，例如维持内环境稳定、生殖、发育、代谢和生长，以及调节神经系统、循环系统、免疫系统、胃肠系统和代谢系统。虽然已知存在有各种不同的激素和神经递质的受体蛋白，并且也已知它们在控制生命功能中起着重要作用，但还有一些未知活性物质(激素或神经递质)及其受体是否存在等方面的问题尚不清楚。
近年来，利用G蛋白偶联受体蛋白质在部分氨基酸序列上的相似性，已借助聚合酶链反应技术(简称为PCR)搜索了一些编码新的受体蛋白质的DNA，并且迄今也已克隆了许多未知配体的所谓孤独G蛋白偶联受体(Libert，F.等人，科学244，569-572，1989；Wetch，S.K.等人，Biochem.Biophys.Res.Communi 209，606-613，1995；Marchese A.等，基因组23，609-618，1994；Marchese，A基因组29，335-344，1995)。此外，由于基因组DNA和cDNA随机测序工作的开展，也已相继发现了一些新的G蛋白偶联受体蛋白质(Nomura，N.等人，DNA研究，Vol.1，27-35，1994)。迄今为止，用于确定这些孤独G蛋白偶联受体蛋白质配体的通用方法，仍只是基于这些G蛋白偶联受体蛋白质的一级结构相似性。然而，许多孤独G蛋白偶联受体蛋白质与已知受体的同源性很低，故很难基于一级结构相似性来估计其配体，除非它们确实是已知配体之受体的亚型。另一方面，由于基因分析工作的开展，已发现了许多孤独G蛋白偶联受体，故推测它们仍存在许多未知的相应配体。然而，只有很少数情况下才能真正鉴定出这些孤独G蛋白偶联受体的配体。
最近，已报导了向动物细胞中导入编码未知配体之受体蛋白质(即孤独G蛋白偶联受体蛋白质)的cDNA，以研究新的阿片样肽的方法(Reinsheid.R.K.等人，科学270，792-794，1995；Menular，J.-C.等人，自然377，532-535，1995)。然而，鉴于与已知G蛋白偶联受体蛋白质的相似性及组织分布，这些情况下很易于预知该配体应属于阿片样肽家族。有关通过阿片样受体作用于活体之物质的研究与开发已有多年的历史，并已开发了受体的多种拮抗剂和激动剂。因此，从人工合成的化合物中挑选出了受体的激动剂并以其作为探针，证明了受体在受体cDNA转染的细胞中的表达。然后，搜索与激动剂相似的细胞内信号转导激活剂，纯化如此发现的激活剂，并确定配体的结构。然而，孤独受体与已知的G蛋白偶联受体蛋白质的同源性较低时，便很难以推测其配体。
APJ是迄今报导的孤独G蛋白偶联受体之一(O＇Dowd，B.F.等人，Gene 436，355-359，1993)。APJ与血管紧张肽受体(AT1)间的同源性低，而尽管APJ在CHO细胞中有表达，却完全检测不到与血管紧张肽II的反应，所以其配体仍不清楚。
在中枢神经系统、循环系统、生殖系统、免疫系统、消化器官等系统或器官中表达的孤独G蛋白偶联受体APJ的配体，可望作为药物使用，但有关的它们结构和功能目前尚未被阐明。
发明公开本发明人借助适当的方法，并利用特异性细胞刺激活性例如信号特异活性检测为指标，在细胞中表达了编码孤独G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)的cDNA，成功地筛选出被所说的受体蛋白质识别为配体的多肽。
本发明人还发现，可筛选出一种能够改变该配体之结合活性的化合物，其为所说的受体蛋白质的激活因子。
因此，本发明涉及(1)能与包括由SEQ ID No3代表的氨基酸序列或其实质性等同物的受体蛋白质结合的多肽，其前体多肽、其酰胺或酯，或其盐。(2)如上文(1)中提到的多肽，其包括由SEQ ID No1代表的氨基酸序列或其实质性等同物，(3)如上文(1)中提到的多肽，其包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的部分序列，(4)如上文(1)中提到的多肽，其包括(a)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第6至77位氨基酸残基的肽，(b)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第40至77位氨基酸残基的肽，(c)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第42至77位氨基酸残基的肽，(d)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第47至77位氨基酸残基的肽，(e)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第61至77位氨基酸残基的肽，(f)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第65至77位氨基酸残基的肽，或其N末端氨基酸(Gln)转变成焦谷氨酸残基而产生的衍生物，(g)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第1至25位氨基酸残基的肽，(h)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第6-25位氨基酸残基的肽，(i)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第42至64位氨基酸残基的肽，(j)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第61至64位氨基酸残基的肽，(k)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第43至77位氨基酸残基的肽，(l)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第41至77位氨基酸残基的肽，(m)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第66至77位氨基酸残基的肽，(n)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第67至77位氨基酸残基的肽，(o)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第64至77位氨基酸残基的肽，(p)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第63至77位氨基酸残基的肽，(q)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第65至76位氨基酸残基的肽，(r)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第65至75位氨基酸残基的肽，(s)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第65至75位氨基酸残基的肽，(5)如上文(1)中提到的多肽，其包括由SEQ ID No15、SEQ ID No38、SEQID No40或SEQ ID No42代表的氨基酸序列中从第65位至第77位氨基酸残基的氨基酸序列，(6)如上文(1)中提到的多肽，其具有氨基酸序列pGlu Arg Pro Arg LeuSer His Lys Gly Pro Met Pro Phe，(7)如上文(1)中提到的多肽，其包括由SEQ ID No15、SEQ ID No38、SEQID No40或SEQ ID No42代表的氨基酸序列中从第42位至第77位氨基酸残基的氨基酸序列，(8)如上文(1)中提到的多肽，其为具有SEQ ID No15所代表的氨基酸序列或其实质性等同物的前体多肽，(9)如上文(1)中提到的多肽，其为具有由SEQ ID No38所代表的氨基酸序列或其实质性等同物的前体多肽，(10)如上文(1)中提到的多肽，其为具有由SEQ ID No40所代表的氨基酸序列或其实质性等同物的前体多肽，(11)如上文(1)中提到的多肽，其为具有由SEQ ID No42所代表的氨基酸序列或其实质性等同物的前体多肽，(12)DNA，其包括具有编码能够与受体蛋白质结合之多肽或其前体多肽的核苷酸序列的DNA，所说的受体蛋白质包括由SEQ ID No3所代表的氨基酸序列或其实质性等同物，(13)如上文(12)中提到的DNA，其中由之编码的多肽包括SEQ ID No1所代表的氨基酸序列或其实质性等同物，(14)如上文(12)中提到的DNA，其中由之编码的多肽包括由SEQ IDNo15、SEQ ID No38、SEQ ID No40或SEQ ID No42所代表之氨基酸序列中从第42位氨基酸残基至第77位氨基酸残基的氨基酸序列，(15)如上文(12)中提到的DNA，其中由之编码的多肽包括由SEQ IDNo15、SEQ ID No38、SEQ ID No40或SEQ ID No42所代表的氨基酸序列中第42位氨基酸残基到第77位氨基酸残基的氨基酸序列，(16)如上文(12)中提到的DNA，其中由之编码的前体多肽包括由SEQ IDNo15所代表的氨基酸序列或其实质性等同物，(17)如上文(12)中提到的DNA，其中由之编码的前体多肽包括由SEQ IDNo38所代表的氨基酸序列或其实质性等同物，(18)如上文(12)中提到的DNA，其中由之编码的前体多肽包括由SEQ IDNo40所代表的氨基酸序列或其实质性等同物，(19)如上文(12)中提到的DNA，其中由之编码的前体多肽包括由SEQ IDNo42所代表的氨基酸序列或其实质性等同物，(20)包括如上文(12)中记载的DNA的重组载体，(21)携带如上文(12)中记载的DNA或上文(20)中记载的重组载体的转化体，(22)生产多肽、其前体多肽或其盐的方法，其包括培养如上文(21)中记载的转化体，(23)包括如上文(1)中记载的多肽、其前体多肽、其酰胺或酯，或其盐的药物组合物，(24)包括如上文(12)中记载的DNA的药物组合物，(25)如上文(23)或(24)中记载的药物组合物，其为中枢神经系统功能调节剂、循环功能调节剂、免疫功能调节剂、胃肠功能调节剂、代谢功能调节剂或生殖功能调节剂，(26)抗上文(1)中记载的多肽或其前体多肽的抗体，(27)包括上文(26)中记载的抗体的诊断组合物，以及(28)筛选能够改变上文(1)中记载的多肽与受体蛋白质之结合活性的化合物的方法，其中所述受体蛋白质包括由SEQ ID No3代表的氨基酸序列，所说的方法包括使用上文(1)中记载的多肽和所说的受体蛋白质，本发明进一步提供(29)哺乳动物来源的，如上文(1)中记载的多肽，和(30)如上文(23)或(24)中记载的药物组合物，其可用于治疗和/或预防痴呆、抑郁、活动过强性儿童综合症(脑过小病)、意识障碍、焦虑症、精神分裂症、恐怖症、生长激素分泌紊乱、饮食过多症、贪食症、高胆固醇血症、高甘油酯血症、高脂血症、高催乳素血症、糖尿病、肿瘤、胰腺炎、肾病、特纳氏综合症、神经官能症、类风湿性关节炎、脊髓损伤、一过性脑局部缺血、肌萎缩性侧索硬化、急性心肌梗塞、脊髓小脑退化、骨折、创伤、特应性皮炎、骨质疏松、哮喘、癫痫、不育症、动脉硬化、肺气肿、肺水肿、乳溢、爱滋病等。
在本发明的实践中，配体多肽的G蛋白偶联受体蛋白质具体地是(31)特征在于含有由SEQ ID No3代表之氨基酸序列或其实质性等同物的G蛋白偶联受体蛋白质，或其盐，或者，(32)如上文(31)中记载的G蛋白偶联受体蛋白质，其包括由SEQ ID No3所代表的氨基酸序列衍生而来，缺失1至30，最好1至10个氨基酸残基，或加入(或插入)1至30个，最好1至10个氨基酸残基，或用不同的氨基酸残基取代1至30个，最好1至10个氨基酸残基后的氨基酸序列，或其盐。
本说明书中术语“实质性等同物”是指蛋白质的活性，例如配体和受体的结合活性及物理特征是基本上相同的。氨基酸的取代、缺失或插入常常不会造成多肽的物理和化学性质的根本改变，此时包含有取代、缺失或插入的多肽应被视为缺少这种取代、缺失或插入的多肽的实质性等同物。序列内氨基酸的实质上等同的取代物可选自于该氨基酸所属类别内的其他成员。非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
附图简述

图1显示G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)cDNA的核苷酸序列和由之编码的氨基酸序列。
图2显示用Northern印迹法分析G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)mRNA的组织分布的结果。
图3显示全长度受体蛋白质在CHO-A10细胞系中，于转录水平上确定的表达。
泳道1至7是质粒DNA(pAKKO-A10)的系列稀释液(1，1/4，1/16，1/256，1/1024，1/4096)；泳道8至11是从CHO-A10细胞制备的cDNA的系列稀释液(1，1/10，1/100，1/1000)；泳道12是没有加反转录酶时的结果；泳道13是没有使用mRNA作为模板时的结果；泳道14是以同样方式处理对照CHO细胞所得到的结果；泳道15是在没有使用反转录酶的情况下以同样方式处理对照CHO细胞时的结果。M代表DNA大小标志物；左边一个是入噬茵体DNA的Sty Ⅰ消化产物，右边一个是φx174DNA的HindⅢ消化产物。
图4显示使用细胞传感器(Cytosensor)检测包括在猪脑或牛胃提取物中之特异性刺激CHO-A10细胞的活性的结果。
B1到B4代表用从猪脑制得的样品进行检测时得到的结果，S1至S4是用牛胃衍生的样品测得的结果。各数据代表作为时间的函数，CHO-A10细胞(○)和对照细胞(●)之间在各检测循环中相对于基础水平的胞外pH的改变速率(酸化速率)。
在4至7次循环期间细胞与样品接触。
图5显示使用细胞传感器检测猪小肠提取物中之特异性刺激CHO-A10细胞的活性的结果(接图6)。
G1至G8代表用猪小肠制得的样品获得的检测结果。各数据代表各检测循环中，作为时间的函数，CHO-A10细胞(○)和对照细胞(●)之间相对于基础水平的胞外pH的改变速率(酸化速率)。
在4至7次循环期间细胞与样品接触。
图6显示使用细胞传感器检测包含在牛下丘脑提取物中之特异性刺激CHO-A10细胞的活性的结果(接图7)。
F1至F5代表C18柱上10％乙腈洗脱级分中的样品，F6至F10样品得自30％乙腈洗脱级分，F11至F15为50％乙腈洗脱级分。进一步在CM-Sepbarose离子交换柱上将各洗脱级分分级分离成第一洗脱级分(Fr.1、6、11)、100mM乙酸铵洗脱级分(Fr.2、7、12)、250mM乙酸铵洗脱级分(Fr.3、8、13)、500mM乙酸铵洗脱级分(Fr.4、9、14)和1000mM乙酸铵洗脱级分(Fr.5、10、15)，其得到15个级分，然后检测各样品中所含有的细胞刺激活性。
各数据代表，当4-7次循环期间CHO-A10细胞(○)和对照细胞(●)与样品接触时，作为时间的函数，胞外pH相对于基础水平的改变速率。
纵坐标代表酸化速率(％基础水平)，横坐标代表循环。
图7显示使用细胞传感器检测包含在牛下丘脑提取物中之特异性刺激CHO-A10细胞的活性的结果(接图6)。
F1至F5代表C18柱上10％乙腈洗脱级分中的样品，F6至F10样品得自30％乙腈洗脱级分，F11至F15为50％乙腈洗脱级分样品。进一步在CM-Sepharose离子交换柱上将各洗脱级分分级分离成第一洗脱级分(Fr.1、6、11)、100mM乙酸铵洗脱级分(Fr.2、7、12)、250mM乙酸铵洗脱级分(Fr.3、8、13)、500mM乙酸铵洗脱级分(Fr.4、9、14)和1000mM乙酸铵洗脱级分(Fr.5、10、15)，其得到15个级分，然后检测各样品中所含有的细胞刺激活性。
各数据代表，当第4-7次循环期间CHO-A10细胞(○)和对照细胞(●)与样品接触时，作为时间的函数，胞外pH相对于基础水平的改变速率。
纵坐标代表酸化速率(％基础水平)，横坐标代表循环。
图8显示以细胞刺激活性作为指征，选择高水平APJ受体表达细胞。
将从CHO-A10细胞克隆的细胞1至8与同一样品接触，然后测定第4次循环中，相对于基础水平的细胞外pH改变的速率(％)。
纵坐标代表酸化速率的改变(％基础水平)，横坐标代表从CHO-A10细胞克隆的细胞的参考号。
图9显示在RESOURCE RPC中粗制牛胃衍生的肽级分的分离，以及CHO-A10细胞特异性活性的检测。
图10显示在Vydac diphenyl 219TP5415上分离RESOURCE RPC中得到的P-2活性，并检测CHO-A10特异活性。
图11显示在Sephasil C8 SC 2．1/10上分离RESOURCE RPC中得到的P-2活性，并检测CHO-A10特异活性。
图12显示在μRPC C2/C18 SC 2．1/10上分离于Vydac diphenyl219TP5415上得到的活性级分，并检测CHO-A10特异活性。
图13显示在μRPC C2/C18 SC 2.1/10上分离于Sephasil C8 SC2．1/10上得到的活性级分，并检测CHO-A10特异活性。
图14显示小鼠衍生的EST(小鼠EST)与SEQ ID No1限定的牛胃衍生的肽片段(牛)之间的同源性。
图15显示小鼠型配体多肽cDNA的核苷酸序列和由之编码的氨基酸序列。
图16显示小鼠型配体多肽(小鼠)和SEQ ID No1限定之牛胃衍生的肽片段(牛部分)间的同源性。
图17显示大鼠型配体多肽cDNA的核苷酸序列和由之编码的氨基酸序列。
图18显示人型配体多肽cDNA的核苷酸序列和由之编码的氨基酸序列。
图19显示牛型配体多肽cDNA的核苷酸序列和由之编码的氨基酸序列。
图20比较显示由牛、小鼠、大鼠和人型配体多肽cDNA的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
图21图解显示实施例16中得到的肽，和由SEQ ID No42限定的序列中第42位至77位氨基酸残基之氨基酸序列代表的肽所引起的酸化速率改变。
附图中，○_○代表由实施例6中得到的肽引起的酸化速率的改变；●_●代表由SEQ ID No42限定的序列中第42至77位氨基酸残基之氨基酸序列代表的肽所引起的酸化速率改变。
图22图解显示实施例33中检测对毛喉素刺激的cAMP产生的抑制活性的结果。
图中，○_○代表SEQ ID No42中第42至77位氨基酸残基的氨基酸序列所表示的肽；●_●代表SEQ ID No40中第45至77位氨基酸残基的氨基酸序列所表示的肽。
本发明的配体多肽包括能够与G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)结合的任何蛋白质。具体地说，可以提到的多肽包括①含有SEQ ID No1所代表之氨基酸序列或其实质性等同物的肽或其部分肽，②由包括SEQ IDNo15所示氨基酸序列或其实质性等同物的前体衍生的部分肽，③由包括SEQ ID No38所代表之氨基酸序列或其实质性等同物的前体衍生的部分肽，④由包括SEQ ID No40所代表之氨基酸序列或其实质性等同物的前体衍生的部分肽，或⑤由包括SEQ ID No42所代表之氨基酸序列或其实质性等同物的前体衍生的部分肽，等等。
现在详细描述上述配体多肽、其酰胺或酯，或其盐(以下有时简称为多肽)、其生产方法及多肽的应用。
本发明的上述配体多肽包括由任何组织，例如垂体、胰脏、脑、肾、肝、生殖腺、甲状腺、胆囊、骨髓、肾上腺、皮肤、肌肉、肺、消化道、血管、心脏等组织；或者由人或其他温血动物，如豚鼠、大鼠、小鼠、猪、羊、牛、猴等的细胞衍生的任何多肽，并包括①含有SEQ ID No1所代表之氨基酸序列或其实质性等同物的肽，或其部分肽，②由包括SEQID No15所示氨基酸序列或其实质性等同物的前体衍生的部分肽，③由包括SEQ ID No38所代表之氨基酸序列或其实质性等同物的前体衍生的部分肽，④由包括SEQ ID No40所代表之氨基酸序列或其实质性等同物的前体衍生的部分肽，⑤由包括SEQ ID No42所代表之氨基酸序列或其实质性等同物的前体衍生的部分肽，等等。例如，除包括SEQ ID No1之氨基酸序列的多肽外，本发明的配体多肽还包括①包括与SEQ ID No1的氨基酸序列有大约50～99.9％、较好70-99.9％，更好80-99.9％，最好90-99.9％同源性之氨基酸序列，并与包括SEQ ID No73之氨基酸序列的多肽有实质上等同的活性的多肽，②与包括SEQ ID No15之氨基酸序列的前体的部分肽有性质上实质等同活性的多肽，③与包括SEQ IDNo38之氨基酸序列的前体的部分肽有性质上实质等同的活性的多肽，④与包括SEQ ID No40之氨基酸序列的前体的部分肽有性质上实质等同的活性的多肽，或⑤与包括SEQ ID No42之氨基酸序列的前体的部分肽有性质上实质等同的活性的多肽等。术语“实质上等同的”是指受体结合活性、信号转导活性等性质是等同的。因此，既使在受体结合活性和多肽分子量等方面存在程度上的差异也是允许的。
作为本发明多肽的特定实例，可以是衍生于小鼠脑、大鼠脑、猪脑、猪小肠、牛下丘脑、牛胃、人下丘脑或人肺的，并含有以下序列所代表的氨基酸序列的多肽①由SEQ ID No1代表的氨基酸序列或其部分序列，②由SEQ ID No15代表的氨基酸序列的部分序列，③由SEQ ID No38代表的氨基酸序列的部分序列，④由SEQ ID No40代表之氨基酸序列的部分序列，⑤由SEQ ID No42代表之氨基酸序列的部分序列等。
此外，作为有上述意义的含氨基酸序列实质性等同物的多肽，可提到的有含有经取代、缺失、加入或插入一个或多个氨基酸而由含有下述序列或其实质性等同物等的多肽衍生的多肽或其部分肽，所说的序列包括①由SEQ ID No1代表的氨基酸序列或其部分序列，②由SEQ IDNo15代表之氨基酸序列的部分序列，③由SEQ ID No38代表的氨基酸序列的部分序列，④由SEQ ID No40代表的氨基酸序列之部分序列，⑤由SEQ ID No42代表的氨基酸序列之部分序列，因此，可以提到的有包括(1)经缺失1至7个，较好1至5个，最好1至3个氨基酸而由①SEQ IDNo1代表的氨基酸序列或其部分序列，②SEQ ID No15代表的氨基酸序列的部分序列，③SEQ ID No38代表的氨基酸序列的部分序列，④SEQID No40代表的氨基酸序列的部分序列，或⑤SEQ ID No42代表的氨基酸序列的部分序列衍生之氨基酸序列的多肽；(2)经加入(或插入)1至20个，较好1至15个，最好1至10个氨基酸而由①SEQ ID No1代表的氨基酸序列或其部分序列，②SEQ ID No15代表的氨基酸序列的部分序列，③SEQ ID No38代表的氨基酸序列的部分序列，④SEQ ID No40代表的氨基酸序列的部分序列，或⑤SEQ ID No42代表的氨基酸序列的部分序列衍生之氨基酸序列的多肽；或(3)因用其它氨基酸取代1至7个、优选1-5个、更优选1-3个氨基酸而由①SEQ ID No1代表的氨基酸序列或其部分序列，②SEQ ID No15代表的氨基酸序列的部分序列，③SEQ ID No38代表的氨基酸序列的部分序列，④SEQ ID No40代表的氨基酸序列的部分序列，或⑤SEQ ID No42代表的氨基酸序列的部分序列衍生之氨基酸序列的多肽。
再者，本发明的多肽或部分肽包括在体内裂解Gln的N末端，然后将所说的Gln转化成焦谷氨基酸残基而衍生的氨基酸序列。
本发明的前体可以是含有作为部分序列的本发明配体肽的任何蛋白质。因此，其包括含有由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的蛋白质(这样的蛋白质在下文中有时与上文提到的配体多肽一起称为本发明的多肽或配体多肽)。
本发明的多肽具有约1，000至10，000，较好约1，000至5，000，更好约1，000至3，000道尔顿的分子量。
在本说明书中，(多)肽是根据已确定的实践，以N末端(氨基末端)在左侧，C末端(羧基末端)在右侧的方式显示的。这些包括①由SEQ ID No1代表的氨基酸序列或其部分序列，②由SEQ ID No15代表的氨基酸序列的部分序列，③由SEQ ID No38代表的氨基酸序列的部分序列，④由SEQID No40代表的氨基酸序列的部分序列，⑤由SEQ ID No42代表的氨基酸序列的部分序列等的多肽在C末端一般具有羧基(-COOH)或羧基(-COO-)。但C末端可以是酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)形式的。作为酯的R基团，其可以是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基等C1-6烷基团，环戊基、环己基等C3-8环烷基基团，苯基、α-萘基等C6-12芳基基团，包括例如苄基、苯乙基、二苯甲基等苯基-C1-2烷基基团，及α-萘基甲基等α-萘基-C1-2烷基基团的C7-14芳烷基基团。还可提到新戊酰羟甲酯等，其通常用作口服给药的酯。当这些包括①由SEQ ID No1代表的氨基酸序列或其部分序列，②由SEQ ID No15代表的氨基酸序列的部分序列，③由SEQ ID N038代表的氨基酸序列的部分序列，④由SEQID No40代表的氨基酸序列的部分序列，⑤由SEQ ID No42代表的氨基酸序列的部分序列等的多肽在C末端以外的位置有附加的羧基或羧酸根基因，则其中的这些基团被酰胺化或酯化的多肽也落入本发明之多肽的范畴内。在这种情况下，酯可以是如上文提到的C末端酯的同类酯。
本发明多肽的盐是与碱(如碱金属)或酸(有机酸、无机酸)形成的生理上可接受的盐，更好是生理上可接受的酸加成盐。作为这样的盐，可以使用与无机酸(如盐酸、磷酸、硼酸、硫酸)或有机酸(如乙酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的盐。
可以按照下文提到的肽合成方法，或者从人或温血动物组织或细胞中纯化而制备本发明的多肽。也可以经培养含有该多肽之DNA编码序列的转化体而生产之，如下文所述。
