用于蛋白质表达的酵母启动子的制作方法
【专利说明】用于蛋白质表达的酵母启动子
[0001] 与相关申请的交叉引用 本申请要求于2013年3月8日提交的美国临时申请序列号61/775,029的优先权，该 临时申请通过引用结合到本文中。
[0002] 公开内容领域 本发明涉及用于生产蛋白质和多肽的分离核酸、表达方法、宿主细胞、表达载体和DNA构建体，并且涉及使用所述表达方法生产的蛋白质和多肽。更特别地，本发明涉及从巴斯德 毕赤酵母分离的核酸，其中所述核酸具有启动子活性。本发明还涉及 用于使用巴斯德毕赤酵母启动子生产蛋白质和多肽的表达方法、宿主细胞、表达载体和DNA 构建体，并涉及使用所述表达方法生产的蛋白质和多肽。
[0003] 发明背景和概述 酵母表达系统可用于有效地生产蛋白质，例如酶、激素和疫苗蛋白质，部分上是因为一 些酵母迅速生产至高细胞密度，在简单和廉价的介质中生长，并且为真核生物因此可以以 与哺乳动物中天然蛋白质相似的方式修饰蛋白质。此外，用合适的信号序列，表达的蛋白质 可被分泌入培养基中以方便分离和纯化。一些酵母表达系统还为食品和制药工业所接受， 因为其对于药物和食物产品的生产是安全的，不像真菌和细菌表达系统，它们可能在一些 情况下，例如，对人食品制造，是不安全的。
[0004] 因此，开发或改善可用于表达高水平蛋白质以增加产率、减少蛋白质分离和纯化 费用以及降低人和动物健康产品和食物产品的成本的酵母表达系统，对多种工业，例如食 品和动物饲料工业、人和动物健康工业等是有益的。
[0005] 已经开发了多种类型的酵母表达系统，包括使用编码同源或异源蛋白质的核酸在 酵母启动子控制下的诱导性或组成型蛋白质表达。启动子为连接编码蛋白质的核酸的5' 末端的调节元件，并且可与宿主细胞（例如，酵母宿主细胞）中的多种调节因子相互作用以 控制RNA从DNA转录。启动子还可控制RNA从DNA转录的时间。例如，在酵母菌巴斯德毕 赤酵母中已经鉴定出Α0Χ1启动子，并通常用于酵母表达系统中，因为其为紧密调节的强启 动子。
[0006] 由于酵母表达系统对多种工业，包括人类制药工业以及人食品和动物饲料工业的 重要性，酵母表达系统的改善为许多研究和开发的焦点。因此，本发明人从巴斯德毕赤酵母 中鉴定了对用于蛋白质在酵母中表达特别有效的启动子。本文所述启动子可用在，例如，甲 醇-诱导性酵母表达系统中或用在用于蛋白质组成型表达的表达系统中。
[0007] 在本发明一个说明性实施方案中，提供了一种分离核酸，其中所述分离核酸的序 列包含，例如，与选自如本文所述的SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDΝ0:4、 SEQIDN0:5和SEQID勵:6的序列具有至少90%、95%或98%同一性，或与其片段具有至 少90%、95%或98%同一性的序列，其中所述分离核酸包含甲醇-诱导性的巴斯德毕赤酵母 启动子序列。在其它实施方案中，提供包含这些启动子序列的表达载体、宿主细胞和DNA构 建体。
[0008] 在另一个实施方案中，提供使用这些启动子序列生产蛋白质的方法。所述方法包 括在培养基中培养含有包含任何上述启动子序列与编码蛋白质的异源编码序列操作性连 接的第一个表达盒的宿主细胞的步骤，其中所述培养在允许该蛋白质表达的条件下进行。 在另一个说明性实施方案中，提供根据该方法生产的分离蛋白质。
[0009] 在本发明的一个说明性实施方案中，提供一种分离核酸，其中所述分离核酸的 序列包含，例如，与选自如本文所述的SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQID N0:10、SEQIDN0:11、SEQIDN0:12、SEQIDN0:13和SEQIDN0:14的序列具有至少90%、 95%或98%同一性，或与其片段具有至少90%、95%或98%同一性的序列，其中所述分离核酸 包含组成型巴斯德毕赤酵母启动子序列。在其它实