当从人或温血动物组织或细胞中生产多肽时，首先制备人或温血动物组织或细胞的匀浆物，然后用酸提取，并对提取物按适当的组合方式进行盐析、透析、凝胶过滤、反相层析、离子交换层析或亲和层析等层析，以纯化和分离之。
如上所述，可以用已知的肽合成方法生产本发明的多肽。肽合成的方法是任何一种固相合成和液相合成方法。因此，可以将能够与其残余部分构成该蛋白质的部分肽或氨基酸缩合在一起，并且当产物有保护基团时，去掉保护基团以制得所需的肽。已知的缩合和去保护方法包括下列文献(1)至(5)中所描述的方法。
(1)M.Bodanszky和M.A.Ondetti，《肽合成》，IntersciencePublishers，New York，1966(2)Schroeder和Luebke，《肽》，Academic Press，New York，1965(3)Nobuo Izumiya等，《肽合成基础与实验》，Maruzen，1975(4)Haruaki Yajima和Shumpei Sakakibara，《蛋白质化学IV生化实验》，205，1977(5)Haruaki Yajima(编)，药物开发(续)14，Peptide Synthesis，Hirokawa Shoten反应后，可联合使用溶剂提取、柱层析、液相层析及重结晶等常规纯化技术，纯化并分离蛋白质。上述分离的蛋白质是游离化合物时，可用已知方法将其转化成适当的盐。反之，如分离的产物是盐时，可使用已知方法将其转化成游离肽。
可使用适于酰胺化的肽合成树脂制得多肽的酰胺。树脂包括氯甲基树脂、羟甲基树脂、二苯甲基胺树脂、氨甲基树脂、4-苄氧基苄醇树脂、4-甲基二苯甲基胺树脂、PAM树脂、4-羟甲基甲基苯基乙酰氨甲基树酯、聚丙烯酰胺树脂、4-(2＇，4＇-二甲氧基苯基羟甲基)苯氧基树脂、4-(2＇，4＇-二甲氧基苯基-Fmoc氨乙基)苯氧基树脂等。按照各种已知的缩合技术，使用上述树脂，将那些α氨基和侧链官能团已被适当保护的氨基酸，按目的肽的氨基酸顺序缩合到树脂上。在系列反应结束时，从树脂上去掉肽或被保护的肽并除去保护基团，必要时形成二硫键以得到目的多肽。
为了缩合上述被保护的氨基酸，可使用各种肽合成的活化试剂，但其中特别适用的是碳化二亚胺。碳化二亚胺包括DCC、N，N＇-二异丙基碳化二亚胺和N-乙基-N＇-(3-二甲氨基脯氨酰)碳化二亚胺。为了用这样的试剂活化，向树脂内直接加入外消旋抑制物添加剂，如HOBt和被保护的氨基酸，或者向树脂内加入预活化为对称酸酐的被保护的氨基酸，HOBt或HOOBt酯。可以从已知可用于肽缩合反应的溶剂中适当地选择活化被保护的氨基酸或与树脂缩合时使用的溶剂。所用溶剂例如可以是N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、氯仿、三氟乙醇、二甲基亚砜、DMF、吡啶、二噁烷、二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、乙酸乙酯或它们的适当混合物。可在已知肽键形成所需温度范围内选择反应温度，并且通常选自-20℃～50℃。一般按比例使用1.5至4倍过量的活化的氨基酸衍生物。如果用茚三酮反应发现缩合不足，可以重复进行缩合反应以便在不除去保护基团的情况下达到足够缩合。如果重复进行缩合反应仍不能达到足够程度的缩合，则可用乙酸酐或乙酰咪唑使未反应的氨基基团乙酰化。
起始氨基酸材料的氨基保护基团包括Z、Boc、叔戊氧基羰基、异冰片氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、Cl-Z、Br-Z、金刚烷氧基羰基、三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、甲酰基、2-硝基苯基亚磺酰基、二苯基硫膦基或Fmoc.可使用的羧基保护基团包括但不只限于上述C1-6烷基、C3-8环烷基和C7-14芳烷基以及2-金刚烷基、4-硝基苄基、4-甲氧基苄基、4-氯苄基、苯甲酰甲基、苄氧基羰基酰肼基、叔丁氧基基羰基酰肼基和三苯甲游基酰肼基。
可通过酯化或醚化作用保护丝氨酸和苏氨酸的羟基。适于酯化作用的基团包括乙酰基等低级链烷酰基类碳衍生的基团，苯甲酰基等芳酰基基团，苄氧基羰基和乙氧基羰基。适于所说的醚化作用的基团包括苄基、四氢吡喃基和叔丁基。
酪氨酸的酚式羟基的保护基团包括Bzl、Cl2-Bzl、2-硝基苄基、Br-Z和叔丁基。
组氨酸中咪唑的保护基团包括Tos，4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基、DNP、苄氧基甲基、Bum、Boc、Trt和Fmoc。
起始氨基酸的活化羧基基团包括相应的酸酐、叠氮化物和活性酯，例如与五氯苯酚、2，4，5-三氯苯酚、2，4-二硝基苯酚、氰甲基醇、对硝基苯酚、HONB、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基苯邻二甲酰亚胺、HOBt等醇形成的酯。起始氨基酸的活化氨基基团包括相应的磷酰胺。
除去保护基团的方法包括于钯黑或Pd/C等催化剂存在下使用氢气进行催化还原反应，用无水氟化氢、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸或这些酸的混合物进行酸处理，用二异丙基乙胺、三乙胺、哌啶、哌嗪进行碱处理，在液体氨中用钠金属还原。用上述酸处理方法进行去除反应一般是在-20℃-40℃的温度下，并最好加入苯甲醚、苯酚、苯硫基甲烷、间甲酚、对甲酚、甲硫醚、1，4-丁二硫醇、1，2-乙二硫醇等阳离子受体以完成之。可以用苯硫酚处理以除去用于保护组氨酸之咪唑基团的2，4-二硝基苯基基团，可用稀氢氧化钠溶液或稀氨水进行碱处理以及用1，2-乙二硫醇、1，4-丁二硫醇进行上述酸处理，以除去用于保护色氨酸之吲哚基团的甲酰基团。
可以从已知基团和方法中判断选择保护不参与起始材料反应之官能团的方法、可使用的保护基团、除去保护基团的方法，以及活化参与反应之官能团的方法。
得到酰胺形式的多肽的另一种方法包括，首先使C末端氨基酸的α羧基酰胺化，然后向N侧延伸肽链直到所需的链长度，然后使C末端肽的α氨基基团和形成目的多肽之其余部分的氨基酸或肽的α羧基基团选择性地去保护，并在混合的上述溶剂中，使α氨基基团和侧链官能团已用上述适当的保护基团保护的两个片段缩合。缩合反应的参数可以与上述相同。用上述方法从缩合后得到的被保护的肽上去除所有的保护基团，以提供所需的粗肽。可以用已知的纯化方法纯化该粗肽，并冻干主要部分以提供酰胺化的多肽。
为了得到多肽的酯，将C末端氨基酸的α羧基基团与预期的醇缩合，得到氨基酸酯，然后再按上述生产酰胺的方法进行生产。
本发明的多肽可以是任何肽，条件是它具有与包括①由SEQ ID No1代表的氨基酸序列或其部分序列，②由SEQ ID No15代表的氨基酸序列的部分序列，③由SEQ ID No38代表的氨基酸序列的部分序列，④由SEQID No40代表的氨基酸序列的部分序列，或⑤由SEQ ID No42代表的氨基酸序列的部分序列等的多肽实质上同样的活性(如中枢神经系统功能调节活性、循环功能调节活性、免疫功能调节活性、胃肠功能调节活性、代谢功能调节活性或生殖功能调节活性。作为这样的肽，其可以是包括经缺失1个或多个氨基酸而由①由SEQ ID No1代表的氨基酸序列或其部分序列，②由SEQ ID No15代表的氨基酸序列的部分序列，③由SEQID No38代表的氨基酸序列的部分序列，④由SEQ ID No40代表的氨基酸序列的部分序列，或⑤由SEQ ID No42代表的氨基酸序列的部分序列等衍生之氨基酸序列的肽。具体地说，优选的是(1)包括由SEQ ID No1代表之氨基酸序列的第1至第12位氨基酸残基的肽，(2)包括由SEQ IDNo1代表之氨基酸序列的第1至第13位氨基酸残基的肽，(3)包括由SEQID No1代表之氨基酸序列的第1至第14位氨基酸残基的肽，(4)包括由SEQ ID No1代表之氨基酸序列的第1至第15位氨基酸残基的肽，⑤包括由SEQ ID No1代表之氨基酸序列的第1至第16位氨基酸残基的肽，(6)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的部分序列的肽等。其中，优选的是包括由SEQ ID No15、38、40或42代表的氨基酸序列的部分序列的肽。
包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的部分序列的多肽中，可以提到的特定实例有(a)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第6至77位氨基酸残基的肽，(b)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第40至77位氨基酸残基的肽，(c)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第42至77位氨基酸残基的肽，(d)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第47至77位氨基酸残基的肽，(e)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第61至77位氨基酸残基的肽，(f)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第66至77位氨基酸残基的肽，或其因N-末端氨基酸(GLn)变为焦谷氨酸残基而得到的衍生物，(g)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第1至25位氨基酸残基的肽，(h)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第6至25位氨基酸残基的肽，(i)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第42至64位氨基酸残基的肽，(j)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第61至64位氨基酸残基的肽，(k)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第43至77位氨基酸残基的肽，(l)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第41至77位氨基酸残基的肽，(m)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第66至77位氨基酸残基的肽，(n)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第67至77位氨基酸残基的肽，(o)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第64至77位氨基酸残基的肽，(p)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第63至77位氨基酸残基的肽，(q)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第65至76位氨基酸残基的肽，(r)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第65至75位氨基酸残基的肽，(s)包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第65至75位氨基酸残基的肽，等等。
其中优选的是包括包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第65至77位氨基酸残基的肽、其中N末端氨基酸(Gln)转变成焦谷氨酸残基而得到的衍生物，或包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第42至77位氨基酸残基的肽。特别优选的是包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的第65至77位氨基酸残基的肽及其N末端氨基酸(Gln)转化成焦谷氨酸残基所得到的衍生物(pGlu Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe)。此外，由氨基酸序列pGlu Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe所代表之肽的部分肽也可用作本发明的多肽(肽)。
本发明的多肽可进一步用作生产抗配体多肽抗体的抗原。除上述本发明的多肽外，由上述本发明的多肽衍生的部分肽，如N末端肽、C末端肽和中间肽也可用作抗原。
可使用的部分肽可以是各自只含有一个结构域的肽或各自含有多个结构域的肽。
本说明书中的部分肽可以有一个呈酰胺或(-CONH2)或酯(-COOR)形式的C末端。作为酯基团的例子，可以是如对上述多肽述及的酯基团。当所说的片段肽在C末端以外的位置上具有羧基或羧基时，则这些基团可以被酰胺化或酯化，而且这些酰胺或酯也包括在本发明之片段肽的概念中。上述酯基团可以是与上述C末端酯基团同样的。
此外，本发明的多肽或部分肽可以是与具有已知功能或性质的蛋白质形成的融合蛋白。
作为本发明多肽之片段肽的盐，可以使用如上文对多肽述及的同样类型的盐。
可以使用上述合成多肽的同样合成方法或用适当的肽酶裂解本发明的多肽，以生产本发明多肽的部分肽或其酰胺或酯，或其盐。
编码本发明之多肽的DNA可以是任何DNA，条件是其含有对包括SEQ ID No3代表之氨基酸序列或其实质性等同物的受体蛋白质具有结合亲和性的DNA部分。具体地说，它可以是包括编码含有下列氨基酸序列或其实质性等同物之多肽的核苷酸序列的任何DNA①由SEQ ID No1代表的氨基酸序列或其部分序列，②由SEQ ID No15代表氨基酸序列的部分序列，③由SEQ ID No38代表的氨基酸序列的部分序列，④由SEQID No40代表的氨基酸序列的部分序列，或⑤由SEQ ID No42代表的氨基酸序列的部分序列。其可以是基因组DNA、基因组DNA文库、衍生于上述组织或细胞的cDNA、衍生于上述组织或细胞的cDNA库，或合成DNA。用于文库构建的载体可以是噬菌体、质粒、粘粒、噬茵粒等。也可使用由上述组织或细胞制备的RNA部分，以反转录酶聚合酶链反应技术(以下简称RT-PCR)直接进行扩增。
更具体地说，作为编码衍生于小鼠全脑、大鼠全脑、牛下丘脑、牛胃、人下丘脑或人肺，并含有①由SEQ ID No1代表的氨基酸序列或其部分序列，②由SEQ ID No15代表的氨基酸序列的部分序列，③由SEQID No38代表的氨基酸序列的部分序列，④由SEQ ID No40代表的氨基酸序列的部分序列，或⑤由SEQ ID No42代表的氨基酸序列的部分序列等的多肽的DNA，其可以是(1)含有下列核苷酸序列的DNA①由SEQID No2代表的核苷酸序列或其部分序列，②由SEQ ID No16代表之核苷酸序列的部分序列，③由SEQ ID No39代表之核苷酸序列的部分序列，④由SEQ ID No41代表之核苷酸序列的部分序列，或⑤由SEQ IDNo43代表之核苷酸序列的部分序列；(2)能够在严格条件下与(1)中限定的序列之一杂交的哺乳动物DNA；(3)由于遗传密码简并性而不能与(1)和(2)中限定的任何序列杂交，但编码具有同样氨基酸序列之多肽的DNA等。可以按已知方法或其改进方法进行杂交。上文提到的严格条件例如是42℃、50％甲酰胺、4xSSPE(1xSSPE=150mM NaCl、10mMNaH2PO4·H2O、1mM EDTA，pH7.4)，5xDenhardt溶液，0.1％SDS。
在SEQ ID No2中限定的上述核苷酸序列中，Y代表T或C；N代表T、C、A或G；R代表A或G；M代表C或A；W代表T或A；S代表C或G。
在编码含有①由SEQ ID No1代表的氨基酸序列或其部分序列，②由SEQ ID No15代表的氨基酸序列的部分序列，③由SEQ ID No38代表的氨基酸序列的部分序列，④由SEQ ID No40代表的氨基酸序列的部分序列，⑤由SEQ ID No42代表的氨基酸序列的部分序列等的多肽的DNA中，也可使用含有6至51个(较好9至30个，最好12至30个)核苷酸的部分序列DNA片段作为DNA检测的探针。
也可用下述基因工程方法生产编码本发明的多肽的DNA。
可使用具有多肽的部分核苷酸序列的合成DNA引物进行PCR扩增，或者使用插入到适当载体中、并用含有人衍生之多肽的部分或全部区域的标记DNA片段，或合成DNA进行杂交，以克隆编码本发明之多肽的全长DNA。可按照Molecular Cloning(第二版J.Sambrook等人，Cold Spring Harbor Lab.Press，1989)中所述的方法进行杂交。当使用商业文库时，可按照附带说明书中所说明的方法进行。
可以直接使用，或用限制酶消化或根据使用目的加入接头后使用编码多肽的克隆的DNA。该DNA在5＇端有ATG作为翻译起始密码子，并且在3＇端可能有TAA、TGA或TAG作为终止密码子。可借助适当的DNA接头加入翻译起始和终止密码子。
例如可从编码本发明多肽或部分肽的DNA中切下靶DNA片段，并在适当的表达载体中与启动子下游侧连接，以产生用于多肽或部分肽的表达载体。
载体可包括衍生于大肠杆菌的质粒如pBR322、pBR325、pUC12、pUC13等；衍生于枯草芽孢杆菌的质粒如pUB110，pTP5，pC194等；衍生于酵母的质粒如pSH19，pSH15等；噬茵体如p噬菌体及动物病毒如反转录病毒、痘苗病毒和杆状病毒。
根据本发明，只要与用来表达基团的宿主细胞相容，任何启动子均可使用。当宿主是动物细胞时，启动子包括SV40衍生的启动子、反转录病毒启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、SRα启动子等。当转化的宿主是大肠杆菌时，启动子较好是trp启动子、lac启动子、recA启动子、入PL启动子、lpp启动子等。当转化的宿主是芽孢杆菌时，启动子可以是SP01启动子、SP02启动子、penP启动子等。当宿主是酵母时，启动子较好是PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子等。当宿主是昆虫细胞时，启动子较好是多角体蛋白启动子、P10启动子等。
除上述元件外，表达载体还可任选含有增强子、剪接信号、polyA腺苷酸化信号、选择标志、SV40复制原点(以下有时简称为SV40 ori)等。选择标志的例子包括二氢叶酸还原酶(以下有时简称为dhfr)基因[氨甲蝶呤(MTX)抗性]、氨苄青霉素抗性基因(以下有时简称为Ampr)、新霉素抗性基因(以下有时简称为Neo，G418抗性)等。特别是，当CHO(dhfr-)细胞与作为选择标志的dhfr基因一起使用时，也可使用无胸苷培养基完成选择。
必要时，可在本发明受体蛋白质的N末端加上与宿主相匹配的信号序列。作为信号序列，在使用埃希氏杆茵属细菌作宿主时，可以提到的有PhoA信号序列、Ompa信号序列等；在使用芽孢杆菌属细菌作宿主时可提到的有α淀粉酶信号序列、枯草杆菌蛋白酶信号序列等；在使用酵母作宿主时，可提到的有MFα信号序列、SUC2信号序列等；在使用动物细胞作宿主时，可提到的信号序列有胰岛素信号序列、α干扰素信号序列、抗体分子信号序列等。
可将如此构建的编码本发明受体蛋白质等的DNA导入宿主中，以产生转化体。
使用如此构建的，携带本发明的多肽或部分肽编码DNA的载体制得转化体或转染体。例如，宿主可以是埃希氏杆菌属微生物、芽孢杆菌属微生物、酵母、昆虫细胞、动物细胞等。埃希氏杆菌属微生物的例子包括大肠杆菌K12.DH1[美国国家科学院院报，Vol.60，160(1968)]、JM103[核酸研究，第9卷，309(1981)]、JA221[分子生物学杂志，Vol.120，517(1978)]、HB101[分子生物学杂志，Vol.41，459(1969)]、C600[遗传学，Vol.39，440(1954)]等。芽孢杆茵属微生物的例子包括枯草芽孢杆菌MI114[Gene，Vol.24，255(1983)]、207-21[生物化学杂志，Vol.95，76(1984)]等。酵母细胞例如可以是酿酒酵母AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D、20B-12等。昆虫可包括蚕(家蚕幼虫)[Maeda等人，自然，Vol.315，592(1985)]等。
昆虫细胞的例子包括草地夜蛾细胞(Sf细胞)、衍生于粉纹夜蛾之中肠的MGl细胞、衍生于粉纹夜蛾卵的High FiveTM细胞、衍生于甘蓝夜蛾的细胞、衍生于Estigmena acrea的细胞等(用于病毒AcNPV)；和家蚕N细胞(BmN细胞)等(用于病毒BmNPV)。作为Sf细胞，可使用Sf9细胞(ATCC CRC 1711)和Vaughn，J.L(in Vitro，13，213-217 1977)所述的Sf21细胞。
动物细胞的例子包括猴细胞COS-7、Vero细胞、中国仓鼠细胞CHO(以下简称CHO细胞)、dhfr基因缺陷型中国仓鼠细胞CHO(以下简称CHO(dhfr-)细胞)、小鼠L细胞、小鼠骨髓瘤细胞、大鼠GH3细胞、人FL细胞、293细胞、C127细胞、小鼠细胞、BALB3T3细胞、Sp-2/0细胞等。
例如可按照美国国家科学院院报，Vol.69，2110(1972)或基因，Vol.17，107(1982)中所述的方法转化埃希氏杆菌属的微生物。可按照分子与普通遗传学，Vol，168，111(1979)中所述的方法转化芽孢杆菌属微生物。例如可按照美国国家科学院院报，Vol.75，1929(1978)中所述的方法转化酵母。例如可按照Bio/Technology，6，47-45，1988中所述的方法转化昆虫细胞或昆虫。例如可按照病毒学，Vol.52，456，1973中所述的方法转化动物细胞。
例如可用脂转染法(Felgner，P.L.等人，美国国家科学院院报，84，7413(1987))、磷酸钙法(Graham，I.L.and van der Eb，A.J病毒学52，456-467(1973))、电穿孔法(Nuenann，E.等人，EMBO J1，841-845(1982))将表达载体导入细胞内。
因而，可得到用含有编码本发明之受体蛋白质等的DNA的表达载体转化的转化体。
作为适于使用动物细胞稳定地表达本发明的受体蛋白质等的方法，可提到克隆选择法，即选择那些其中导入的表达载体已整合到其染色体中的动物细胞。更具体地说，即利用上述选择标志作为指示物来选择转化体。再者，可以反复使用上述选择标志对如此得到的动物细胞进行克隆选择，以得到高表达本发明之受体蛋白质等的稳定的动物细胞系。当使用dhfr基因作为选择标志时，可用渐增MTX浓度的培养基培养细胞，以选择抗性菌株，从而与dhfr基因一起在细胞中扩增编码本发明蛋白质等的DNA，以得到更高水平表达受体蛋白质的动物细胞系。
可以在适于表达编码本发明的受体蛋白质等的DNA，以形成和积聚本发明的多肽的条件下，培养上述转化体以产生本发明的多肽。
可以在液体培养基中培养以埃希氏杆菌或芽孢杆菌属微生物作为宿主的转化体(转染体)。培养基可含有转化体生长所需的碳源、氮源、矿物质等。碳源可包括葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等。氮源可包括铵盐、硝酸盐、玉米浸液、蛋白胨、酪蛋白、肉浸汁、豆饼、马铃薯提取物等有机或无机物，矿物质可包括氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁等。可进一步加入酵母浸膏、维生素、生长促进因子等。培养基的pH约5至8比较理想。
埃希氏杆菌属微生物培养基较好是含有例如葡萄糖和酪蛋白氨基酸的M9培养基(Miller，J.of Experiments in Moledular Genetics，431-433，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1972)。必要时，培养基中可添加药物如3β-吲哚基-丙烯酸，以改善启动子的效率。在使用埃希氏杆菌宿主的情况下，培养通常是在约15至43℃下进行约3至24小时。必要时，可进行通气和搅拌。在使用芽孢杆菌宿主的情况下，培养通常是在大约30至40℃下进行约6至24小时。必要时，也可进行通气和搅拌。在转化体宿主是酵母的情况下，所使用的培养基例如包括Burkholder基本培养基[Bostian，K.L.等人，美国国家科学院院报，77卷，4505(1980)]、含0.5％酪蛋白氨基酸的SD培养基[Bitter G.A.等，美国国家科学院院报，Vol.81，5330(1984)]等。最好将培养基的pH调到大约5至8。培养通常在约20至35℃下进行约24至72小时。必要时可通气和搅拌。在转化体宿主是昆虫的情况下，所使用的培养基可包括向Grace氏昆虫培养基(Grace，T.C.C，自然，195，788(1962))中适当加入添加剂如钝化的(或固定化的)10％牛血清等得到的培养基。培养基的pH最好调到大约6.2至6.4。培养通常是在大约27℃进行约3-5天。必要时，可进行通气和搅拌。在转化体宿主是动物细胞的情况下，所使用的培养基可包括例如含有约5-20％胎牛血清的MEM培养基[Science，Vol122，501(1952)]、DMEM培养基(Virology，Vol，8，396(1959))、RPMI1640培养基[Journal of theAmerican Medical Association，Vol.199，519(1967)]、199培养基[Proceedings of the Society of the Biological Medicine，vol.73，1(1950)]等。pH最好是大约6至8。培养通常在大约30至40℃下进行约15至60小时。必要时，可更换培养基、通气并搅拌。
具体地说，当使用CHO(dhfr-)细胞并以dhfr基因作为选择标志时，最好使用含有几乎没有胸苷的透析胎牛血清的DMEM培养基。
可以按照下述方法从上述培养物中分离并纯化多肽或部分肽。
为了从培养的微生物或细胞中提取多肽或部分肽，培养后用已知方法收集微生物或细胞，悬浮于适当的缓冲溶液中，用超声波、溶茵酶和/或冻融等方法破坏细胞后，离心或过滤得到多肽或部分肽的粗提物。也可使用其他的常规提取或分离方法。缓冲溶液中可含有蛋白质变性剂，如尿素或盐酸胍或表面活性剂如Triton X-100(注册商标，下文常称作“TM”)。
当多肽或部分肽被分泌到培养基中时，在培养结束后将上清液与微生物分离开，并通过已知方法收集所得上清液。可适当地合用各种已知的分离和纯化方法以纯化含有多肽或部分肽的培养物上清液或提取物。各种已知的分离和纯化方法包括利用溶解度的方法如盐析，或主要利用分子大小或重量差异的溶剂沉降方法如透析、超滤、凝胶过滤及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；利用电荷差异的方法如离子交换层析；利用特异亲和性的方法如亲和层析；利用疏水性质差异的方法如反相高效液相层析，以及利用等电点差异的方法如等电电泳或层析聚焦等方法。
当如此得到的本发明的多肽为游离形式时，可用已知方法或这些方法的改良法将其转化成盐。相反，当所得多肽呈盐形式时，可用已知方法或这些方法的改良法将其转化成游离形式或其他的盐。
在纯化前或纯化后，可用适当的蛋白质修饰酶处理由转化体产生的本发明的多肽，以任意地修饰或除去部分多肽。可使用的蛋白质修饰酶例如是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、精氨酸内肽酶、蛋白质激酶或糖苷酶。
例如可以使用特异性抗体，以酶免疫检测法检测如此得到的本发明多肽的存在。
编码本发明多肽的DNA或本发明的多肽可用于①合成G蛋白偶联受体蛋白质的部分或全长度配体，②检查本发明多肽的生理学活性，③制备合成的寡核苷酸探针或PCR引物，④得到编码G蛋白偶联受体蛋白质的配体或前体蛋白质的DNA，⑤使用重组受体蛋白质表达系统发展受体结合试验系统，并筛选候选药物化合物，⑥得到抗体和抗血清，⑦开发利用DNA、RNA、抗体或抗血清的诊断试剂，⑧开发例如中枢神经系统功能调节剂、循环功能调节剂、免疫功能调节剂、胃肠功能调节剂、代谢功能调节剂或生殖功能调节剂，⑨基因治疗等。
具体地说，可使用受体结合试验系统(其中使用了下文所述的重组G蛋白偶联受体蛋白质表达系统)，将所说的DNA或多肽用于筛选人或温血动物特异性G蛋白偶联受体的激动剂或拮抗剂。可使用所说的激动剂或拮抗剂作为预防或治疗各种疾病的药剂。
进一步谈到上述应用⑧，由于本发明多肽或其编码DNA被例如中枢神经系统，循环系统、免疫系统、胃肠系统、代谢系统或生殖系统中表达的G蛋白偶联受体蛋白质识别为配体，因此其可用作安全和低毒性的药物。本发明的多肽或其编码DNA与中枢神经系统功能、循环系统功能、免疫功能、胃肠功能、代谢功能、生殖功能等有关，因此可用作各种疾病的治疗和/或预防剂，如用于治疗和/或预防各种类型的痴呆，如早老性痴呆、脑血管性痴呆、由于系谱变性退化性疾病(如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、皮克病、汉道顿氏病等)引起的痴呆、因感染性疾病(如Creutzfeldt-Jakob病等延迟性病毒感染)导致的痴呆、与内分泌疾病、代谢性疾病或中毒(如甲状腺功能减退、维生素B12缺乏、酒精中毒、各种药物、金属或有机化合物引起的中毒)有关的痴呆，由于肿瘤(如脑肿瘤)引起的痴呆以及由于创伤性疾病(如慢性脑膜下血肿)引起的痴呆、抑郁、活动过强性儿童综合症(脑过小病)、意识障碍、焦虑症、精神分裂症、恐怖症、生长激素分泌紊乱(如巨人症、肢端肥大症等)、饮食过多症、贪食症、高胆固醇血症、高甘油酯血症、高脂血症、高催乳素血症、糖尿病(如糖尿病性肾病、糖尿病性神经病、糖尿病性视网膜病等糖尿病并发症)、肿瘤(如乳腺癌、淋巴细胞性白血症、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌等)、胰腺炎、肾病(如慢性肾衰竭、肾炎等)、特纳氏综合症、神经官能症、类风湿性关节炎、脊髓损伤、一过性脑局部缺血、肌萎缩性侧索硬化、急性心肌梗塞、脊髓小脑退化、骨折、创伤、特应性皮炎、骨质疏松、哮喘、癫痫、不育症、动脉硬化、肺气肿、肺水肿及乳溢。其可进一步用作手术后营养状态改良剂或血管加压剂。
此外，其可用作治疗或预防HIV感染或爱滋病(获得性免疫缺陷综合症)的药物。
当以本发明的多肽或其编码DNA作为药物组合物时，可按常规方法使用之。例如，其可以片剂(必要时加有糖衣)、胶囊剂、酏剂、微胶囊等形式口服使用，或以可注射制剂如在水或其他药用液体中制成的无菌溶液或悬液的形式经非口服途径使用。可以将多肽、其部分肽或编码它们的DNA与生理可接受的载体、香味剂、赋形剂、载体、抗菌剂、稳定剂、粘结剂等，按一般制药工业适用的方式以单位剂量形式混合，从而得到这些制剂。这些制剂中活性成分的含量定在一个特定范围内的适当剂量。
当使用本发明的DNA时，可以单独使用DNA或将DNA插入到适当的载体如反转录病毒载体、腺病毒载体或腺病毒相关病毒载体中使用之。
可在片剂、胶囊剂等中混合的添加剂包括明胶、玉米淀粉、黄蓍胶和阿拉伯胶等粘结剂，结晶纤维素等赋形剂，玉米淀粉、明胶和海藻酸等溶胀剂，硬脂酸镁等润滑剂，蔗糖、乳糖和糖精等甜味剂，以及薄荷、akamono油和樱桃等香味剂。当单位剂量形式是胶囊时，上述材料可进一步掺入油和脂等液体载体。可以按制药工业的常规方法，例如将活性成分，天然植物油如芝麻油和椰子油溶解或悬浮于载体如注射用水中，以配制注射用的无菌组合物。
注射用含水液包括生理盐水和含有葡萄糖及D-山梨醇、D-甘露糖醇及氯化钠等其他辅助剂的等渗溶液，并可与合适的溶解助剂如醇例如乙醇、丙二醇和聚乙二醇等多元醇，非离子表面活性剂如多乙氧基醚(TM)和HCO-50等合用。油性液体包括芝麻油和大豆油，并可与苯甲酸苄酯和苯甲醇等助溶剂合用。此外，上述材料也可与磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液等缓冲液；洁尔灭、盐酸普鲁卡因等缓解剂；人血清白蛋白、聚乙二醇等稳定剂；苯甲醇、苯酚等防腐剂，及抗氧化剂等配制在一起。一般是将如此制备的可注射液体充入适当的安瓶中。因为如此得到的制剂是安全和低毒性的，所以可用于人或小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、羊、猪、牛、猫、狗、猴、狒狒、黑猩猩等温血哺乳动物。
对于一个成年肺气肿的病人(体重60kg)，根据病情不同，所说的多肽、其部分肽或其编码DNA的口服给药剂量一般为每天约0.1-100mg，较好1.0-50mg，更好约1.0-20mg。在非口服给药中，最好以可注射制剂的形式给予多肽、其部分肽或其编码DNA，对于成年肺气肿病人(体重60kg)，依据给药主体、靶器官、症状、给药方法的不同，一般每天静脉内注射约0.01-30mg，较好约0.1-20mg，更好约0.1-10mg。对于其他种动物，则可给予按60kg体重换算出的相应剂量。
本发明多肽的G蛋白偶联受体蛋白质可以是任何蛋白质，条件是其为衍生于人或温血动物(如兔、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、豚鼠、牛、马、猪等温血哺乳动物)、鸟类(如家禽、鸽、鸭、鹅、鹌鹑)的组织(如垂体、胰、脑、肾、肝、性腺、甲状腺、胆囊、骨髓、肾上腺、皮肤、肌肉、肺、消化道、血管、心脏)或细胞，并含有由SEQ ID No3代表之氨基酸序列或其实质性等同物的G蛋白偶联受体蛋白质。因此，作为G蛋白偶联受体蛋白质，不仅有含有SEQ ID No3所代表之氨基酸序列的蛋白质，而且还包括含有与SEQ ID No3所代表之氨基酸序列具有约90-99.9％同源性的氨基酸序列、并与含有SEQ ID No3所限定之氨基酸序列的蛋白质有性质上实质等同的活性的蛋白质，等等。
这些蛋白质所表现的活性包括配体结合活性、信号转导等。术语“实质上等同”是指在配体结合或其他活性方面性质上是等价的。因此，在配体结合活性强度和受体蛋白的分子量等定量因素上可能是有所变化的。
此外，G蛋白偶联受体蛋白质包括其中N末端Met被保护基团(如甲酰或乙酰等C1-6酰基)保护的蛋白质、体内裂解N末端的Gln并且所说的Gln被转化成焦谷氨酸残基所得到的蛋白质，其中分子内氨基酸的侧链被适当的保护基团(如甲酰或乙酰等C1-6酰基基团)保护的蛋白质，以及与糖链结合所得到的称为糖蛋白的结合蛋白质。
G蛋白偶联受体蛋白质的盐可以是上文对多肽述及的那些盐。
可以用已知的蛋白质纯化方法从人或温血动物组织或细胞中制得G蛋白偶联受体蛋白质或其盐，或由之衍生的部分肽。也可按上述包括培养带有编码该多肽之DNA的转化体的同样方法生产之。另外，可以按上述肽合成方法生产之。
关于由G蛋白偶联受体蛋白质衍生的上述部分肽，例如可使用暴露于细胞膜外的G蛋白偶联受体蛋白质的外表面区域。因此，其为含有在亲水性分析中确定为细胞外区域(亲水性位点)之G蛋白偶联受体蛋白质部分的肽。也可使用含有疏水位点部分的肽。可以使用各含一个这样的区域的肽以及包括多个这样的区域的肽。
作为衍生于G蛋白偶联受体蛋白质的片段肽的盐，可使用上述配体多肽的同样类型的盐。
编码G蛋白偶联受体蛋白质的DNA可以是任何DNA，条件是它包括编码含有SEQ ID No3代表之氨基酸序列或其实质性等同物的G蛋白偶联受体蛋白质的核苷酸序列。其可以是基因组DNA、基因组DNA库、组织或细胞衍生的cDNA、组织或细胞衍生的cDNA库、或合成DNA。用于文库构建的载体可以是噬菌体、质粒、粘粒、噬菌粒等。也可以按照已知的RT-PCR技术，使用由组织或细胞制备的RNA部分直接进行扩增。
具体地说，例如使用包括由SEQ ID No4代表的核苷酸序列的DNA作为编码含有SEQ ID No3限定之氨基酸序列的G蛋白偶联受体蛋白质的DNA。
以下举例说明本发明的多肽、编码所说多肽的DNA及抗该多肽的抗体的应用(1)作为治疗或预防配体多肽缺乏症的药物根据本发明的多肽具有的与G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)有关的活性，也可使用编码本发明多肽的DNA作为配体多肽或G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)缺乏症的预防或治疗剂。
因此，对于本发明多肽或G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)体内水平降低的病人，预计很难有其配体的充分表达的生理活性(中枢神经系统功能调节活性、循环功能调节活性、免疫功能调节活性、胃肠功能调节活性、代谢功能调节活性、生殖功能调节活性等)，故有可能通过(1)施用编码本发明之多肽的DNA，或(2)将编码本发明多肽的DNA插入到例如脑细胞中，从而引起其表达并在其后将脑细胞植入病人体内，以增加所说病人的脑细胞中配体多肽的水平，使配体多肽的所说的活性表达到足够程度。因此，可使用编码本发明多肽的DNA作为预防或治疗配体多肽缺乏综合症的安全而低毒性的药剂。
在使用上述DNA作为这样一种治疗剂时，可以利用上述对本发明的多肽或部分肽的编码DNA作为药物提及的同样方法，所说的DNA可以单独使用，或者也可将其插入到例如反转录病毒载体、腺病毒载体或腺病毒伴随病毒载体中使用。
(2)检测针对配体多肽的G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)本发明的多肽能够与G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)或其盐，或由之衍生的部分肽或其盐结合，因此可以良好的灵敏性用于检测体内G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)或其盐，或由之衍生的片段肽或其盐的水平。
该检测方法可以例如与竞争性结合技术合用。因此，可以使试验样品与本发明的多肽接触，以确定试验样品中，G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)或其盐，或由之衍生的部分肽或其盐的浓度。特别是可以按照下列文献①或②中描述的已知方法或其改良方法进行检测。①Hiroshi Irie(ed.)＂Radioimmunoassay＂(Kodansha出版，1974)；②Hiroshi Irie(ed.)＂Radioimmunoassay，A Sequel＂(Kodansha出版，1979)。
(3)筛选能够改变G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)与本发明的多肽，其酰胺或其酯或其盐(以下有时简称为配体或配体多肽)之间的结合的化合物可以使用G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)或其盐，或由之衍生的部分肽或其盐，或通过构建重组受体蛋白质(APJ)表达系统并使用受体结合试验系统(其中使用所说的表达系统)，筛选能够改变配体多肽与G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)、包括其盐结合的化合物(如肽、蛋白质、非肽化合物、合成的化合物、发酵产物等)。这样的化合物包括能够通过G蛋白偶联受体(APJ)表现细胞刺激活性(例如对花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内Ca2+释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、肌醇磷酸产生、细胞膜电势改变、细胞内蛋白质磷酸化、c-fos活化、pH抑制的促进剂或抑制剂作用)的化合物(即G蛋白偶联受体激动剂)，以及没有细胞刺激活性的化合物(即G蛋白偶联受体拮抗剂)。术语“能够改变与配体的结合”包括抑制与配体的结合和促进与配体的结合两种情况。
因此，本发明提供一种筛选能够改变本发明的多肽与上述G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)的结合的化合物或其盐的方法，其包括，一方面(ⅰ)使本发明的配体与G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)或其盐，或由之衍生的部分肽或其盐接触，另一方面(ⅱ)使本发明的多肽和试验化合物与上述G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)或其盐，或由之衍生的部分肽或其盐接触，并将(ⅰ)和(ⅱ)两种情况下的结合相比较。
在本发明的筛选方法中，(ⅰ)使本发明的多肽与上述G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)或由之衍生的的部分肽接触，并且(ⅱ)使本发明的多肽和试验化合物与上述G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)或由之衍生的部分肽接触，并在(ⅰ)或(ⅱ)的情况下检测配体与所说的G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)或由之衍生的部分肽的结合水平，或任何所说的细胞刺激活性，并在两者间进行比较。
筛选方法具体地包括①筛选能够改变本发明的多肽与上述G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)之结合的化合物或其盐的方法，其包括一方面使标记形式的本发明的多肽与G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)或其盐，或由之衍生的部分肽或其盐接触，并且另一方面使标记的本发明的多肽和试验化合物与上述G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)或其盐，或由之衍生的部分肽或其盐接触，在两种情况下检测标记的本发明的多肽与G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)或其盐，或由之衍生的部分肽或其盐的结合水平，并在两者间进行比较；②筛选能够改变本发明的多肽与含有G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)之结合的化合物或其盐的方法，其包括一方面使标记形式的本发明的多肽与含有G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)的细胞或所说细胞的膜部分接触，并且另一方面使标记的本发明的多肽和试验化合物与含这样的G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)的细胞或膜部分接触，在两种情况下检测标记的本发明的多肽与所说的细胞或膜部分的结合，并在两者间进行比较；③筛选能够改变本发明的多肽与上述G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)之结合的化合物或其盐的方法，其包括一方面使标记形式的本发明的多肽与培养携带有编码G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)之DNA的转化体时于细胞膜上表达的G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)接触，并且另一方面使标记的本发明的多肽和试验化合物与培养携带有编码G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)之DNA的转化体时于细胞膜上表达的G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)接触，在两种情况下检测标记的本发明的多肽与所说的G蛋白偶联受体蛋白质的结合，并在两者间进行比较。④筛选能够改变本发明的多肽与上述G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)之结合的化合物或其盐的方法，其包括一方面使能够活化G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)的化合物(如本发明的多肽)与含有G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)的细胞接触，另一方面使能够活化G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)的化合物和试验化合物与这样的含G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)的细胞接触，在两种情况下检测G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)介导的细胞刺激活性(例如对花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内Ca2+释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、肌醇磷酸产生、细胞膜电势改变、细胞内蛋白质磷酸化、c-fos活化、pH抑制的促进剂和抑制剂作用)，并在两者间进行比较；⑤筛选能够改变本发明的多肽与上述G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)之结合的化合物或其盐的方法，其包括一方面使能够活化G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)的化合物(例如本发明的多肽)与培养含有编码G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)之DNA的转化体时在细胞膜上表达的G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)接触，另一方面使能够活化G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)的化合物和试验化合物与培养含有编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的转化体时在细胞膜上表达的G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)接触，在两种情况下检测G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)介导的细胞刺激活性(例如对花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内Ca2+释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、肌醇磷酸产生、细胞膜电势改变、细胞内蛋白质磷酸化作用、c-fos活化、pH抑制的促进剂和抑制剂作用)，并在两者间进行比较；等等。
对本发明筛选方法的特别举例说明如下。
首先，将用于本发明的筛选方法中的G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)可以是任何来源的，条件是它含有上述的G蛋白偶联受体蛋白质或由之衍生的部分肽。人或温血动物器官衍生的膜部分是适用的。然而，由于人器官的材料很难得到，所以最好使用由重组体以高水平表达产生的G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)。
例如，可用上述方法生产G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)。
在实现本发明的筛选方法时，如果使用含有G蛋白偶联受体蛋白质的细胞或所说细胞的膜部分，可参照下述制备步骤。
当使用含有G蛋白偶联受体蛋白质的细胞时，可按照已知方法用戊二醛、福尔马林等固定细胞。
含有G蛋白偶联受体蛋白质的细胞是在其中表达G蛋白偶联受体蛋白质的宿主细胞。所说的宿主细胞可以是前述的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等。
膜部分是经破碎细胞后按照已知技术制得的富含细胞膜的部分。破坏细胞的方法可以是使用Potter Elvehjem型匀浆器压挤细胞、使用Waring Blendor或Polytron(Kinematica)破碎细胞、用超声波破碎细胞，以及用French Press通过狭小喷嘴施加压力(进行喷压)以破坏细胞。为分级分离细胞膜部分，例如可使用分级离心或密度梯度离心法靠离心力分离之。例如，以低转速(500rpm至3，000rpm)短时间(一般约1-10分钟)离心上清液分离细胞裂解混合物，然后以高速度(15，000rpm至30，000rpm)离心上清液30分钟至2小时，得到的沉淀作为膜部分。表达的G蛋白偶联受体蛋白质及其他膜成分，如细胞衍生的磷脂和膜蛋白均富集在所说的膜部分中。
含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞或膜部分中G蛋白偶联受体蛋白质的含量优选为每细胞103-108个分子，更好为每细胞105-107个分子。当表达水平高时，膜部分就具有高的配体结合活性(比活性)，因此不仅有可能构建成一个高敏感性的筛选系统，而且还可使用同一批号制剂检测大量样品。
在实践筛选能够改变本发明的多肽与G蛋白偶联受体蛋白质之结合的化合物的上述①至③的方法中，使用适当的G蛋白偶联受体部分和标记形式的本发明的多肽。理想的G蛋白偶联受体部分是天然G蛋白偶联受体蛋白质、活性上等同于所说的天然部分的G蛋白偶联受体蛋白质等。术语“活性上等同的”是指在例如配体结合活性上是等同的。标记的配体另外还包括标记的配体类似物等。例如，可使用[3H]、[125I]、 [14C]或[35S]标记的配体。
具体地说，在筛选能够改变本发明的多肽与G蛋白偶联受体蛋白质之结合的化合物中，首先将含有G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)的细胞或所说细胞的膜部分悬浮于适于筛选的缓冲液中，以制备受体标准品。缓冲液可以是不能抑制配体-受体结合并且pH为4-10(较好6-8)的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液或任何其他缓冲液。为了减少非特异性结合，可以向缓冲液中加入CHAPS、TWEEN-80TM(Kao-Atlas)、毛地黄皂苷或脱氧胆酸等表面活性剂。为了防止受体或本发明的多肽被蛋白酶分解，可进一步加入PMSF、亮抑蛋白酶肽、E-64(Peptide Insbitute)或胃酶抑制剂等蛋白酶抑制剂。向0.01ml至10ml所说的受体溶液中加入预定量(5，000cpm至500，000cpm)的标记的本发明多肽，同时使其中共存有10-4-10-1μm的试验化合物。为了确定非特异性结合(NSB)，还制备加有大大过量的未标记的本发明多肽的反应管。反应在0℃至50℃，较好在4℃至37℃下进行20分钟至24小时，较好进行30分钟至3小时。反应后，通过玻璃纤维滤纸等过滤各反应混合物，并用适当量的同样缓冲液洗涤，然后使用液闪计数器或γ计数器检测玻璃纤维滤膜上的放射活性。当将没有任何拮抗物质情况下测得的计数(Bo)减去非特异性结合，即计数(Bo-NSB)取作100％时，则显示特异性结合(B-NSB)不超过例如计数(Bo-NSB)之50％的试验化合物即可被选作可能具有拮抗或抑制活性的候选物质。
在实施上述筛选能够改变本发明的多肽与G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)之结合的化合物的方法④或⑤中，可以使用已知方法或市售检测试剂盒检测G蛋白偶联受体蛋白质介导的细胞刺激活性(例如对花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内Ca2+释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、肌醇磷酸产生、细胞膜电位改变、细胞内蛋白质磷酸化、c-fos活化、pH抑制的促进剂或抑制剂作用)。具体地说，首先在多孔平板等上培养含有G蛋白偶联受体蛋白质的细胞。进行筛选前，更换新鲜培养基或对细胞未显示毒性的适当的缓冲液。然后加入试验化合物时，培养预定时间后，提取细胞并回收上清液，并用相应方法检测所产生的产物。如果由于细胞中含有分解酶，而难以利用某种物质(如花生四烯酸)的形成作为检测细胞刺激活性的指征，则可预先加入抗所说的分解酶的抑制剂，并在抑制剂存在下完成检测。至于cAMP产生的抑制活性等，可根据对细胞的cAMP产生抑制活性来检测所说的活性(所说的细胞中已用毛喉素增加了基础产生量)。
为了基于检测细胞刺激活性来进行筛选，需要有其中表达了G蛋白偶联受体蛋白质的适当细胞。根据本发明使用的其中有G蛋白偶联受体蛋白质表达的细胞，最好是上述重组G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)表达细胞系的细胞。
作为试验化合物，例如可以是肽、蛋白质、非肽类化合物、合成的化合物、发酵产物、细胞提取物、植物提取物、动物组织提取物等。这些化合物可以是新的化合物或已知化合物。
筛选能够改变本发明的多肽与G蛋白偶联受体蛋白质之结合的化合物或其盐的试剂盒，包括G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)或其盐、由G蛋白偶联受体蛋白质衍生的部分肽或其盐、含有G蛋白偶联受体蛋白质的细胞、含有G蛋白偶联受体蛋白质之细胞的膜部分，以及本发明的多肽。
作为本发明的筛选试剂盒的实例，可描述如下1．筛选试剂①检测缓冲液和洗涤缓冲液添加0.05％牛血清白蛋白(Sigma)的Hank＇s平衡盐溶液。该溶液通过0.45μm孔径的滤器过滤除菌并于4℃储存。其可于用前临时制备。
②G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)标准品将其中有G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)表达的CHO细胞传代培养在12孔平板上(5x105细胞/孔)，在37℃和5％CO2+95％空气条件下培养2天。
③标记的配体用[3H]、[125I]、[14C]、[35S]等标记配体。将其溶解于适当的溶剂或缓冲液中并于4℃或-20℃下储存，使用时临时用检测缓冲液稀释到1μM。
④标准配体溶液将本发明的多肽溶解于含有0.1％牛血清白蛋白(Sigma)的PBS中，达到1mM浓度并于-20℃保存。2．检测方法①用两份1ml检测缓冲液洗涤培养于12孔组织培养板上的表达G蛋白偶联受体蛋白质的细胞，然后向各孔内加入490μl检测缓冲液。
②加入5μl 10-3-10-10M试验化合物溶液，然后加入5μl标记形式的本发明的多肽，并使反应于室温下进行1小时。为了确定非特异性结合，加入5μl 10-3M配体溶液以代替试验化合物。
③除去反应溶液并用3份1ml等分的洗涤缓冲液洗各孔。使用0.2NNaOH-1％SDS溶解细胞结合的标记的配体，并将溶液与4ml液体闪烁液A(Wako Pure Chemical Industries)混合。
④使用液体闪烁计数器(Beckman)检测放射活性，并按如下公式以最大结合百分数(PMB)表示检测结果。
PMB=[(B-NSB)/(Bo-NSB)]×100其中PMB最大结合百分数；B加试验化合物时测得的数值；NSB非特异性结合；Bo最大结合。
使用本发明的筛选方法或筛选试剂盒得到的化合物(包括其盐)是能够改变(抑制或促进)本发明的多肽与G蛋白偶联受体(APJ)之结合的化合物，更具体地说，是显示有G蛋白偶联受体介导之细胞刺激活性的化合物或其盐(所谓G蛋白偶联受体激动剂)，或是没有这样的细胞刺激活性的化合物或其盐(所谓G蛋白偶联受体拮抗剂)。作为所说的化合物，可提到的有肽、蛋白质、非肽类化合物、合成的化合物、发酵产物化合物等。这些化合物可以是新的或是已知的。
就所研究的化合物是否可判定为上述G蛋白偶联受体激动剂或拮抗剂而言，可概括为下述(ⅰ)或(ⅱ)两种情况。(ⅰ)在完成上文①至③中指出的结合试验，以得到能够改变(特别是抑制)本发明的多肽与G蛋白偶联受体之结合的化合物后，就其是否具有所说的G蛋白偶联受体介导的细胞刺激活性检验所说的化合物。具有这样的细胞刺激活性的化合物或其盐即为G蛋白偶联受体激动剂，而没有这样活性的化合物或其盐则是G蛋白偶联受体拮抗剂。(ⅱ)(a)使试验化合物与含有G蛋白偶联受体蛋白质的细胞接触，并检测上述G蛋白偶联受体介导的细胞刺激活性。具有这样的细胞刺激活性的化合物或其盐就是G蛋白偶联受体激动剂。
(b)使能够活化G蛋白偶联受体的化合物(如本发明的多肽或G蛋白偶联受体激动剂)与含有G蛋白偶联受体蛋白质的细胞接触。另一方面，使能够活化G蛋白偶联受体的化合物和试验化合物与含有G蛋白偶联受体蛋白质的细胞接触。在两种情况下，检测G蛋白偶联受体介导的细胞刺激活性水平，并彼此比较。降低能够活化G蛋白偶联受体之化合物的细胞刺激活性的化合物或其盐即为G蛋白偶联受体拮抗剂。
所说的G蛋白偶联受体激动剂对G蛋白偶联受体蛋白质来说具有如本发明的多肽一样的生理活性，因此其可以如本发明的多肽一样的方式被用作安全而低毒性的药物。
相反，G蛋白偶联受体拮抗剂则抑制本发明的多肽所具有的针对G蛋白偶联受体蛋白质的生理学活性，因此其可作为抑制所说的受体活性的安全而低毒的药物。
由于本发明的多肽参与调节中枢神经系统功能、循环功能、免疫功能、胃肠功能、代谢功能、生殖功能等，所以可使用上述激动剂或拮抗剂作为治疗或预防各种疾病的药剂，如用于治疗和/或预防各种类型的痴呆，如早老性痴呆、脑血管性痴呆、由于系谱变性退化性疾病(如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、皮克病、汉道顿氏病等)引起的痴呆、因感染性疾病(如Creutzfeldt-Jakob病等延迟性病毒感染)导致的痴呆、与内分泌疾病、代谢性疾病或中毒(如甲状腺功能减退、维生素B12缺乏、酒精中毒、各种药物、金属或有机化合物引起的中毒)有关的痴呆，由于肿瘤(如脑肿瘤)引起的痴呆，以及由于创伤性疾病(如慢性硬膜下血肿)引起的痴呆、抑郁、活动过强性儿童综合症(脑过小病)、意识障碍、焦虑症、精神分裂症、恐怖症、生长激素分泌紊乱(如巨人症、肢端肥大症等)、饮食过多症、贪食症、高胆固醇血症、高甘油酯血症、高脂血症、高催乳素血症、糖尿病(如糖尿病性肾病、糖尿病性神经病、糖尿病性视网膜病等糖尿病并发症)、肿瘤(如乳腺癌、淋巴细胞性白血症、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌等)、胰腺炎、肾病(如慢性肾衰竭、肾炎等)、特纳氏综合症、神经官能症、类风湿性关节炎、脊髓损伤、一过性脑局部缺血、肌萎缩性侧索硬化、急性心肌梗塞、脊髓小脑退化、骨折、创伤、特应性皮炎、骨质疏松、哮喘、癫痫、不育症、动脉硬化、肺气肿、肺水肿及乳溢。其可进一步用作安眠药、镇静剂、手术后营养状态改良剂、血管加压剂、降血压剂等。
此外，其可用作治疗或预防HIV感染或爱滋病(获得性免疫缺陷综合症)的药物。
使用上述筛选方法或筛选试剂盒得到的适用的化合物的盐例如是药学上可接受的盐。作为实例，可提到的有与无机或有机碱形式的盐、与无机或有机酸形成的盐，以及与碱性或酸性氨基酸形成的盐。
与无机碱形成的盐的例子有，碱金属盐如钠盐和钾盐，碱土金属盐如钙盐和镁盐，铝盐和铵盐。
与有机碱形成的盐的例子有与三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、2，6-二甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、环己胺、二环己胺、N，N’-二苄基乙基二胺等形成的盐。
与无机酸形成的盐的例子有，与盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等形成的盐。
与无机酸形成的盐的例子有，与盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等形成的盐。
与有机酸形成的盐的例子有，与甲酸、乙酸、丙酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、苯甲酸等形成的盐。
与碱性氨基酸形成的盐的例子有，与精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等形成的盐。与酸性氨基酸形成的盐的例子有，与天冬氨酸、谷氨酸等形成的盐。
使用本发明的筛选方法或筛选试剂盒得到的化合物或其盐，可以如本发明的多肽一样作为用于上述治疗和预防目的药物。
(5)制造抗本发明多肽的抗体或抗血清可按照本领域技术人员已知的抗体或抗血清制造方法或其相似方法，使用本发明的多肽作为抗原制造抗本发明多肽的抗体，如多克隆抗体、单克隆抗体和抗血清。
例如，可使用下述方法制造多克隆抗体。[多克隆抗体的制备]可以按照已知方法或其改良方法制备抗本发明的受体蛋白质等的多克隆抗体。例如，制备免疫原(针对受体蛋白质等的抗原)本身或其与载体蛋白质形成的复合物，并按照生产单克隆抗体的同样方法免疫哺乳动物。从被免疫动物体内回收含有抗本发明受体蛋白质之抗体的材料，并分离和纯化抗体。
关于用于免疫哺乳动物的免疫原与载体蛋白质的复合物，就有效地产生抗半抗原(其在载体上交联并用于免疫)的抗体而言，可使用任何载体蛋白质和载体与半抗原的任何混合比例。例如，可以按大约0.1至20份，较好大约1至5份对1份半抗原的重量比，使牛血清白蛋白、牛环状球蛋白(Cycloglobulin)、匙孔血兰蛋白等偶联到半抗原上。
此外，可使用各种缩合剂进行半抗原与载体的偶联。例如，缩合剂可以是戊二醛、碳化二亚胺、顺丁烯二酰亚胺活化的酯、含有巯基或二硫吡啶基的活化的酯试剂等。
将缩合产物或连同适当的载体或稀释剂一起施用于允许抗体产生的哺乳动物某部位。为了提高抗体产生率，可施用完全或不完全弗氏佐剂。一般情况下，每2-6周施用一次该蛋白质等，共施用约3至10次。
从按上述方法免疫的动物的血液、腹水等中，最好从血液中回收多克隆抗体。
可以按照检测杂交瘤培养物上清的同样方法检测抗血清中多克隆抗体的滴度。可按照如单克隆抗体部分制备免疫球蛋白的方法分离和纯化抗体。
可按下述方法生产单克隆抗体。[单克隆抗体的制备](a)制备单克隆抗体产生细胞。
在可能于施用药后产生抗体的部位，将本发明的多肽单独或连同载体或稀释剂施用于温血动物。为了增加抗体产生，可施用完全或不完全弗氏佐剂。通常每2-6周给药一次，共施用2-10次。可利用的温血动物包括猴、兔、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、绵羊、山羊和鸡，并且最好是小鼠和大鼠。
在制备产生单克隆抗体的细胞时，从用抗原免疫的温血动物(如小鼠)中选择记录到抗体滴度的动物，于末次免疫后2-5天收集脾脏和淋巴结，将其中所含有的抗体生产细胞与骨髓瘤细胞融合，以得到产生单克隆抗体的杂交瘤。例如可使标记的配体多肽或标记的G蛋白偶联受体蛋白质(下文中将提到)与抗血清反应，然后检测标记剂与抗体的结合活性，从而完成对抗血清中抗体滴度的测定。例如可按照Koehler和Milstein(自然256，495，1975)的方法完成融合操作。融合加速剂包括聚乙二醇(PEG)、仙台病毒等，但最好使用PEG。
骨髓瘤细胞包括NS-1、P3U1、SP2/0、AP-1等，其中最好是使用P3U1。所使用的抗体产生细胞(脾细胞)数目对骨髓瘤细胞的优选融合比例为约1∶1至20∶1。当以大约10-80％的浓度加入PEG(最好是PEG1000至PEG6000)，于20-40℃(最好30-37℃)下保温1-10分钟时，可完成有效的细胞融合。
可用各种方法筛选能产生抗G蛋白偶联受体抗体或抗配体多肽抗体的杂交瘤。例如，将骨髓瘤培养物的上清液加到已直接或通过载体吸附了配体多肽抗原或G蛋白偶联受体蛋白质抗原的固相(如微量板)上，然后向其中加入用放射活性物质、酶等标记的抗免疫球蛋白抗体(当用于细胞融合的细胞是小鼠细胞时，使用抗小鼠免疫球蛋白抗体)，或蛋白A，然后检测结合于固相上的抗配体多肽单克隆抗体或抗G蛋白偶联受体单克隆抗体；或者将杂交瘤培养物的上清液加到吸附了抗免疫球蛋白或蛋白A的固相中，然后加入用放射活性物质或酶标记的本发明的多肽，并检测与固相结合的抗多肽单克隆抗体。
可以用本领域技术人员已知的方法或相似方法选择并克隆产生抗多肽单克隆抗体的杂交瘤。通常在含有HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷)的动物细胞培养基中进行。用于选择、克隆和细胞生长的培养基可以是杂交瘤能够在其中生长的任何培养基。例如可以是含有1-20％(优选10-20％)胎牛血清(FCS)的RPM11640培养基(Dainippon PharmaceuticalCoLtdJapan)，含有1-20％胎牛血清的GIT培养基(Wako PureChemical，Japan)和用于培养杂交瘤的无血清培养基(SFM-101；NissuiSeiyaku，Japan)。培养温度通常为20-40℃，最好约37℃。培养时间通常为5天到3周，最好为1-2周。培养通常是在5％二氧化碳气体中完成。可使用上述检测抗血清中抗多肽抗体滴度的同样方法检测杂交瘤培养物上清液的抗体滴度。
(b)纯化单克隆抗体。
同分离/纯化常规单克隆抗体一样，可使用盐析、乙醇沉淀、等电沉淀、电泳、使用离子交换剂如DEAE吸附/解吸附、超滤、凝胶过滤、特异性纯化法(其中用活性吸附剂如抗原结合固相、蛋白A或蛋白G处理以只收集抗体，解离键后得到抗体)等分离/纯化免疫球蛋白的方法，分离/纯化抗多肽单克隆抗体。
用上述方法(a)或(b)制造的多肽抗体能够特异性地识别多肽，因此其可用于定量检测液体试验样品中的多肽，特别是用于夹心免疫检测法进行定量检测。
因此，本发明提供例如下列方法(ⅰ)定量检测液体试验样品中的本发明的多肽，其包括(a)使液体试验样品和标记的本发明多肽与抗体(其可与配体多肽或G蛋白偶联受体反应)竞争性反应，并且(b)检测与所说抗体结合的标记的本发明多肽的比例。(ⅱ)定量检测液体试验样品中本发明的多肽，其包括(a)使液体试验样品与固定于不溶性载体上的抗体和标记的抗体同时或相继反应，并且(b)检测不溶性载体上标记剂的活性，其中一种抗体能够识别本发明之多肽的N末端区域，而另一种抗体能够识别本发明之多肽的C末端区域。
当使用识别本发明之多肽的本发明的单克隆抗体时，可检测本发明的多肽并可另外借助组织染色法等检测之。为此目的，可使用抗体分子本身，或者也可使用抗体分子的F(ab＇)2＇，Fab＇或Fab部分。对使用本发明的抗体的检测方法没有特殊限制，任何检测方法均可使用，只要该方法是通过化学或物理手段检测，然后使用含有已知量抗原的标准溶液制备的标准曲线计算待检液体样品中抗原、抗体或依赖于或相对于抗原量(如本发明的多肽量)的抗体-抗原复合物量即可。例如，可使用浊度法、竞争法、免疫检测法和夹心法，但从敏感性和特异性上看，特别优选的是下文将描述的夹心法。
在使用标记物质的检测方法中，所使用的标记剂可以是放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质、胶体、磁性物质等。放射性同位素的例子包括[125I]、[131I]、[3H]和[14C]；优选的酶是稳定的并且有大的比活性的酶，如β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶和苹果酸脱氢酶；荧光物质的例子包括荧光胺、异硫氰酸荧光素等；发光物质的例子包括鲁米诺、鲁米诺衍生物、萤光素、硝酸双-N-甲基吖啶等。此外，生物素-抗生物素蛋白系统也可用于抗体或抗原与标记剂的结合。
在固定抗原或抗体中，可使用物理吸附或通常用来固定或固相化处理蛋白质或酶的化学结合方法。载体可以是琼脂糖、葡聚糖和纤维素等不溶性多糖；聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等合成树脂，以及硅氧烷、玻璃等。
在夹心(或双位点)法中，使试验液体与固定化的抗多肽抗体反应(第一反应)，然后与标记的抗多肽抗体反应(第二反应)，并检测不溶性载体上标记剂的活性，从而确定试验液体中本发明受体多肽的量。第一和第二反应可以反过来进行，或同时进行或间隔进行。标记剂和固定化方法可以是与上述相同的方法。在借助夹心法进行的免疫检测中，用于标记的抗体和用于固相化的抗体并不一定是一种类型或一种，但为了改善检测敏感性，也可使用二种或多种抗体的混合物。
在以本发明的夹心法检测本发明的多肽时，用于第一和第二反应的优选抗多肽抗体是其中与本发明的多肽结合的位点彼此不同的抗体。因此，用于第一和第二反应的抗体是这样的抗体，即其中当用于第二反应的抗体识别本发明之多肽的C末端区域时，则在第一反应中最好使用识别C末端区域以外之位点，如识别N末端区域的抗体。
本发明的抗多肽抗体也可用于夹心法以外的其他检测系统中，如用于竞争法、免疫测定法及浊度法中。在竞争法中，使试验溶液中的抗原和标记的抗原以竞争方式与抗体反应，然后分离未反应的标记抗原(F)和与抗体结合的标记抗原(B)(即B/F分离)，并检测标记的B和F的量，从而确定试验溶液中抗原的量。就这一反应的方法来说，可有液相法和固相法。液相法中以可溶性抗体作为抗体并使用聚乙二醇、抗上述抗体的第二抗体等进行B/F分离，固相法中以固相化抗体作为第一抗体，或以可溶性抗体作为第一抗体，而以固相化抗体作为第二抗体。
在免疫测定法中，使试验溶液中的抗原和固相化抗原与一定量标记的抗体竞争反应，然后分离出液相和固相；或者使试验溶液中的抗原和过量标记抗体反应，然后加入固定化的抗原以用固相结合未反应的标记的抗体，并分离出固相和液相。此后，检测任何相的标记量并确定试验溶液中的抗原量。
在浊度法中，检测凝胶中或溶液中由抗原-抗体反应所产生的不溶性沉淀物的量。即使试验溶液中的抗原量很小并且只得到很小量的沉降物，也可使用其中利用激光散射的激光浊度检测法。
在将各种免疫学检测方法用于本发明的检测法中，不必设定任何特殊条件及其操作等。可以根据本领域技术人员认定的常规条件和操作方法建立本发明多肽的检测系统。有关常规技术手段，可参见多种综述、教科书等。例如Hiroshi Irie(ed)＂放射免疫测定＂(Kodansha，Japan，1974)；Horoshi Irie(ed)＂放射免疫测定；第二部分＂)Kodansha，Japan，1979)；Eiji Ishikawa等人(ed)＂酶免疫测定＂(Igaku Shoin，Japan，1978)；Eiji Ishikawa等人(ed)s＂酶免疫测定＂(第二版)(IgakuShoin，Japan，1982)；Eiji Ishikawa等(编)“酶免疫测定”(第三版)(Igaku Shoin，Japan，1987)；“酶学方法”，70卷(免疫化学技术(A部分))；同上，73卷(免疫化学技术(B部分))；同上，74卷(免疫化学技术(C部分))；同上，84卷(免疫化学技术(D部分；筛选免疫测定))；同上，92卷(免疫化学技术(E部分单克隆抗体与一般免疫测定法))；同上，121卷(免疫化学技术(I部分杂交瘤技术和单克隆抗体))(Academic Press)，等。
这样，可使用本发明的抗多肽抗体，以高精确度确定本发明多肽的量。因此，本发明的抗体可用于多种疾病的诊断，例如痴呆、抑郁、活动过强性儿童综合症(脑过小病)、意识障碍、焦虑症、精神分裂症、恐怖症、生长激素分泌紊乱、饮食过多症、贪食症、高胆固醇血症、高甘油酯血症、高脂血症、高催乳素血症、糖尿病、肿瘤、胰腺炎、肾病、特纳氏综合症、神经官能症、类风温性关节炎、脊髓损伤、一过性脑局部缺血、肌萎缩性侧索硬化、急性心肌梗塞、脊髓小脑退化、骨折、创伤、特应性皮炎、骨质疏松、哮喘、癫痫、不育症、动脉硬化、肺气肿、肺水肿、乳溢、爱滋病等。
在本说明书和附图中，所使用的碱基(核苷酸)、氨基酸等的缩写是由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的或本领域习惯使用的。以下给出这些缩写的例子。可能存在光学异构体的氨基酸，除特别指出者外，均为L型。
DNA脱氧核糖核酸cDNA互补脱氧核糖核酸A腺嘌呤T胸腺嘧啶G鸟嘌呤C胞嘧啶Y胸腺嘧啶或胞嘧啶N胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤R腺嘌呤或鸟嘌呤M胞嘧啶或腺嘌呤W胸腺嘧啶或腺嘌呤S胞嘧啶或鸟嘌呤RNA核糖核酸mRNA信使核糖核酸dATP脱氧腺苷三磷酸dTTP脱氧胸苷三磷酸dGTP脱氧鸟苷三磷酸dCTP脱氧胞苷三磷酸ATP腺苷三磷酸
EDTA乙二胺四乙酸SDS十二烷基硫酸钠EIA酶免疫检测法G，Gly甘氨酸(或甘氨酰)A，Ala丙氨酸(或丙氨酰)V，Val缬氨酸(或缬氨酰)L，Leu亮氨酸(或亮氨酰)I，Ile亮异氨酸(或异亮氨酰)S，Ser丝氨酸(或丝氨酰)T，Thr苏氨酸(或苏氨酰)C，Cys半胱氨酸(或半胱氨酰)M，Met蛋氨酸(或蛋氨酰)E，Glu谷氨酸(或谷氨酰)D，Asp天冬氨酸(或天冬氨酰)K，Lys赖氨酸(或赖氨酰)R，Arg精氨酸(或精氨酰)H，His组氨酸(或组氨酰)F，Phe苯丙氨酸(或苯丙氨酰)Y，Tyr酪氨酸(或酪氨酰)W，Trp色氨酸(或色氨酰)P，Pro脯氨酸(或脯氨酰)N，Asn天冬酰胺(或天冬酰胺酰)Q，Gln谷氨酰胺(或谷氨酰胺酰)pGlu焦谷氨酸(或焦谷氨酰)Me甲基Et乙基Bu丁基
Ph苯基TC噻唑烷基-4-(R)-甲酰胺Bom苄氧基甲基NMPN-甲基吡咯烷酮PAM苯基乙酰氨甲基本说明书中，以下列缩写字指示常用的取代基、保护基团及试剂Tos对甲苯磺酰基HONBN-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺OcHex环己酯Bzl苄基Z苄氧基羰基Br-Z2-溴苄氧基羰基C1-Z2-氯苄氧基羰基Boc叔丁氧基羰基HOBt1-羟基苯并三唑DCCN，N＇-二环己基羰化二亚胺TFA三氟乙酸FmocN-9-芴甲氧基羰基DNP二硝基苯基Bum叔丁氧基甲基Trt三苯甲游基MeBzl4-甲基苄基本说明书序列表中列出的各个SEQ ID No是指以下序列[SEQ ID No1]是牛配体多肽的氨基酸序列(N末端开始的17个氨基酸)。
是编码包括SEQ ID No1所代表之氨基酸序列的多肽的完整核苷酸序列。
是由G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)的cDNA编码之G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)的完整氨基酸序列。
是G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)cDNA的完整核苷酸序列。
是筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码小鼠配体多肽之cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码小鼠配体多肽之cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码小鼠配体多肽之cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码小鼠配体多肽之cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码小鼠配体多肽之cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码小鼠配体多肽之cDNA的合成DNA引物。
是由小鼠配体多肽的cDNA编码的氨基酸序列。
是编码小鼠配体多肽之cDNA的核苷酸序列。
是筛选编码牛配体多肽之cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码牛配体多肽之cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码大鼠配体多肽之cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码大鼠配体多肽之cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码大鼠配体多肽之cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码大鼠配体多肽之cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码人配体多肽的cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码人配体多肽的cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码人配体多肽的cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码人配体多肽的cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码人配体多肽的cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码人配体多肽的cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码人配体多肽的cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码人配体多肽的cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码牛配体多肽之cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码牛配体多肽之cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码牛配体多肽之cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码牛配体多肽之cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码牛配体多肽之cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码牛配体多肽之cDNA的合成DNA引物。
是筛选编码牛配体多肽之cDNA的合成DNA引物。
是由大鼠配体多肽的cDNA编码的氨基酸序列。
是编码大鼠配体多肽之cDNA的核苷酸序列。
是由人配体多肽的cDNA编码的氨基酸序列。
是编码人配体多肽之cDNA的核苷酸序列。
是由牛配体多肽的cDNA编码的氨基酸序列。
是编码牛配体多肽之cDNA的核苷酸序列。
下文实施例11中得到的，称为JM109/pMA10L-13的转化体大肠杆菌已按照布达佩斯条约的规定，自1997年12月22日保藏于日本国际贸易和工业部，工业科学和技术局，国立生命科学与人类技术研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology(NIBH)，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry of InternationalTrade and Industry，Japan)。指定的保藏登记号为FERMBP-6214。
下文实施例13中得到的，称为JM109/prSHe-1的转化体大肠杆菌已按照布达佩斯条约规定，自1998年1月20日保藏于NIBH，指定的保藏登记号为FERMBP-6228。
下文实施例14中得到的，称为JM109/phSuN-4的转化体大肠杆菌，已按照布达佩斯条约的规定自1998年1月20日保藏于NIBH，指定的保藏登记号为FERMBP-6229。
下文实施例15得到的，称为JM109/pBovA10prec24的转化体大肠杆菌，已按照布达佩斯条约的规定自1998年1月20日保藏于NIBH，指定的保藏登记号为FERMBP-6230。
下文实施例35得到的，称为BL21(DE3)/pTB960-13的转化体大肠杆菌，已按照布达佩斯条约的规定自1998年12月2日保藏于NIBH，指定的保藏登记号为FERMBP-6590，并自1998年11月11日保藏于大版发酵研究所，保藏登记号为IFO16220。实施本发明的最好方式下列实施例旨在进一步详细描述本发明，而不应视为对本发明范围的限定。
制备用于扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的合成DNA引物相互比较各自编码下列已知受体蛋白质之第一跨膜区附近氨基酸序列的cDNA核苷酸序列，并找出有高度相似的片段人衍生的TRH受体蛋白质(HTRHR)、人衍生的RANTES受体蛋白质(L10918、HUMRANTES)、人Burkitt氏淋巴瘤衍生的未知配体的受体蛋白质(X68149，HSBLRIA)、人衍生的促生长素抑制素受体蛋白质(L14856，HUMSOMAT)、大鼠衍生的μ-阿片样物质受体蛋白质(U02083，RNU02083)、大鼠衍生的κ-阿片样物质受体蛋白质(U00442，U00442)、人衍生的神经调节肽B受体蛋白质(M73482，HUMNMBR)、人衍生的毒覃碱能乙酰胆碱受体蛋白质(X15266，HSHM4)、大鼠衍生的肾上腺素α1B受体蛋白质(LO8609，RATAADRE01)、人衍生的促生长素抑制素3受体蛋白质(M96738，HUNSSTR3X)、人衍生的C5a受体蛋白质(HUMC5AAR)、人衍生的未知配体的受体蛋白质(HUMRDC1A)、人衍生的未知配体的受体蛋白质(M84605，HUMOPIODRE)以及大鼠衍生的肾上腺素α2B受体蛋白质(M91466，RATA2BAR)。
另外，彼此比较各自编码下列已知受体蛋白质之第六跨膜区附近氨基酸序列的cDNA的核苷酸序列，并找出有高度相似性的片段小鼠衍生的未知配体的受体蛋白质(M80481，MUSGIR)、人衍生的的铃蟾肽受体蛋白质(LO8893，HUMBOMB3S)、人衍生的腺苷A2受体蛋白质(S46950，S46950)、小鼠衍生的未知配体的受体蛋白质(D21061，MUSGPCR)、小鼠衍生的TRH受体蛋白质(S43387，S43387)、大鼠衍生的神经调节肽K受体蛋白质(J05189，RATNEURA)、大鼠衍生的腺苷A1受体蛋白质(M69045，RATA1ARA)、人衍生的神经激肽A受体蛋白质(M57414，HUMNEKAR)、大鼠衍生的腺苷3A受体蛋白质(M94152，RATADENREC)、人衍生的促生长素抑制素受体蛋白质(M81829，HUMSRI1A)、人衍生的神经激肽3受体蛋白质(S86390，S86371S4)、大鼠衍生的未知配体的受体蛋白质(X61496，RNCGPCR)、人衍生的促生长素抑制素4受体蛋白质(L07061，HUMSSTR4Z)、和大鼠衍生的GnRH受体蛋白质(M31670，RATGNRHA)。
上文括号中给出的代码和缩写字是在使用DNASIS基因/蛋白质序列数据基础(CD019，Hitachi Software Engineering)检索GenBank/EMBL数据库后所示出的序号，并且除HTRHR(指日本Kokai Tokryo KohoH07-304797中所述的序列)外，一般分别称为登记号和命名。
具体地说，使用编码许多受体蛋白质之cDNA所共有的核苷酸序列为基础，并使这些序列的其余部分中有尽可能多的受体cDNA有渐增的同源性，导入混合的核苷酸。因此，合成两个具有与共同核苷酸序列互补之序列的合成DNA，即SEQ ID No5和SEQ ID No6所限定的序列。
5＇-CGTGG(G或C)C(A或C)T(G或C)(G或C)TGGGCAAC(A，G，C或T)(C或T)CCTG-3＇(SEQ ID NO5)5＇-GT(A，G，C或T)G(A或T)(A或G)(A或G)GGCA(A，G，C或T)CCAGCAGA(G或T)GGCAAA-3＇(SEQ ID NO6)合成时，在合成的相应步骤中混合使用括号内给出的多个核苷酸。
使用人扁桃体衍生的cDNA，PCR扩增G蛋白偶联受体蛋白质cDNA使用人扁桃体衍生的cDNA(Quickclone，Clontech)作为模板，并使用参考实施例1中合成DNA引物，以PCR技术扩增。反应混合物的组成如下合成DNA引物(序列5＇引物序列和3＇引物序列)各1μM，模板cDNA lng，0.25mM dNTP、Taq DNA聚合酶1μl及酶附带的缓冲液，总反应混合物体积为100μl。使用热循环仪(Terkin Elmer)以30次循环进行扩增，每次扩增循环包括96℃，30秒；45℃，1分钟和60℃，3分钟。加入Taq DNA聚合酶之前，混合反应混合物的其余成分并于95℃加热5分钟，再于65℃加热5分钟。经1．2％琼脂糖凝胶电泳和溴乙锭染色证实扩增产物。
PCR后，使用1份(1μl)反应产物，按照TA克隆试剂盒(Invitrogen)的使用说明书将扩增的DNA亚克隆到质粒载体pCRTMⅡ中(TM是指注册商标)。将亚克隆产物导入大肠杆菌INVαF＇感受态细胞(Invitrogen)中以转化之。在含有氨苄青霉素和X-gal的LB琼脂培养基上选择有cDNA插入片段的克隆，用无菌牙签只分离那些显示白颜色、以指示为转化体的克隆。得到许多转化体。在含氨苄青霉素的LB培养基上将各克隆培养过夜，并使用自动质粒提取器(Kurabo)制备质粒DNA。用EcoRⅠ裂解一部分如此制备的DNA以证实cDNA插入片段的大小。另一部分DNA经用RNA酶处理、苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀被进一步浓缩。使用脱氧终止物循环测序试剂盒(ABI)进行核苷酸测序反应，使用自动荧光序列仪分析序列，并使用DNASIS(Hitachi System Engineering)加工所得到的核苷酸序列信息。
基于核苷酸序列分析的结果，从许多转化体中找出一个其中插入了相当于G蛋白偶联受体之一的APJ受体之第1至第6跨膜区的PCR产物cDNA的克隆，即大肠杆菌INVαF＇/pA10。
O＇Dowd，B.F.等人(Gene，Vol.136，355-360，1993)报导了相当于APJ受体基因核苷酸序列中第318至993位核苷酸之片段的核苷酸序列。然而，因为其为使用修饰的引物得到的PCR产物，所以其引物部分的序列不同于APJ的相应序列，而且缺少N和C末端。
从人扁桃体衍生的cDNA库中克隆含有受体蛋白质之全长度编码区的cDNA为了得到编码全长度APJ受体的DNA，使用实施例1中得到的APJ受体cDNA片段作为探针以筛选人扁桃体衍生的cDNA库。所使用的人扁桃体衍生的cDNA库是其中利用λgt11噬菌体载体的Clontech cDNA库(Clontech，CLHL30086)。将相当于2x×06pfu(噬斑形成单位)的人扁桃体cDNA库与硫酸镁处理的大肠杆菌Y1090-混合。37℃保温15分钟后，加入0.5％琼脂糖(Pharmacia)LB，并用所得混合物接种1.5％琼脂(WakoPure Chemical)LB平板(含有50μg/ml氨苄青霉素)。42℃培养过夜后，在上已形成噬斑的各平板上放一硝酸纤维素滤膜，以便将噬斑转移到滤膜上。用碱处理该滤膜使DNA变性，然后于80℃加热3小时以固定DNA。
在含有50％甲酰胺、4xSSPE、5xDenhardt＇s溶液、0.1％SDS和100μg/ml鲑鱼精子DNA的缓冲液中，使该滤膜与下述探针于42℃保温过夜，以进行杂交。所使用的探针是用EcoRⅠ裂解插入到实施例1中得到的质粒pA10中的DNA片段，回收后使用随机引物DNA标记试剂盒(Amersham)加入[32P]dCTP(duPont)标记制成的。用2xSSC+0.1％SDS于55℃洗1小时，然后于-80℃进行放射自显影以检测杂交噬斑。
上述筛选的结果是，4个独立的噬菌体克隆显示了杂交信号。用EcoRI分别消化从这四个克隆制备的DNA，琼脂糖凝胶电泳后，使用的筛选时所用的同样探针进行Southern印迹分析。各克隆分别得到相当于约1．2Kb、1．2Kb、1．3Kb和1．6Kb的杂交带。选择其中给出约1．6Kb带的克隆(λ34)。制备λ34的噬菌体DNA，并将其有杂交大小的EcoRⅠ片段在亚克隆到质粒pUC118的EcoRⅠ位点。用该质粒转化大肠杆菌JM109，以得到转化体大肠杆菌JM109/pUC118-λ34。用实施例1中所述的同样方法测定质粒的核苷酸序列，从而发现所说的质粒含有编码全长度G蛋白偶联受体蛋白质(APJ)的DNA。其所编码的氨基酸序列与O＇DoWd，B.F.等人(基因，Vol.136，355-360，1993)报导的序列(GenBank登记号U03642)完全相同。DNA序列和氨基酸序列示于图1中。
用Northern杂交法检测APJ受体mRNA在人组织中的表达和分布为了在mRNA水平上检测实施例2中得到的质粒pUC118-λ34所编码的APJ在人组织中的表达，进行Northern印迹分析。用于Northern印迹的滤膜是Human MTNBlot Ⅰ和Ⅱ(CL7760-1；CL7759-1)，并且所使用的探针与实施例1中使用的相同。将上述滤膜和探针在含有50％甲酰胺、5XSSPE、10XDenhardt＇s溶液、2％SDS和100μg/ml鲑鱼精子DNA的缓冲液中42℃保温过夜进行杂交。用0.1XSSC+0.1％SDS于50℃洗滤膜，风干后对X射线胶片(XAR5，Kodak)于-80℃曝光3天。结果示于图2中。从图2可以看出，人心脏、脑、胎盘、肝、骨骼肌、肾、胰、脾、胸腺、前列腺、卵巢、小肠和大肠中表达由pUC118-λ34编码的受体基因。特别是在脾、心脏和胎盘中有很强的表达。
产生用于APJ受体表达的CHO细胞pUC118-λ34中编码的cDNA片段具有约0.2Kb的5＇非翻译区，因此认为有必要尽可能除去所说的部分以增加表达效率。还有必要在cDNA部分的两末端加上相当于表达载体克隆位点的限制性酶切位点。因此，分别按下述方法处理两cDNA片段(5＇侧和3＇侧)并插入到动物细胞表达载体pAKKO-111H中SRα启动子的下游位点，以构建pAKKO-A10。这样，在5＇非翻译区和编码区中各唯一存在的两个BstⅪ位点切割pUC118-λ34，使用T4DNA聚合酶修复末端，并经连接而加入SalⅠ接头。经SalⅠ-SacⅠ双消化后，电泳分离约0.6Kb的片段并回收之。然后，经EcoRⅠ消化在其两末端切割插入到pUC118-λ34中的cDNA部分，使用T4DNA聚合酶修复末端，并经连接以加入一个ClaⅠ接头。为了与相当于5＇末端部分的片段区分开，进行EcoRⅤ消化和进一步的ClaⅠ-SacⅠ双酶消化，并电泳回收一个约0.8Kb的片段。再者，在多克隆位点SalⅠ和ClaⅠ处消化用于动物细胞的表达载体pAKKO-111H，并电泳回收载体部分。将如上制备的APJ受体cDNA的5＇侧和3＇侧片段与表达载体连接在一起，并用连接混合物转化大肠杆菌DH5，以得到大肠杆菌DH5/pAKKO-A10。
培养转化体大肠杆菌DH5/pAKKO-A10并大量制备质粒pAKKO-A10的DNA。
将20μg所说的质粒DNA溶解在1ml生理盐水(PBS)中，将溶液倒入基因转移器(Wako Pure Chemical)瓶中并使用回旋转混合器强烈搅拌，从而形成含有DNA的脂质体相。用1-2X106个CHO dhfr-细胞接种直径35mm的细胞培养皿，培养20小时后，更换新鲜培养基。将相当于0．5μgDNA的脂质体相(25μl)滴加到各平皿中，并经保温16小时以导入质粒DNA。进一步更换新鲜培养基后培养1天，然后再次换成选择培养基继续培养3天。最后，经胰酶消化分散细胞，并以低密度接种到选择培养基(无脱氧核糖核苷和核糖核苷的极限必需培养基，添加10％透析的胎牛血清的α培养基)中，进行转化体选择。转化体可单独生长于选择培养基中。经反复亚克隆重复选择，建成细胞系DHO-A10。
在转录水平上证实全长度受体蛋白质在细胞系CHO-A10中的表达使用Fast Track试剂盒(Invitrogen)，按照其使用说明书从CHO-A10细胞及CHO细胞(对照细胞)中制备poly(A)+RNA。使用0.02μg该poly(A)+RNA和RNAPCR试剂盒(Takara Shuzo)进行cDNA合成。所使用的引物是随机9碱基序列，反应混合物的总体积为40μl。作为cDNA合成的阴性对照，还在没有反转录酶的情况下制备反应混合物。首先，于30℃保温10分钟使反应进行到引物延伸至一定程度。然后，于42℃保温30分钟使反转录反应进行到足够程度，再于99℃加热5分钟以失活酶，进一步将混合物于5℃冷却5分钟。
完成反转录反应后，回收一部分反应混合物，用蒸馏水稀释并进行苯酚/氯仿提取和乙醚提取。将经过乙醇沉淀后得到的沉淀物溶解在预定量的蒸馏水中，并使用该溶液作为cDNA样品。制备该cDNA溶液和质粒DNA(pAKKO-A10)的系列稀释液，并使用对全长度受体蛋白质特异的引物进行PCR。基于全长度受体蛋白质之编码区的核苷酸序列制备的引物具有下示序列5＇-CAGACAACCAGTCTGAGTGTGAGT-3＇(SEQ ID No7)5＇-ATGGATTTCTCGTGCATCTGTTCT-3＇(SEQ ID No8)使用1μM各引物、0.5μl Taq DNA聚合酶(Takara shuzo)、酶附带的反应缓冲液和dNTP，以及10μl模板DNA(cDNA或质粒溶液)，以100μl总体积进行PCR反应。开始时，于94℃加热处理2分钟以使模板DNA充分变性，然后以25次循环完成反应，每次循环包括95℃30秒，65℃30秒和72℃60秒。完成反应后，取10μl反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳，以检测扩增产物并对其进行定量比较。结果检测到一个具有由编码全长度受体蛋白质之cDNA序列估计的大小(约1．1rb)的PCR产物(图3)。在以没有加反转录酶得到的反转录产物作为模板的PCR反应混合物中，没有检测到特异性带；这一事实排除了所研究的产物是衍生于CHO细胞基因组DNA之PCR产物的可能性。另外，在对照细胞的泳道中没有显现特异性带，从而证实所说的产物并非衍生于最初在CHO细胞中表达的mRNA(图3)。
借助细胞传感器检测组织提取物中含有的活性，特别是刺激CHO-A10细胞的活性基本按下述从牛胃、猪小肠和猪脑中制备提取物，冷冻保存并用作筛选细胞刺激活性的样品。
各组织煮沸、破坏后用0.5M乙酸提取，过滤提取物并使之吸附于精氨酸上，然后用0.2M盐酸洗脱。盐析收集洗脱级分中所含有的物质，用甲醇洗并真空干燥。再次溶解于蒸馏水中，调pH至7.2后加入2倍体积乙醇，并过滤收集所得沉淀物。将此沉淀物再次溶解于蒸馏水中，调pH至4.2，去除所得沉淀并冻干滤液。将冻干粉溶解于0.2M乙酸中并在SephadexG-25分级分离柱上凝胶过滤。冻干各洗脱级分。
另外将牛下丘脑煮沸并破坏，然后用1M乙酸提取。离心提取物，并向上清中加入0.05％TFA，然后使混合物通过C18柱吸附，用10％、30％和50％乙腈逐步洗脱。将各洗出物调到20mM乙酸铵-10％乙腈(pH4.5)并上CM Sepharose阳离子交换柱(Hiprep CM Sepharose FF，Pharmacia)以便吸附。浓缩使用100mM、250mM、500mM和1000mM乙酸铵得到的洗脱级分及流出部分，使用Sep-Pak C18柱脱盐品然后冻干。使用如此得到的冻干物作为细胞刺激活性筛选的样品。
以细胞外pH改变作为指征，使用细胞传感器(Molecular Devices)检测细胞刺激活性。经胰酶消化分散CHO-A10细胞或对照细胞，并制备含3×105细胞/ml的细胞悬液。将这些悬液以每份0.9ml分配于细胞传感器胶囊中并培养过夜。将各个含细胞的胶囊转移到传感器小室中，并进一步固定在细胞传感器的工作站中。使用细胞传感器的内设泵，交替重复泵开(1分钟20秒)和泵关(40秒)状态，并检测泵关后8秒和泵关后38秒间(30秒内)细胞外pH的改变，以计算各循环间pH改变的速率。细胞适应直到pH改变速率稳定后(约2小时)，将溶解于细胞传感器介质中的样品固定在两通道之一中。通过通道变换，细胞暴露于含样品的介质7分2秒，检测细胞外pH改变速率的变化。
将蒸馏水(1ml)加到各10mg按上述方法从牛胃、猪小肠和猪脑制备的纯化并冻干的组织提取物中。离心去掉不溶性物质，以1/40体积比将上清加到添加0.1％牛血清白蛋白(Sigma，A-2153，fractionⅤ)的细胞传感器低缓冲RPMI 1640培养基中，得到检测用样品(终浓度0.25mg/ml)。考虑某些样品可显著地改变培养基pH的可能性，用培养基中含有的酚红颜色作指示剂进行pH调整。将此样品加于CHO-A10细胞和对照细胞，以细胞反应的差异为指征，筛选含有细胞刺激活性的样品。至于用层析法分离并纯化的样品，将各样品溶解于小量DMSO中，然后溶解于添加0.1％牛血清白蛋白(Sigma，A-2153，fractionV)的用于细胞传感器的低缓冲RPMI1640培养基中，以改善溶解效率。在这种情况下，也预先向无样品培养基中加入同样量的DMSO，以使细胞适应之。
利用从牛胃、猪小肠和猪脑中按上述方法制备的样品，以细胞外pH改变速率为指标进行细胞刺激活性检测，结果发现与对照细胞相比，样品(B3、B4、S1、S2、S3、S4、G4、G6)能够特异地激活其中引入了APJ受体的CHO细胞(CHO-A10)(提高细胞外pH改变的速率)，如图4和5中所示。用从牛下丘脑制备的样品进行同样检测，结果如图6和7中所示，在第10管(30％乙腈洗脱物部分吸附于C18柱上，然后用1000mM乙酸铵洗脱得到的部分)中检测到特异性细胞刺激活性(细胞外pH改变速率增强活性)。
以细胞刺激活性强度作为指征选择高水平APJ受体表达细胞CHO-A10是经导入表达载体pAKKO-A10后，反复在选择培养基中传代培养所得到的转化体细胞而确立的细胞系。因此，各细胞中所导入的cDNA的拷贝数可能有所不同，进而有可能细胞上表达的APJ受体的数目也不同。如果从这样一个群体建立能够高表达功能性受体的细胞系，则将会得到有高敏感性和稳定性的检测结果。为此，如实施例8中所述的牛胃提取物一样，于RESOURCE RPC上经反相层析后收集从牛下丘脑制备的一部分活性分离物，并将其用作标准样品。使用该样品，以细胞传感器测得的细胞刺激活性作为指征，选择高APJ受体表达的细胞。如图8中所示，检测8个独立克隆的细胞刺激活性，克隆1、3、4和6测得有显著的细胞刺激活性。从这些克隆中进一步选择培养6号克隆(CHO-A10，克隆6)，用于继后的细胞刺激活性检测。
从牛胃中纯化能够在细胞系CHO-A10中特异性提高细胞外pH改变速率的活性物质(肽)以下具体描述从牛瘤胃和纲胃中纯化能够特异性提高细胞系CHO-A10中的细胞外pH改变速率的活性物质。
将牛瘤胃(1．0kg)和纲胃(1．0kg)切成块，并在4.0L蒸馏水中煮沸20分钟。在冰上迅速冷却后，加入280ml乙酸至终浓度为1.0M，用Polytron制备组织匀浆物(12，000rpm，12分钟)。将匀浆物搅拌过夜并离心(9500rpm，20分钟)得到上清液。将沉降物悬浮于2.0升1.0M乙酸中，用Polytron匀浆并再次离心得到上清。合并两份上清液，加入TFA至终浓度为0.05％，将所得到的混合物上反相C18柱(Prep C18 125A，100ml；Millipore)。上样后，用200ml 0.05％TFA/dH2O(dH2O以下称为蒸馏水)洗柱，然后用10％、30％和50％CH3CN/0.05％TFA/dH2O分三步洗脱。向30％CH3CN/0.05％TFA/dH2O洗脱级分中加入2体积20mMCH3COONH4/dH2O，并将混合物上阳离子交换柱(Hiprep CM-SepharoseFF，20ml；Pharmacia)。用20mM CH3COONH4/10％CH3CN/dH2O洗柱，然后分四步用100mM、200mM、500mM和1，1，000mMCH3COONH4/10％CH3CN/dH2O洗脱。1，000mM CH3COONH4洗脱级分显示有特异性提高细胞系CHO-A10中细胞外pH改变之速率的活性，因此向其中加入3体积两酮，去蛋白并蒸发浓缩。向浓缩的部分中加入TFA(终浓度0.1％)并将混合物上反相柱(RESORCE RPC，1ml；Pharmacia)。用12.5％-20.0％CH2CN进行浓度梯度洗脱。用15.5％-16．5％和17.0％-17.5％CH3CN洗脱的两个部分(分别为活性级分P-1和P-2)显示有特异性提高细胞系CHO-A10中细胞外pH改变速率的活性(图9)。分离的两个活性级分中，冻干17.0％-17．5％CH3CN洗脱级分(P-2)，然后溶解于DMSO中并悬浮于0.1％TFA/dH2O中，上反相柱(diphenyl219TP5415，Vydac；或Sephasil C8 SC 2.1/10，Pharmacia)。
在使用diphenyl 219TP5415柱的情况下，用14.0％-20.0％CH3CN浓度梯度洗脱，在17.0％CH3CN部分中检测到特异性增强细胞系CHO-A10中细胞外pH改变之速率的活性(图10)。在使用Sephasil C8 SC 2.1/10柱的情况下，用18.0-24.0％CH3CN进行浓度梯度洗脱，在19.5％CH3CN部分中检测到对细胞系CHO-A10的特异性增加细胞外pH改变速率的活性(图11)。分别冻干由diphenyl 219TP5415和Sephasil C8 SC 2．1/10柱上洗脱的活性级分，然后溶于DMSO中并悬浮于0．1％TFA/dH2O中，上反相柱(μRPC C2/C18 SC 2.1/10 Pharmacia)。就dihpenyl 219TP5415衍生的活性级分来说，用16.0％CH3CN以均一浓度洗脱时在19.0到20．5分钟期间洗脱的一个峰；就Sepahsil C8 SC 2.1/10衍生的活性级分来说，用16.0％CH3CN以均一浓度洗脱时在18.0-20.0分钟期间洗脱的一个峰，均检测到对CHO-A10细胞系的特异性提高细胞外pH改变速率的活性(图12和13)。
牛胃衍生的能够特异性提高细胞系CHO-A10中细胞外pH改变速率之活性物质(肽)的氨基酸序列测定确定实施例8中纯化的能够特异地提高细胞系CHO-A10中细胞外pH改变之速率的活性肽(P-2)的氨基酸序列。冻干从反相柱μRPC C2/C18SC2．1/10得到的有相同活性的两个峰部分，并在肽序列仪(ABI 492型)上进行氨基酸序列分析。结果，两峰部分均给出同样的氨基酸序列(N端17个残基)(SEQ ID No1)。
鉴定编码牛胃衍生之肽片段的小鼠对应物的基因片段将对实施例9的纯化产物进行N末端氨基酸分析得到的，由17个氨基酸残基组成的牛胃衍生的肽片段翻译成核苷酸序列(SEQ ID No2)，并使用基因序列分析软件Gene Bright(Hitachi Software)，在GemBank/EMBL登记的表达序列标签(Expressed Sequence Tag，EST)数据库中进行同源性检索。结果可见，SEQ ID No1中示出的部分序列显示与以登记号W33327登记的未知功能之小鼠EST翻译的氨基酸序列高度同源，并且发现所说的EST编码牛胃衍生之17氨基酸肽片段的小鼠型下游后半部分对应物(图14)。
编码实施例9中经N末端氨基酸分析得到的牛胃衍生之17氨基酸肽片段的小鼠型对应物的配体基因的全长度克隆根据实施例10中得到的EST的序列，分别合成W33-F1(5＇-CTGGCAGGGAGGCAGGAGGAA-3＇)(SEQ ID No9)、W33-F2(5＇-GCAGGAGGAAATTTCGCAGACAGC-3＇)(SEQ ID No10)、W33-R1(5＇-GAAGAGAATTCATCTGTGGAGTA-3＇)(SEQ ID No11)、和W33-R2(5＇-ACCGGCACCGGGAGGGCACTT-3＇)(SEQ ID No12)。按照相应的说明书，使用Isogen(Nippon Gene)从BALB/C小鼠的全脑中制备总RNA，然后使用寡(dT)纤维素柱(mRNA纯化试剂盒，PHRMACIA)由之制备poly(A)+)RNA。按照MarathoncDNA扩增试剂盒(Clontech)使用手册所述方法，从1μg已制备的poly(A)+RNA合成用于迅速扩增cDNA末端(RACE)的双链cDNA，并溶解于10μl蒸馏水中。再用TE缓冲液将其稀释50倍，并使用稀释液作为模板进行PCR。使用EXTaq(Takara)作为DNA聚合酶，合并2．5μl10xEXTaq缓冲液、1μldNTP混合物(各2．5mM)和0.5μl与等体积TaqStart抗体(Clontech)混合的ExTaq，加入附带于Marathon cDNA扩增试剂盒的衔接子引物AP1或AP2(各10μM)0.5μl，基因特异性引物W33-F1、W33-F2、W33-R1或W33-R2(各10μM)0．5μl、及模板cDNA，并用蒸馏水补足25μl体积，以制备反应混合物。在第一次RACE中，向反应混合物中加入2.5μl模板cDNA溶液，合并W33-F1和AP1用于3＇RACE，合并W33-R1和AP1以进行5＇RACE。94℃加热处理2分钟后，按每循环98℃10秒和72℃2分钟进行5循环PCR循环，然后按每循环98℃10秒和70℃2分钟进行5循环，再按每循环98℃10秒和68℃2分钟进行25循环PCR。用25μl此第一轮PCR产物作第二轮PCR的模板。此时，改变引物组合，即W33-F2与AP2组合用于3＇RACE，W33-R2与AP2组合用于5＇RACE。94℃加热处理2分钟后，以每循环包括98℃10秒钟和72℃2分钟进行5次PCR循环，然后将每循环包括98℃10秒钟和70℃2分钟进行5次循环，继之再以每循环包括98℃10秒钟和68℃2分钟进行30次PCR循环。对PCR产物进行1.2％琼脂糖凝电泳和溴化乙啶染色。用剃刀切下约300bp的带(在3＇RACE的情况下)和约600bp的带(在5＇RACE的情况下)，使用滤膜(UltraFree；Millipore)进行离心过滤并经苯酚提取和乙醇沉淀回收DNA片段。按照使用手册使如此得到的片段在染料终止物循环测序试剂盒(ABI)上反应，然后在DNA序列仪Prism377(ABI)上进行核苷酸序列分析，从而得到全长度序列.为了得到含有该全长度序列作为一个片段的DNA片段，基于由3＇RACE和5＇RACE得到的序列信息，分别合成两个引物mF(5＇-GAGAGTCGCGGGCAGAGCAGCGTCAG-3＇)(SEQID No13)和mR(5＇-GAAATCATCCAAGTGAGGGGCGAGAC-3＇)(SEQID No14)。所使用的模板是使用RNA PCR试剂盒(Takara)按下述方法由80ng先前制备的小鼠全脑poly(A)+RNA合成的cDNA。附带于试剂盒中的随机引物(9mer)或寡(dT)20-M4衔接子引物使用终浓度为2.5μM，加入MgCl2至终浓度为5mM，加入2μl10xRNA PCR缓冲液，8μl dNTP混合物(各2.5mM)、20单位RNA酶抑制剂和5单位AMV反转录酶，并用蒸馏水补足20μl总体积。30℃(当只使用随机引物时)处理10分钟后，于42℃反应30分钟以进行cDNA合成，将反应混合物分别溶解于5μl蒸馏水中，然后混合在一起，并使用混合溶液作为模板。使用EX Taq作为DNA聚合酶，加入2.5μl附带的10xEX Taq缓冲液、1μl dNTP混合物(各2.5mM)、0.5μl与等体积Taq Start抗体(Clontech)混合的EX Taq，引物mF和mR各0.5μl(各10μM)及1μl模板cDNA溶液，加入蒸馏水使总体积达到25μl。
94℃加热处理2分钟后，按每循环包括98℃10秒钟和68℃30秒钟共进行30次PCR循环。对PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，按前述同样方法回收约750bp带，并将其亚克隆到质粒载体pCR2.1(Invitrogen)中，然后进一步导入大肠杆菌JM109中，得到E.coli JM109/pmA10L-13。测定插到所得转化体中的cDNA片段的序列，结果证实该cDNA片段为含有配体多肽cDNA之全编码区的片段。基因序列示于图15中。根据与SEQ ID No1所示牛胃衍生之肽片段的比较(图16)，认为该小鼠衍生的氨基酸序列应为牛型片段的小鼠型对应物。
得到编码牛型肽的cDNA片段按照RNAPCR试剂盒(AMV)版本2(Tarkara Shuzo)的说明书，使用0.35μg牛下丘脑衍生的poly(A)+RNA部分作为模板，并使用随机9mer和寡dT引物分别制备5管反应混合物。反转录反应于30℃进行10分钟，再于42℃进行30分钟，最后于99℃加热5分钟以终止反应。合并反应混合物并进行乙醇沉淀。从反应混合物中回收合成的cDNA并溶解于40μl蒸馏水中。使用2μl该cDNA溶液作为模板，并使用各0.5μl具有下示序列的合成DNA引物的10μM水溶液5＇-GAATCTGAGTTTCTGCGTGCAGGC-3＇(SEQ ID No17)和5＇-TTAGAAAGGCATGGGGCCCTTATG-3＇)(SEQ ID No18)、1μl dNTP混合物(各2.5mM)、1.25单位Takara ExTaq(Takara Shuzo)和附加试剂盒中的反应缓冲液，制备反应混合物(25μl)。将此反应混合物于95℃加热2分钟，将包括98℃10秒、62℃20秒和72℃10秒的反应循环重复40次，于72℃保温30秒后将反应混合物冷却至4℃。用琼脂糖凝胶电泳法分析反应混合物，经溴乙锭染色检测到约230bp大小的cDNA带。从凝胶中回收该部分中的DNA，并用上述的同样引物对其进行PCR(25次循环)扩增。经琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，从凝胶中回收DNA并使用各自的引物，用ABI PRISM Dye Terminator Cycle SequencingReady Reaction试剂盒(Perkin Elmer-Applied Biosystems)进行测序反应。使用ABI PRISM 377 DNA序列仪分析该cDNA的序列后，从中找出编码如实施例9中测得的氨基酸序列LVQPRGPRSGPGPWQGG的部分。
得到编码大鼠型肽的cDNA按照相应的操作手册，使用Isogen(Nippon Gene)从Wistar大鼠的全脑中制备总RNA，然后使用寡(dT)纤维素柱(mRNA纯化试剂盒；Pharmacia)从中制备poly(A)+RNA。按照Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech)的使用手册从1μg所制备的poly(A)+RNA合成cDNA，并将其溶解于10μl蒸馏水中。进一步用TE缓冲液将其稀释50倍，并按照实施例11(即小鼠衍生的全长度克隆实施例)中所述的RACE方法，以所得稀释液为模板，利用不同的引物对进行PCR扩增。在3＇RACE的情况下，第一轮PCR中使用W33-F1和AP1，第二轮PCR中使用W33-F2和AP1，并回收约800bp的带。在5＇RACE的情况下，第一轮PCR中使用W33-R1和AP1，第二轮PCR中使用W33-R2和AP1，并回收约600bp的带。按照实施例11中所述的同样方法测定所回收的片段的序列，发现有约1，300bp的全长序列。
为了得到只含有认为被翻译成氨基酸的序列区域的单一片段形式的DNA片段，基于由3＇RACE和5＇RACE得到的序列信息分别合成引物rFA10(5＇-GTAGTTGGGAGTCGCGGGCAGAGCAC-3＇)(SEQ ID No19)和rRA10(5＇-TAGAACCATGTCAGGATCAGCACTTT-3＇)(SEQ ID No20)。所使用的模板是按下述方法使用RNA PCR试剂盒(Takara)从160g以前制备的大鼠全脑poly(A)+RNA合成的CDNA。因此，以2.5μM的终浓度使用附带于试剂盒中的随机引物(9mer)，加入MgCl2至终浓度为5mM，然后加入4μl 10xRNA PCR缓冲液、16μl dNTP混合物(各2.5mM)、40单位RNA酶抑制剂和10单位AMV反转录酶，并用蒸馏水补足总体积40μl。将混合物于30℃保温处理10分钟后，42℃反应30分钟以合成cDNA并将反应混合物溶解于40μl蒸馏水中。使用EXTaq作为DNA聚合酶，加入2.5μl附带的10xEX Taq缓冲液、1μl dNTP混合物(各2．5mM)、0.5μl EX Taq与等体积Taq Start抗体(Clontech)的混合物、各0．5μl的引物rFA10和rRA10(各10μM)及1μl模板cDNA溶液，并用蒸馏水使终体积达到25μl，由此制备PCR反应混合物。94℃加热处理2分钟后，按98℃10秒和68℃45秒共重复30次循环以进行PCR。1.2％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，按上述同样方法回收电泳带。将该条带DNA亚克隆到质粒载体pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中，再转化到大肠杆菌JM109中。分析cDNA插入物片段的序列，明确地确定包括引物的约1，270bp核苷酸序列。
此外，合成各自含有起始密码子和终止密码子的两个引物，即引物rFSal(5＇-AGTCGACGCATGAATCTGAGTTTCTG-3＇)(SEQ ID No21)和引物rRNhe(5＇-GAGCCCTTCAAGCTAGCTTTAGAAAG-3＇)(SEQ IDNo22)。划下线部分是分别被限制性酶SalⅠ和NheⅠ识别的序列。使用这些引物，连同约20ng从含有上述使用rFA10和rRA10扩增得到的片段的转化体中制备的质粒(作为模板)，并如上所述使用EXTaq作为DNA聚合酶，经94℃加热处理2分钟后，将98℃10秒钟和68℃30秒钟的热循环重复24次，以进行PCR。回收如此得到的约260bp的带，将由其中回收的DNA亚克隆到质粒载体pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中并进一步导入大肠杆菌JM109中，以得到E.coli JM109/prSHe-1。分析插入到所得转化体中的cDNA片段的序列，证实该cDNA片段含有大鼠型肽的全部编码区(图17)。
得到编码人型肽的cDNA对于在实施例11和13中得到的小鼠和大鼠型序列间充分保守的区域，合成引物AF2(5＇-GTGCCACTGATGCTGCCTCCAGATGG-3＇)(SEQ ID No23)和AR1(5＇-TTAGAAAGGCATGGGTCCCTTATG-3＇)(SEQ ID No24)。通过加入随机引物(9mer，GIBCO BRL)并使用莫洛尼鼠类白血病病毒衍生的反转录酶(GIBCO BRL)和其附带的缓冲液，于42℃反应1小时，从购自Clontech的5μg人肺poly(A)+RNA合成cDNA。将所合成的cDNA溶解于30μl TE缓冲液中。使用1μl该cDNA溶液作为模板，进行PCR反应。使用EX Taq作为DNA聚合酶(参见实施例11)，连同引物AF2和AR1制备PCR反应混合物。94℃处理2分钟后，将包括98℃10秒、62℃20秒、和72℃5秒的循环重复35次。回收如此得到的约150bp的带并进行核苷酸序列分析。结果可见该片段编码人型肽片段。
基于该序列，合成用于3＇RACE的引物h3R1(5＇-ACGGCAATGTCCGCCA CCTGGTGC-3＇)(SEQ ID No25)和h3R2(5＇-CCCTGGCAGGGAGGTCGGAGGAAA-3＇)(SEQ ID No26)，及用于5＇RACE的h5R1(5＇-GGGCGGCTGGCGGCGGAATTTCCT-3＇)(SEQ ID No27)和h5R2(5＇-GCTGCACCAGGTGGCGGACATTGC-3＇)(SEQ ID No28)。按照Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech)的使用说明书，从购自Clontech的人底丘脑核和肺衍生的各1μg poly(A)+RNA(clontech)合成cDNA。将各DNA溶解在10μl蒸馏水中并用TE缓冲液稀释50倍，以制备用于RACE的模板cDNA溶液。3＇RACE中合用引物h3R1和AP1，5＇RECE中合用h5R1和AP1，按实施例11中所述同样方法制备反应混合物，于94℃加热处理2分钟后，将包括98℃10秒和72℃45秒的热循环重复5次，然后将包括98℃10秒和70℃45秒的热循环重复5次，再将包括98℃10秒和68℃45秒的热循环重复25次，以进行PCR。用TE缓冲液将反应混合物稀释50倍，使用各2．5μl稀释液作为第二轮PCR的模板。改变引物组合，即h3R2和AP1或AP2用于3＇RACE，h5R2和AP1用于5＇RACE。94℃加热处理2分钟后，将包括98℃10秒和72℃45秒的循环重复5次，然后将包括98℃10秒和70℃45秒的循环重复5次，再将包括98℃10秒和68℃45秒的循环重复35次，以完成PCR反应。结果，分别回收经5＇RACE从底丘脑核衍生之约500bp带和经3＇RACE从肺衍生之约200bp带，分析约570bp的核苷酸序列，发现该cDNA编码人型肽。
另外，为了扩增单一cDNA形式的预期全编码区，合成编码区的两末端的引物，hFA10(5＇-TTGGCCTCCGGGCGCCCGACCTCT-3＇)(SEQ IDNo29)和hRA10(5＇-GACATAACCGCAGGGGGTGGGCACTTG-3＇)(SEQ ID No30)。使用RACE中所用的底丘脑核衍生之相同cDNA作为模板。使用Klen Taq(Clontech)作为DNA聚合酶，加入2．5μl附带的10xKlen Taq缓冲液、1μl dNTP混合物(各2.5mM)、0.5μl Klen Taq、各0.5μl引物hFA10和hRA10(各10μM)及1μl模板cDNA溶液，并用蒸馏水补足25μl总体积以制备PCR反应混合物。94℃加热处理2分钟后，将包括98℃10秒和68℃30秒的循环重复30次以完成PCR。对PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，回收所预期的带，将其亚克隆到质粒载体pCR2.1/TOPO(Invitrogen)中并进一步导入大肠杆菌JM109，从而得到E.coli JM109/phSuN-4。对插入到所得转化体中之cDNA片段的序列分析结果证明，该cDNA片段含有人型肽的全部编码区。其基因序列示于图18中。
得到编码牛型肽的cDNA基于实施例12中所得PCR产物的核苷酸序列，分别制备用于5＇RACE和3＇RACE的几种特异性引物。按照Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech)使用手册所述的方法，从1μg牛肺衍生的Poly(A)+RNA合成cDNA，用蒸馏水将最后步骤中加入衔接子后得到的cDNA溶液稀释50倍。使用2.5μl该50倍稀释液、各0．5μl如下列SE Q ID NO31 至34所示的特异性引物(10μM)、0.5μl AP1引物(附加于酶中，10μM)、0.5μl EX Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)与等体积Taq Start抗体(Clontech)的混合物、2.5μl 10X EXTaq缓冲液和1μl dNTP(均为酶附带的)以制备反应混合物(各25μl)，95℃加热处理2分钟后，将包括98℃10秒和72℃1分钟的循环重复5次，然后将包括98℃10秒和70℃1分钟的循环重复5次，再将包括98℃10秒和68℃1分钟的循环重复25次，最后于68℃加热1分钟以完成PCR。使用1μl该反应混合物，改变引物组合以制备反应混合物，并在同样条件(不同的是最后的扩增循环重复次数从25次增加到35次)下完成第二轮PCR。
在使用各种引物组合制得的PCR产物中，以琼脂糖凝胶电泳法分离使用FF1(5＇-CCTGCTGCTCTGGCTCTGCCTGAG-3＇)(SEQ ID NO31)与AP1(5＇-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3＇)(SEQ ID NO32)组合进行第一轮PCR、使用1μl第一轮反应混合物及FF2(5＇-GCGGTGTGCGGAGGACCCCTGCTG-3＇)(SEQ ID NO33)与AP2(5＇-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3＇)引物组合进行第二轮PCR得到的那些主要PCR产物，从凝胶中回收之并测定其序列。与实施例11中得到的小鼠cDNA比较后，发现所分析的3＇RACE产物是具有翻译终止密码子之下游序列的cDNA片段。基于由该3＇RACE示出的牛型肽cDNA的序列，合成相当于3＇非翻译区部分的引物。另外，基于已在其他种动物中揭示的5＇非翻译区cDNA序列合成一引物。使用相当于150ng牛下丘脑poly(A)+RNA的cDNA作为模板，并加入0．5μl各引物(10μM、0.5μl与等体积Taq Start抗体(Clontech)混合的EX Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)、2.5μl X10 EX Taq缓冲液及1μl dNTP(均为酶附带的)以制备反应混合物(25μl)，95℃加热处理2分钟后，将包括98℃10秒、62℃20秒和72℃30秒的循环重复40次，然后再于72℃保温30秒。经琼脂糖凝胶电泳分离反应产物。从凝胶中回收主要PCR产物并分析其核苷酸序列。对使用NCR4(5＇-GGCCGCGGCGGCCCAAGGAGCAGC-3＇)(SEQ ID NO35)与RV1(5＇-GCGTGTGGTGGCCCCTTCGGTCCT-3＇)(SEQ ID NO36)或RV2(5＇-AATCACAGGGGGTGGGCGTGTGGT-3＇)(SEQ ID NO37)的引物组合得到的主要PCR产物的核苷酸序列分析揭示，已扩增了含有全长度翻译区的cDNA。因此，使用Original TA克隆试剂盒(Invitrogen)将cDNA亚克隆到质粒载体pCR2．1中，然后进一步导入大肠杆菌JM109，从而得到E.coli JM109/pBovA10prec24。对插入到所得转化体中之cDNA片段的序列分析结果证实，该cDNA片段含有牛型肽的全部编码区(图19)。
图20中比较显示实施例11、13、14和15中揭示之小鼠、大鼠、人和牛型肽的氨基酸序列。
生产作用于APJ受体的肽，即pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe在ABI 430A型肽合成仪的反应容器中充入相当于0.5毫摩尔的商品Boc-Phe-OCH2-PAM树脂(0.72mmole/克树脂)，并按照已知的Boc策略(NMP-HOBt)肽合成技术，依次引入Boc-Pro、Boc-Met、Boc-Pro、Boc-Gly、Boc-Lys(C1-Z)、Boc-His(Bom)、Boc-Ser(Bzl)、Boc-Leu、Boc-Arg(Tos)、Boc-Pro、Boc-Arg(Tos)、Boc-Gln，从而得到所需的被保护的肽-树脂。在5ml无水氟化氢中，将0.22g部分的该树脂连同0.43g对甲酚0℃搅拌60分钟，然后于减压下蒸馏除去氟化氢，向残留物中加入乙酸-水并用乙酸-水提取肽。将提取物浓缩到足够程度，加入蒸馏水和二乙醚，提取并进行相分离。冻干所收集的水层，将冻干物溶解在少量50％乙酸-水中并上用同样溶剂填充的Sephadex(注册商标)G-25柱(2.0×80cm)。用同样溶剂展层后，合并主要部分并冻干得到约50mg白色粉末。将其溶解于50ml 50％乙酸-水中，并在60℃水浴上放置1小时。经HPLC证实在13.9分钟时主峰消失，并转化成约15.6分钟时的一个峰后，将混合物送回室温并上用LiChroprep(注册商标)RP-18充填的反相层析柱(2.6×60cm)。用200ml 0.1％TFA-水洗柱，然后使用300ml0.1％TFA-水和300ml含有0.1％TFA的33％乙腈-水进行线性梯度洗脱。合并约20％乙腈浓度的洗脱级分并冻干得到28mg白色粉末。质量分析(M+H)+1533.953(计算值1533.811)HPLC洗脱时间15.7分钟柱条件柱Wakosil 5C18T，4.6×100mm洗脱液溶剂A-0.1％TFA-水；溶剂B-含0.1％TFA的乙腈；线性浓度梯度洗脱从A/B=95/5到A/B=45/55(25分钟)流速1.0ml/分。
检测肽pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe对APJ受体的配体活性将实施例16中得到的肽和包括SEQ IN NO40限定之序列的第42位至77位残基的氨基酸序列代表的肽溶解在无菌蒸馏水中，至浓度为1×10-3M，并使用含有0.1％BSA的细胞传感器介质将各溶液稀释到肽浓度为10-8、10-9、10-10和10-11M。将按照实施例6中所述的同样方法向其中导入了APJ受体cDNA的CHO细胞固定在细胞传感器的工作台上，各细胞的酸化速率稳定后，将肽稀释液之一导入细胞传感器的一个通道中，改变通道使细胞与稀释液接触7分2秒钟。取基础水平值为100％，计算样品导入的第3循环中细胞反应达到最大时酸化速率的改变。图21中示出了所得结果。
生产Val-Gln-Pro-Arg-Gly-Pro-Arg-Ser-Gly-Pro-Gly-Pro-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe将商品Boc-Phe-OCH2-PAM树脂(0.72mmole/g树脂，0.5mmole)装入肽合成仪(ABI430A型)的反应瓶中，以Boc-策略(NMP-HOBt)方法，按照上述氨基酸的顺序依次导入Boc-Pro、Boc-Met、Boc-Gly、Boc-Lys(Cl-Z)、Boc-His(Bom)、Boc-Ser(Bzl)、Boc-Leu、Boc-Arg(Tos)、Boc-Gln、Boc-Phe、Boc-Trp(CHO)和Boc-Val，以得到所需的被保护的肽树脂，完成肽合成。将该树脂(0.17g)与1.0g对甲酚和1.0ml 1，4-丁二硫醇在8ml无水氟化氢中0℃搅拌60分钟，蒸馏除去氟化氢，向残留物中加入乙酸-水，并用乙酸-水提取肽。将提取物浓缩到足够程度，加入蒸馏水和二乙醚以进行提取和相分离，收集并冻干水层，将冻干物溶解在小量50％含水乙酸中，将溶液过已用同样溶剂充填而制备的SephadexTMG-25柱(2.0×80cm)，用同样溶剂展层，收集主要部分并冻干得到约70mg白色粉末。将此样品过LichroprepTMRP-18充填的反相层析柱(2.6×60cm)，用200ml 0.1％TFA-H2O洗柱，并用300ml含0.1％TFA的10％乙腈-水和300ml含0．1％TFA的30％乙腈-水进行线性梯度洗脱。合并主要部分并冻干得到33mg白色粉末。质量分析(M+H)+4064.6(计算值4064.2)HPLC洗脱时间16.0分钟柱条件柱Wakosil 5C18T，4.6×100mm洗脱液溶液A-0.1％TFA-水，溶液B-含0.1％TFA的乙腈。从A/B=95/5至A/B=45/55的线性浓度梯度(25分钟)。流速1．0ml/分。
生产Leu-Val-Gln-Pro-Arg-Gly-Pro-Arg-Ser-Gly-Pro-Gly-Pro-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe进一步将Boc-Leu引入实施例18得到的树脂中，然而按实施例18中所述的方法用氟化氢处理并进行层析纯化。合并主要部分并冻干得到23mg白色粉末。质量分析(M+H)+4177.7(计算值4177.3)HPLC洗脱时间16.2分钟柱条件柱Wakosil 5C18T，4.6×100mm洗脱液溶液A-0.1％TFA-水，溶液B-含0.1％TFA的乙腈。从A/B=95/5至A/B=45/55的线性浓度梯度(25分钟)。流速1.0ml/分。
生产Leu-Val-Gln-Pro-Arg-Gly-Ser-Arg-Asn-Gly-Pro-Gly-Pro-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe向市售2-氯三苯甲游基树脂(Clt树脂，1.3mmole/g)中引入Fmoc-Phe-OH，用所制得的0.25mmole Fmoc-Phe-O-Clt树脂(0.32mmole/g)充填肽合成仪(ABI 433A)的反应管，并用Fmoc/DCC/HOBt方法进行固相合成。用于Fmoc氨基酸侧链的保护基团，对于Arg来说是Pbf，对于Ser来说是tBu，在Trp和Lys的情况下是Boc，并且在His、Asn和Gln的情况下是Trt。使用其他氨基酸则没有侧链保护问题。按照如上显示的序列所指示的次序，从Phe开始在N末端Leu方向上引入肽链，得到所需的被保护的肽树脂。
将50mg(4.45mmole)该树脂在1ml由TFA、苯甲硫醚、间甲酚、H2O和乙二硫醇(82.5∶5∶5∶5∶2.5)组成的混合溶液中室温搅拌2小时，向反应混合物中加入醚，并离心回收所得到的沉淀物白色粉末。除去上清的过程重复3次。用水提取残留物。冻干得到23.1mg白色粉末。使用TSKGELODS120T柱(20×300mm)对如此得到的粗肽进行制备性HPLC。使用溶液A0．1％TFA-水和溶液B含0.1％TFA的乙腈，从A/B=85/15至A/B=75/25进行线性浓度梯度洗脱(60分钟)。合并含有所需产物的部分，冻干得到10.2mg白色粉末。质量分析(M+H)+4194.8(计算值4194.3)HPLC洗脱时间16．5分钟洗脱条件柱YMCA-301-3(4.6×100mm)洗脱液溶液A-0.1％TFA-水；溶液B-含有0.1％TFA的乙腈。
从A/B=100/0至A/B=50/50的线性浓度梯度(25分钟)流速1.0ml/分。
生产His-Leu-Val-Gln-Pro-Arg-Gly-Ser-Arg-Asn-Gly-Pro-Gly-Pro-TlP-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe实施例20中得到的树脂进一步与Fmoc-His(Trt)缩合，然后进行如实施例20的同样纯化处理，得到10mg白色粉末。质量分析(M+H)+4331.2(计算值4331.4)HPLC洗脱时间16.3分钟洗脱条件柱YMCA-301-3(4.6×100mm)洗脱液溶液A-0.1％TFA-水；溶液B-含有0．1％TFA的乙腈。
从A/B=100/0至A/B=50/50的线性浓度梯度(25分钟)流速1.0ml/分。
生产Leu-Val-Lys-Pro-Arg-Thr-Ser-Arg-Thr-Gly-Pro-Gly-Ala-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe
按照实施例18中所述的同样方法，基于上述氨基酸序列的次序，向市售Boc-Phe-OCH2-PAM树脂(0.72mmole/g树脂)中引入Boc-Pro、Boc-Met、Boc-Gly、Boc-Lys(Cl-Z)、Boc-His(Bom)、Boc-Ser(Bzl)、Boc-Leu、Boc-Arg(Tos)、Boc-Gln、Boc-Phe、Boc-Trp(CHO)、Boc-Ala、Boc-Thr(Bzl)和Boc-Val，得到所需的被保护的肽树脂。与实施例18中的同样方式用氟化氢处理该树脂，并按同样方法纯化所回收的肽，得到25mg白色粉末。质量分析(M+H)+4199.0(计算值4199.3)[实施例23]生产Tyr-Leu-Val-Lys-Pro-Arg-Thr-Ser-Arg-Thr-Gly-Pro-Gly-Ala-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe使Boc-Try(Br-Z)进一步与实施例22中得到的树脂缩合。对所得树脂进行同样的处理和纯化，得到12mg白色粉末。质量分析(M+H)+4362.7(计算值4362.4)[实施例24]生产Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe使市售Boc-Phe-OCH2-PAM树脂(0.72mmole/g树脂)按次序与Boc-Pro、Boc-Met、Boc-Pro、Boc-Gly、Boc-Lys(C1-2)、Boc-His(Bom)、Boc-Ser(Bzl)、Boc-Leu、Boc-Arg(Tos)和Boc-Pro缩合。于对甲酚存在下用氟化氢处理树脂，并按实施例18中的同样方式纯化肽，得到54mg白色粉末。质量分析(M+H)+1266.4(计算值1266.7)[实施例25]生产Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe使实施例24的树脂进一步与Boc-Arg(Tos)缩合，然后进行同样的处理和纯化，得到30mg白色粉末。质量分析(M+H)+1422.6(计算值1422.8)[实施例26]生产Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe
使实施例25的树脂进一步与Boc-Gln缩合，然后进行同样处理和纯化，并从稀释的盐酸中冻干得到21mg白色粉末。质量分析(M+H)+1551.1(计算值1550.8)[实施例27]生产Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Set-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe使实施例26的树脂与Boc-Arg(Tos)进一步缩合2次，然后经同样处理和纯化得到17mg白色粉末。质量分析(M+H)+1862.8(计算值1863.0)[实施例28]生产Cys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe使实施例27的树脂进一步与Boc-Phe，再与Boc-Cys(MeBzl)缩合，然后进行同样处理和纯化，得到30mg白色粉末。质量分析(M+H)+2113.2(计算值2113.1)HPLC洗脱时间16.0分钟洗脱条件柱YMCA-301-3(4.6×100mm)洗脱液溶液A-0.1％TFA-水；溶液B-含有0.1％TFA的乙腈。
从A/B=100/0至A/B=50/50的线性浓度梯度(25分钟)流速1.0ml/分。
生产Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe使实施例27的树脂进一步按次序与Boc-Phe、Boc-Lys(C1-Z)、Boc-Arg(Tos)和Boc-Arg(Tos)缩合，然后进行同样处理和纯化得到13mg白色粉末。质量分析(M+H)+2450.4(计算值2450.4)HPLC洗脱时间15.7分钟洗脱条件柱YMC A-301-3(4.6×100mm)洗脱液溶液A-0.1％TFA-水；溶液B-含有0.1％TFA的乙腈。
从A/B=100/0至A/B=50/50的线性浓度梯度(25分钟)流速1．0ml/分。
生产pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Giy-Pro-Met-Pro使市售Boc-Pro-OCH2-PAM树脂(0.63mmole/g树脂)按次序与Boc-Met、Boc-Pro、Boc-Gly、Boc-Lys(C1-Z)、Boc-His(Bom)、Boc-Ser(Bzl)、Boc-Leu、Boc-Arg(Tos)、Boc-Pro、Boc-Ary(Tos)、Z-Gln缩合。于对甲酚存在下用氟化氢处理所得树脂，并按实施例18中所述同样方式纯化肽，得到56mg白色粉末。质量分析(M+H)+1386.4(计算值1386.7)HPLC洗脱时间12.7分钟洗脱条件柱Wakosil 5C18T(4.6×100mm)洗脱液溶液A-0.1％TFA-水；溶液B-含有0.1％TFA的乙腈。
从A/B=95/5至A/B=45/55的线性浓度梯度(25分钟)流速1.0ml/分。
生产pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Giy-Pro-Met使市售Boc-Met-OCH2-PAM树脂(0.66mmole/g树脂)依次与Boc-Pro、Boc-Gly、Boc-Lys(C1-Z)、Boc-His(Bom)、Boc-Ser(Bzl)、Boc-Leu、Boc-Arg(Tos)、Boc-Pro、Boc-Ary(Tos)和Z-Glu缩合。于对甲酚存在下用氟化氢处理所得到的树脂，按实施例18中所述同样方式纯化肽，得到29mg白色粉末。质量分析(M+H)+1289.9(计算值1289.7)HPLC洗脱时间11.8分钟洗脱条件柱Wakosil 5C18T(4.6×100mm)洗脱液溶液A-0.1％TFA-水；溶液B-含有0.1％TFA的乙腈。
从A/B=95/5至A/B=45/55的线性浓度梯度(25分钟)流速1.0ml/分。
生产Met-Leu-Val-Gln-Pro-Arg-Gly-Ser-Arg-Asn-Gly-Pro-Gly-Pro-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe使实施例20的树脂进一步与Fmoc-Met缩合，然后进行同样的纯化，得到5mg白色粉末。质量分析(M+H)+4324.9(计算值4325.3)HPLC洗脱时间16.8分钟洗脱条件柱YMCA-301-3(4.6×100mm)洗脱液溶液A-0.1％TFA-水；溶液B-含有0.1％TFA的乙腈。
从A/B=100/0至A/B=50/50的线性浓度梯度(25分钟)流速1.0ml/分。
检测对毛喉素刺激的cAMP产生的抑制活性将CH0-A10克隆6细胞接种于24孔组织培养板上(3×105细胞/孔)并培养过夜。制备含有0.2mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)和0.05％牛血清白蛋白的Hanks＇平衡盐溶液(HBSS)，作为检测缓冲液。用2×500μl检测缓冲液洗各孔，然后于37℃预保温30分钟。进一步用500μl检测缓冲液洗后，向各孔内加入在添加1μM毛喉素的检测缓冲液中制成的样品溶液500μl，并于37℃保温30分钟。为了了解细胞产生cAMP的基础水平，各孔与未加毛喉素的检测缓冲液保温；为了了解因毛喉素刺激而导致的cAMP产生的最大水平，进一步制备与添加毛喉素的检测缓冲液保温的孔。保温完成后，用500μl检测缓冲液洗各孔，并向各孔中加入Amersham cAMP EIA试剂盒附带的500μl溶解缓冲液1B，以提取cAMP。按照试剂盒使用说明书，对100μl等分的各提取物进行cAMP检测试验。将最大水平和加样品孔的水平间的cAMP产生量之差值作为相对于毛喉素刺激的cAMP产生量增加(最大水平和基础水平间的差值)的百分比，计算对cAMP产生的抑制活性(cAMP产生的抑制百分率)。结果示于图22中。
中，于37℃反应1小时以完成4个寡聚体(各1μg)(除形成5＇末端的#1和#6外)的5＇末端磷酸化。苯酚处理后，回收水层，加入2体积乙醇，将混合物冷却至-70℃并离心沉淀DNA。b)DNA片段的连接将如上得到的磷酸化的DNA片段和各1μg#1和#2合并成120μl总体积。该混合物于80℃保持10分钟，然后逐步冷却到室温以退火。使用Takara DNA连接试剂盒ver.2(Takara Shuzo)完成连接反应。为此，向30μl退火混合物中加入30μl溶液Ⅱ，彻底混合后加入60μl溶液Ⅰ，并于37℃进行连接反应1小时。苯酚处理后，回收水层，加入2体积乙醇，将混合物冷却至-70℃，并离心沉淀DNA。c)5＇末端磷酸化将沉淀物溶解于10μl TE缓冲液(10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mMEDTA)中，并在100μl磷酸化反应介质[50mM Tris-HCl(pH7.6)、10mMMgCl2、1mM亚精胺、10mM二巯基乙醇、0.1mg/ml牛血清白蛋白、1mMATP、10单位T4多核苷酸激酶(Nippon Gene)]中37℃反应1小时，以进行5＇末端磷酸化。苯酚处理后，回收水层，加入2体积乙醇，将混合物冷却到-70℃，离心沉淀DNA并溶解于20μlTE缓冲液中。
制备人apelin-36表达质粒用XbaⅠ和AvaⅠ消化pTB960-2(EP-A499990；Koyama等人，Journal of Biotechnology，Vol.32，273)，并对消化混合物进行1％琼脂糖电泳。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)提取约4.4Kb的DNA片段，并溶解于25μl TE缓冲液中。使用Takara DNA连接试剂盒ver.2(Takara Shuzo)对pTB960-2的该XbaⅠ-AvaⅠ片段和如上制备的人apelin-36结构基因进行连接反应。为此，将pTB960-2的该XbaⅠ-AvaⅠ片段溶液1μl和人apelin-36结构基因溶液4μl混合在一起，加入5μl溶液Ⅰ并于16℃进行连接反应30分钟。使用10μl连接混合物转化大肠杆菌JM109(Toyobo)的感受态细胞，然后涂布于含有10μg/ml四环素的LB琼脂培养基上，并于37℃培养1天。选择如此形成的四环素抗性菌落。将此转化体在LB培养基中培养过夜，并使用QIAprep8 Miniprep试剂盒(Qiagen)制备质粒pTB960-13。使用Applied Biosystems 377型DNA序列仪证实所说质粒中人apelin-36结构基因部分的核苷酸序列。使用质粒pTB960-13转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株(Novagen)，将转化的细胞涂布于含有10μg/ml四环素的LB琼脂培养基上，并于37℃培养1天，从而得到人apelin-36-CS23融合蛋白质表达菌株BL21(DE3)/pTB960-13。
使用1L含有5.0mg/l四环素的LB培养基(1％蛋白胨、0.5％酵母浸膏、0.5％氯化钠)，将实施例35中得到的转化体在2升培养瓶中37℃振荡培养8小时。将所得到的培养物转移到装有19升主发酵培养基(1.68％磷酸氢二钠、0.3％磷酸二氢钾、0.1％氯化铵、0.05％氯化钠、0.05％硫酸镁、0.02％消泡剂、0.00025％硫酸亚铁、0.00025％盐酸硫胺素、1.5％葡萄糖、1.5％酪蛋白氨基酸)的50l发酵罐中，并于通气和搅拌下30℃开始发酵。发酵培养物的浊度达到500Klett单位时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度12mg/l，并继续培养4小时。完成培养后，离心培养液得到约66g湿细菌细胞，将其置于-80℃冻存。
得到人apelin-36向550g实施例35中制得的细菌细胞中加入1，500ml含有10mMEDTA+1mM(对脒基苯基)甲磺酰氟盐酸化物的溶液(pH6.0)，超声(Branson Sonifier model 450)处理混合物并离心(10，000rpm，60分钟)。收集上清，并再次按同样方式处理沉降物。将合并的上清调到pH6.0并上已用50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡过的AF-Heparin Toyopearl650M柱(30mm ID×500mm L，Tosoh)，以吸附之。洗柱后，用0-100％B(B=50mM磷酸盐缓冲液+2M NaCl，pH6.0)逐步梯度洗脱，得到530ml含人apelin-36-CS23融合蛋白质的级分。使用Pericon Minicassette(Millipore)同时加入0.1M乙酸浓缩该洗脱物。如此得到人apelin-36-CS23融合蛋白质的0.1M乙酸溶液。向该溶液中加入尿素至6M的终浓度，然后加入35mg 1-氰基-4-二甲氨基吡啶鎓盐(DMAP-CN)，并使反应在室温下进行15分钟。反应完成后，将反应混合物上已用10％乙酸平衡过的Sephadex G-25柱(46mm ID×600mm L，Pharmacia)，并使用与平衡同样的10％乙酸以6ml/分的流速展层，以得到含有S-氰化的人apelin-36-CS23融合蛋白质的级分。浓缩该洗脱物，并用Pericon Minicassete(Millipore)脱盐，得到人apelin-36-CS23融合蛋白的脱盐溶液。向该脱盐溶液中加入尿素至6M终浓度，再加入1N氢氧化钠至0.06N终浓度，使反应于0℃进行15分钟。此后，用乙酸调整反应混合物至pH6.0，得到人apelin-36。将此反应混合物上已用含有3M尿素的50mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)平衡的SP-5PW柱(21.5mm ID×150mm L，Tosoh)，以吸附之。洗柱后，用0至40％B(B=50mM磷酸盐缓冲液+1M NaCl+3M尿素，pH6.5)进行逐步梯度洗脱，得到人apelin-36部分。将该人apelin-36部分进一步过0.1％三氟乙酸平衡的C4P-50柱(21.5mm ID×300mm L，ShowaDenko)。洗柱后，用15-30％B(B=80％乙腈/0．1％三氟乙酸)进行逐步梯度洗脱。合并所得到的人apelin-36部分，冻干得到人apelin-36的冻干粉末。a)氨基酸组成分析使用氨基酸分析仪(Hitachi L-8500A型氨基酸分析仪)确定氨基酸组成。结果发现与根据人apelin-36的核苷酸序列推测的氨基酸组成一致，并证明N末端加有蛋氨酸(表1)表1 氨基酸组成分析氨基酸 每摩尔的残基数 由人apelin-36的核苷酸序列推测的值Asx 1．01Thr1)0Ser1)1．92Glx 3．03Pro 5．76Gly 5．76Ala 0 0CyS2)0Val 1．01Met 2．01Ile 0 0Leu 2．02Tyr 0 0Phe 1．92His 1．01Lys 1．82Arg 7．38Trp 0．91酸水解(6N盐酸-4％巯基乙酸，110℃，水解24或48小时)1)外推到0小时得到的值2)未测b)N末端氨基酸序列分析使用气相蛋白序列仪(Applied Biosystems model 477A)测定N末端氨基酸序列。结果，除N末端加有蛋氨酸外，N末端氨基酸序列与从人apelin-36的核苷酸编码序列推测的序列一致(表2)。表2 N-末端氨基酸序列残基号 测得的PTH1)氨基酸 由人apelin-36的核苷酸(pmole)序列推测的氨基酸1 Met(526)2 Leu(648)Leu3 Val(513)Val4 Gln(437)Gln5 Pro(463)Pro6 Arg(216)Arg7 Gly(232)Gly8 Ser(129)Ser9 Arg(129)Arg10Asn(142)Ash11Gly(185)Gly12Pro(219)Pro13Gly(202)Gly14Pro(188)Pro15Trp(88) Trp16Gln(116)Gln17Gly(120)Gly18Gly(72) Gly19Arg(56) Arg20Arg(40) Arg使用1nmole进行分析。
1)乙内酰苯硫脲c)C末端氨基酸分析使用氨基酸分析仪(Hitachi Model L-8500A氨基酸分析仪)分析C末端氨基酸。表3C末端氨基酸分析人apelin-36C末端氨基酸回收率(％)Phe 38.6气相联氨分解(100℃，6小时)。
从上示结果看出，实施例37中得到的人apelin-36是N末端带有蛋氨酸的分子(Met-人 apelin-36)。
(生物学活性试验)使用实施例33中所述的方法检测实施例37中得到的人apelin-36的活性，证实其活性等同于合成产物。
去除N末端蛋氨酸将40mg实施例37中得到的Met-人 apelin-36溶解在0.8ml 3M尿素溶液中。然后，加入由0.05ml 80mM硫酸铜、0.046g乙醛酸和0.1ml吡啶组成的混合物，使反应于25℃进行1小时。此后，将反应混合物上已用2.5M尿素+10mM磷酸盐缓冲液(pH5.5)平衡过的Sephadex G-25柱(10mm ID×250mmL)，并以0.5ml/分的流速，用平衡缓冲溶液展层。合并含有二酮形式的Met-人 apelin-36的级分。向合并级分中加入4M乙酸，4M乙酸钠和3M尿素，然后再加入邻苯二胺至40mM浓度。将混合物脱气和用氮气封闭后，使反应于25℃进行5天。此后，将反应混合物上已用50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡过的Sephadex G-25柱(25mm ID×600mmL)，并以4ml/分的流速用此平衡溶液展层。合并现已没有N末端蛋氨酸的人apelin-36的洗脱物。将其调至pH6.0并使之吸附于已用50mM磷酸盐缓冲液+0.1M NaCl+2.5M尿素(pH5.0)平衡过的CM-5PW柱(7.5mm ID×75mm L，Tosoh)上，用0-100％B(B=50mM硼酸盐缓冲液+0.1M NaCl+2.5M尿素，pH9.0)，以0.8ml/分的流速，经40分钟完成梯度洗脱。合并含人apelin-36的洗脱物，并再次过已用0.1％TFA平衡的C4P-50柱(10mm ID×250mmL，Showa Denko)以进行吸附，用15-30％B(B=80％乙腈/0.1％TFA)以2ml/分的流速经40分钟完成梯度洗脱。合并人apelin-36部分并冻干得到人apelin-36。a)氨基酸组成分析使用氨基酸分析仪(Hitachi L-8500A型氨基酸分析仪)确定氨基酸组成。结果显示，氨基酸组成与根据人apelin-36 DNA的核苷酸序列推断的氨基酸组成相符(表4)。
表4 氨基酸组成分析氨基酸 每摩尔的残基数 由人apelin-36的核苷酸序列推测的值Asx 1．0 1Thr1) 0 0Ser1) 1．8 2Glx 3．0 3Pro 5．7 6Gly 5．6 6Ala 0 0Cys2) 0Val 1．0 1Met 1．0 1Iie 0 0Leu 2．0 2Tyr 0 0Phe 1．8 2His 1．0 1Lys 1．8 2Arg 7．2 8Trp 0．9 1酸水解(6N盐酸-4％巯基乙酸，110℃，水解24或48小时)1)外推到0小时得到的值2)未测b)N-末端氨基酸序列分析使用气相蛋白质序列仪(Applied Biosystems 477A型)确定N末端氨基酸序列。结果可见，N末端氨基酸序列与根据人apelin-36DNA的核苷酸序列推断的序列相一致(表5)。表5 N末端氨基酸序列残基序号 检测的PTH1)-氨基酸 由人apelin-36的核苷酸(pmole) 序列推测的氨基酸1Leu(570) Leu2Val(611) Val3Gln(594) Gln4Pro(587) Pro5Arg(332) Arg6Gly(552) Gly7Ser(255) Ser8Arg(277) Arg9Asn(345) Asn10 Gly(383) Gly11 Pro(383) Pro12 Gly(366) Gly13 Pro(318) Pro14 Trp(131) Trp15 Gln(210) Gln16 Gly(218) Gly17 Gly(281) Gly18 Arg(130) Arg19 Arg(190) Arg20 Lys(144) Lys使用1mmole进行分析1)乙内酰苯硫脲c)C-末端氨基酸分析使用氨基酸分析仪(Hitachi L-8500A型氨基酸分析仪)分析C末端氨基酸表6 C末端氨基酸分析人apelin-36 C末端氨基酸 回收率(％)Phe 66.3气相联氨分解(100℃，6小时)[实施例40](生物学活性试验)以实施例33中所述的方法对实施例39中制得的人apelin-36进行活性试验，证实其活性等同于合成产物的活性。
工业实用性本发明的多肽参予调节中枢神经系统功能、循环功能、免疫功能、胃肠功能、代谢功能、生殖功能等，其可用作治疗或预防HIV感染或爱滋病(获得性免疫缺陷综合症)等各种疾病的药物。
序列表〈110〉Takeda Chemical Industries，Ltd.〈120〉多肽，其生产方法及应用〈130〉2496WOOP〈150〉JP9-353955〈151〉1998-12-24〈150〉JP10-032577〈151〉1998-02-16〈150〉JP10-220853〈151〉1998-08-04〈150〉JP10-271645〈151〉1998-09-25〈160〉43〈210〉1〈211〉17〈212〉PRT〈213〉牛〈400〉1Leu Val Gln Pro Arg Gly Pro Arg Ser Gly Pro Gly Pro Trp Gln Gly1 5 10 15Gly17〈210〉2〈211〉51〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉2YTNGTNCARC CNMGNGGNCC NMGNWSNGGN CCMGGNCCNT GGCARGGNGG N 51〈210〉3〈211〉380〈212〉PRT〈213〉未知〈220〉〈223〉〈400〉3Met Glu Glu Gly Gly Asp Phe Asp Asn Tyr Tyr Gly Ala Asp Asn Gln1 5 10 15Ser Glu Cys Glu Tyr Thr Asp Trp Lys Ser Ser Gly Ala Leu Ile Pro20 25 30Ala Ile Tyr Met Leu Val Phe Leu Leu Gly Thr Thr Gly Asn Gly Leu35 40 45Val Leu Trp Thr Val Phe Arg Ser Ser Arg Glu Lys Arg Arg Ser Ala50 55 60Asp Ile Phe Ile Ala Ser Leu Ala Val Ala Asp Leu Thr Phe Val Val65 70 75 80Thr Leu Pro Leu Trp Ala Thr Tyr Thr Tyr Arg Asp Tyr Asp Trp Pro85 90 95Phe Gly Thr Phe Phe Cys Lys Leu Ser Ser Tyr Leu lle Phe Val Asn100 105 110Met Tyr Ala Ser Val Phe Cys Leu Thr Gly Leu Ser Phe Asp Arg Tyr115 120 125Leu Ala Ile Val Arg Pro Val Ala Asn Ala Arg Leu Arg Leu Arg Val130 135 140Ser Gly Ala Val Ala Thr Ala Val Leu Trp Val Leu Ala Ala Leu Leu145 150 155 160Ala Met Pro Val Met Val Leu Arg Thr Thr Gly Asp Leu Glu Ash Thr165 170 175Thr Lys Val Gln Cys Tyr Met Asp Tyr Ser Met Val Ala Thr Val Ser180 185 190Ser Glu Trp Ala Trp Glu Val Gly Leu Gly Val Ser Ser Thr Thr Val195 200 205Gly Phe Val Val Pro Phe Thr Ile Met Leu Thr Cys Tyr Phe Phe Ile210 215 220Ala Gln Thr Ile Ala Gly His Phe Arg Lys Glu Arg Ile Glu Gly Leu225 230 235 240Arg Lys Arg Arg Arg Leu Leu Ser Ile Ile Val Val Leu Val Val Thr245 250 255Phe Ala Leu Cys Trp Met Pro Tyr His Leu Val Lys Thr Leu Tyr Met260 265 270Leu Gly Ser Leu Leu His Trp Pro Cys Asp Phe Asp Leu Phe Leu Met275 280 285Ash Ile Phe Pro Tyr Cys Thr Cys Ile Ser Tyr Val Ash Ser Cys Leu290 295 300Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Phe Phe Asp Pro Arg Phe Arg Gln Ala Cys305 310 315 320Thr Ser Met Leu Cys Cys Gly Gln Ser Arg Cys Ala Gly Thr Ser His325 330 335Ser Ser Ser Gly Glu Lys Ser Ala Ser Tyr Ser Ser Gly His Ser Gln340 345 350Gly Pro Gly Pro Ash Met Gly Lys Gly Gly Glu Gln Met His Glu Lys355 360 365Ser Ile Pro Tyr Ser Gln Glu Thr Leu Val Val Asp370 375 380〈210〉4〈211〉1140〈212〉DNA〈213〉未知〈220〉〈223〉〈400〉4ATGGAGGAAG GTGGTGATTT TGACAACTAC TATGGGGCAG ACAACCAGTC TGAGTGTGAG 60TACACAGACT GGAAATCCTC GGGGGCCCTC ATCCCTGCCA TCTACATGTT GGTCTTCCTC 120CTGGGCACCA CGGGAAACGG TCTGGTGCTC TGGACCGTGT TTCGGAGCAG CCGGGAGAAG 180AGGCGCTCAG CTGATATCTT CATTGCTAGC CTGGCGGTGG CTGACCTGAC CTTCGTGGTG 240ACGCTGCCCC TGTGGGCTAC CTACACGTAC CGGGACTATG ACTGGCCCTT TGGGACCTTC 300TTCTGCAAGC TCAGCAGCTA CCTCATCTTC GTCAACATGT ACGCCAGCGT CTTCTGCCTC 360ACCGGCCTCA GCTTCGACCG CTACCTGGCC ATCGTGAGGC CAGTGGCCAA TGCTCGGCTG 420AGGCTGCGGG TCAGCGGGGC CGTGGCCACG GCAGTTCTTT GGGTGCTGGC CGCCCTCCTG 480GCCATGCCTG TCATGGTGTT ACGCACCACC GGGGACTTGG AGAACACCAC TAAGGTGCAG 540TGCTACATGG ACTACTCCAT GGTGGCCACT GTGAGCTCAG AGTGGGCCTG GGAGGTGGGC 600CTTGGGGTCT CGTCCACCAC CGTGGGCTTT GTGGTGCCCT TCACCATCAT GCTGACCTGT 660TACTTCTTCA TCGCCCAAAC CATCGCTGGC CACTTCCGCA AGGAACGCAT CGAGGGCCTG 720CGGAAGCGGC GCCGGCTGCT CAGCATCATC GTGGTGCTGG TGGTGACCTT TGCCCTGTGC 780TGGATGCCCT ACCACCTGGT GAAGACGCTG TACATGCTGG GCAGCCTGCT GCACTGGCCC 840TGTGACTTTG ACCTCTTCCT CATGAACATC TTCCCCTACT GCACCTGCAT CAGCTACGTC 900AACAGCTGCC TCAACCCCTT CCTCTATGCC TTTTTCGACC CCCGCTTCCG CCAGGCCTGC 960ACCTCCATGC TCTGCTGTGG CCAGAGCAGG TGCGCAGGCA CCTCCCACAG CAGCAGTGGG 1020GAGAAGTCAG CCAGCTACTC TTCGGGGCAC AGCCAGGGGC CCGGCCCCAA CATGGGCAAG 1080GGTGGAGAAC AGATGCACGA GAAATCCATC CCCTACAGCC AGGAGACCCT TGTGGTTGAC 1140〈210〉5〈211〉25〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉5CGTGGSCMTS STGGGCAACN YCCTG25〈210〉6〈211〉27〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉6GTNGWRRGGC ANCCAGCAGA KGGCAAA 27〈210〉7〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉7CAGACAACCA GTCTGAGTGT GAGT 24〈210〉8〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉8ATGGATTTCT CGTGCATCTG TTCT 24〈210〉9〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉9CTGGCAGGGA GGCAGGAGGAA 21〈210〉10〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉10GCAGGAGGAA ATTTCGCAGA CAGC 24〈210〉11〈211〉23〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉11GAAGAGAATT CATCTGTGGA GTA23〈210〉12〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉12ACCGGCACCG GGAGGGCACT T21〈210〉13〈211〉26〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉13GAGAGTCGCG GGCAGAGCAG CGTCAG 26〈210〉14〈211〉26〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉14GAAATCATCC AAGTGAGGGG CGAGAC 26〈210〉15〈211〉77〈212〉PRT〈213〉小鼠〈400〉15Met Asn Leu Arg Leu Cys Val Gln Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Ser1 5 10 15Leu Thr Ala Val Cys Gly Val Pro Leu Met Leu Pro Pro Asp Gly Thr20 25 30Gly Leu Glu Glu Gly Ser Met Arg Tyr Leu Val Lys Pro Arg Thr Ser35 40 45Arg Thr Gly Pro Gly Ala Trp Gln Gly Gly Arg Arg Lys Phe Arg Arg50 55 60Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe65 70 75 77〈210〉16〈211〉231〈212〉DNA〈213〉小鼠〈400〉16ATGAATCTGA GGCTCTGCGT GCAGGCGCTG CTGCTGCTCT GGCTCTCCTT GACTGCAGTT 60TGTGGAGTGC CACTGATGTT GCCTCCAGAT GGAACAGGAC TAGAAGAAGG AAGCATGCGC 120TACCTGGTGA AGCCCAGAAC TTCGAGGACT GGACCAGGAG CCTGGCAGGG AGGCAGGAGG 180AAATTTCGCA GACAGCGCCC CCGGCTCTCC CATAAGGGCC CCATGCCTTT C 231〈210〉17〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉17GAATCTGAGT TTCTGCGTGC AGGC 24〈210〉18〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉18TTAGAAAGGC ATGGGGCCCT TATG 24〈210〉19〈211〉26〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉19GTAGTTGGGA GTCGCGGGCA GAGCAC 26〈210〉20〈211〉26〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉20TAGAACCATG TCAGGATCAG CACTTT 26〈210〉21〈211〉26〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉21AGTCGACGCA TGAATCTGAG TTTCTG 26〈210〉22〈211〉26〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉22GAGCCCTTCA AGCTAGCTTT AGAAAG 26〈210〉23〈211〉26〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉23GTGCCACTGA TGCTGCCTCC AGATGG 26〈210〉24〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉24TTAGAAAGGC ATGGGTCCCT TATG 24〈210〉25〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉25ACGGCAATGT CCGCCACCTG GTGC 24〈210〉26〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉26CCCTGGCAGG GAGGTCGGAG GAAA 24〈210〉27〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉27GGGCCGCTGG CGGCGGAATT TCCT 24〈210〉28〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉28GCTGCACCAG GTGGCGGACA TTGC 24〈210〉29〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉29TTGGCCTCCG GGCGCCCGAC CTCT 24〈210〉30〈211〉27〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉30GACATAACCG CAGGGGGTGG GCACTTG 30〈210〉31〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉31CCTGCTGCTC TGGCTCTGCC TGAG 24〈210〉32〈211〉27〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉32CCATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC 27〈210〉33〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉33GCGGTGTGCG GAGGACCCCT GCTG 24〈210〉34〈211〉23〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉34ACTCCTATA GGGCTCGAGC GGC 23〈210〉35〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉35GGCCGCGGCG GCCCAAGGAG CAGC 24〈210〉36〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉36GCGTGTGGTG GCCCCTTCGG TCCT 24〈210〉37〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉37AATCACAGGG GGTGGGCGTG TGGT 24〈210〉38〈211〉77〈212〉PRT〈213〉大鼠〈400〉38Met Asn Leu Ser Phe Cys Val Gln Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Ser1 5 10 15Leu Thr Ala Val Cys Gly Val Pro Leu Met Leu Pro Pro Asp Gly Lys20 25 30Gly Leu Glu Glu Gly Asn Met Arg Tyr Leu Val Lys Pro Arg Thr Ser35 40 45Arg Thr Gly Pro Gly Ala Trp Gln Gly Gly Arg Arg Lys Phe Arg Arg50 55 60Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe65 70 75 77〈210〉39〈211〉231〈212〉DNA〈213〉大鼠〈400〉39ATGAATCTGA GTTTCTGCGT GCAGGCGCTG CTGCTGCTCT GGCTCTCCTT GACTGCCGTG 60TGTGGAGTGC CACTGATGCT GCCTCCAGAT GGGAAAGGGC TAGAAGAAGG CAACATGCGC 120TACCTGGTGA AGCCCAGAAC TTCGAGGACT GGACCAGGGG CCTGGCAGGG AGGCAGGAGG 180AAATTTCGCA GACAGCGGCC CCGTCTCTCC CATAAGGGAC CCATGCCTTT C 231〈210〉40〈211〉77〈212〉PRT〈213〉人〈400〉40Met Asn Leu Arg Leu Cys Val Gln Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Ser1 5 10 15Leu Thr Ala Val Cys Gly Gly Ser Leu Met Pro Leu Pro Asp Gly Asn20 25 30Gly Leu Glu Asp Gly Asn Val Arg His Leu Val Gln Pro Arg Gly Ser35 40 45Arg Asn Gly Pro Gly Pro Trp Gln Gly Gly Arg Arg Lys Phe Arg Arg50 55 60Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe65 70 75 77〈210〉41〈211〉231〈212〉DNA〈213〉人〈400〉41ATGAATCTGC GGCTCTGCGT GCAGGCGCTC CTGCTGCTCT GGCTCTCCTT GACCGCGGTG 60TGTGGAGGGT CCCTGATGCC GCTTCCCGAT GGGAATGGGC TGGAAGACGG CAATGTCCGC 120CACCTGGTGC AGCCCAGAGG GTCAAGGAAT GGGCCAGGGC CCTGGCAGGG AGGTCGGAGG 180AAATTCCGCC GCCAGCGGCC CCGCCTCTCC CATAAGGGAC CCATGCCTTT C 231〈210〉42〈211〉77〈212〉PRT〈213〉牛〈400〉35Met Asn Leu Arg Arg Cys Val Gln Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Cys1 5 10 15Leu Ser Ala Val Cys Gly Gly Pro Leu Leu Gln Thr Ser Asp Gly Lys20 25 30Glu Met Glu Glu Gly Thr Ile Arg Tyr Leu Val Gln Pro Arg Gly Pro35 40 45Arg Ser Gly Pro Gly Pro Trp Gln Gly Gly Arg Arg Lys Phe Arg Arg50 55 60Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe65 70 75 77〈210〉43〈211〉231〈212〉DNA〈213〉牛〈400〉43ATGAATCTGC GGCGCTGCGT GCAGGCGCTC CTGCTGCTCT GGCTCTGCCT GAGCGCGGTG 60TGCGGAGGAC CCCTGCTGCA GACTTCTGAC GGGAAGGAGA TGGAAGAAGG CACCATCCGA 120TACCTGGTGC AGCCCAGGGG GCCGAGGAGC GGCCCAGGCC CCTGGCAGGG AGGTCGGAGG 180AAGTTCCGGC GCCAGCGGCC ACGCCTCTCC CACAAGGGTC CCATGCCTTT C 23权利要求
1．能够与包括由SEQ ID No3代表的氨基酸序列或其实质性等同物的受体蛋白质结合的多肽、其前体多肽、其酰胺或酯，或其盐。
2．权利要求1的多肽，其包括由SEQ ID No1代表的氨基酸序列或其实质性等同物。
3．权利要求1的多肽，其包括由SEQ ID No15、38、40或42代表之氨基酸序列的部分序列。
4．权利要求1的多肽，其包括(a)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第6至77位氨基酸残基的肽，(b)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第40至77位氨基酸残基的肽，(c)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第42至77位氨基酸残基的肽，(d)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第47至77位氨基酸残基的肽，(e)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第61至77位氨基酸残基的肽，(f)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第65至77位氨基酸残基的肽，或因其N末端氨基酸(Gln)转变成焦谷氨酸残基而产生的衍生物，(g)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第1至25位氨基酸残基的肽，(h)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第6至25位氨基酸残基的肽，(i)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第42至64位氨基酸残基的肽，(j)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第61至64位氨基酸残基的肽，(k)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第43至77位氨基酸残基的肽，(l)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第41至77位氨基酸残基的肽，(m)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第66至77位氨基酸残基的肽，(n)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第67至77位氨基酸残基的肽，(o)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第64至77位氨基酸残基的肽，(p)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第63至77位氨基酸残基的肽，(q)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第65至76位氨基酸残基的肽，(r)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第65至75位氨基酸残基的肽，或(s)包括SEQ ID No15、38、40或42所代表的氨基酸序列的第65至75位氨基酸残基的肽。
5．权利要求1的多肽，其包括由SEQ ID No15、SEQ ID No38、SEQID No40或SEQ ID No42代表的氨基酸序列中从第65位至第77位氨基酸残基的氨基酸序列。
6．权利要求1的多肽，其具有氨基酸序列pGlu Arg Pro Arg Leu SerHis Lys Gly Pro Met Pro Phe。
7．权利要求1的多肽，其包括由SEQ ID No15、SEQ ID No38、SEQID No40或SEQ ID No42代表的氨基酸序列中从第42位至第77位氨基酸残基的氨基酸序列。
8．权利要求1的多肽，其为具有SEQ ID No15所代表的氨基酸序列或其实质性等同物的前体多肽。
9．权利要求1的多肽，其为具有由SEQ ID No38所代表的氨基酸序列或其实质性等同物的前体多肽。
10．权利要求1的多肽，其为具有由SEQ ID No40所代表的氨基酸序列或其实质性等同物的前体多肽。
11．权利要求1的多肽，其为具有由SEQ ID No42所代表的氨基酸序列或其实质性等同物的前体多肽。
12．一种DNA，其包括具有编码能够与受体蛋白质结合之多肽或其前体多肽的核苷酸序列的DNA，所说的受体蛋白质包括由SEQ ID No3所代表的氨基酸序列或其实质性等同物。
13．权利要求12的DNA，其中由之编码的多肽包括SEQ ID No1所代表的氨基酸序列或其实质性等同物。
14．权利要求12的DNA，其中由之编码的多肽包括由SEQ IDNo15、SEQ ID No38、SEQ ID No40或SEQ ID No42所代表之氨基酸序列中从第65位至第77位氨基酸残基的氨基酸序列。
15．权利要求12的DNA，其中由之编码的多肽包括由SEQ IDNo15、SEQ ID No38、SEQ ID No40或SEQ ID No42所代表的氨基酸序列中第42位至第77位氨基酸残基的氨基酸序列。
16．权利要求12的DNA，其中由之编码的前体多肽包括由SEQ IDNo15所代表的氨基酸序列或其实质性等同物。
17．权利要求12的DNA，其中由之编码的前体多肽包括由SEQ IDNo38所代表的氨基酸序列或其实质性等同物。
18．权利要求12的DNA，其中由之编码的前体多肽包括由SEQ IDNo40所代表的氨基酸序列或其实质性等同物。
19．权利要求12的DNA，其中由之编码的前体多肽包括由SEQ IDNo42所代表的氨基酸序列或其实质性等同物。
20．包括权利要求12的DNA的重组载体。
21．携带权利要求12的DNA或权利要求20的重组载体的转化体。
22．生产多肽、其前体多肽或其盐的方法，该方法包括培养权利要求21的转化体。
23．一种药物组合物，其中包括如权利要求1的多肽、其前体多肽，其酰胺或酯，或其盐。
24．一种药物组合物，其中包括权利要求12的DNA。
25．权利要求23或24的药物组合物，其为中枢神经系统功能调节剂、循环功能调节剂、免疫功能调节剂、胃肠功能调节剂、代谢功能调节剂或生殖功能调节剂。
26．抗权利要求1的多肽或其前体多肽的抗体。
27．包括权利要求26的抗体的诊断组合物。
28．筛选能改变权利要求1的多肽与包括SEQ ID No3氨基酸序列之受体蛋白质的结合活性的化合物的方法，其包括使用权利要求1的多肽和所说的受体蛋白质。
全文摘要
本发明涉及一种参予调节中枢神经系统功能、循环功能、免疫功能、胃肠功能、代谢功能、生殖功能等的多肽,其可用作治疗或预防HIV或爱滋病(获得性免疫缺陷综合症)等各种疾病的药物。
文档编号C07K14/705GK1283228SQ98812634
公开日2001年2月7日 申请日期1998年12月22日 优先权日1997年12月24日
发明者日沼州司, 立元一彦, 细谷昌树, 羽畑祐吾, 藤井亮, 北田千惠子 申请人:武田药品工业株式会社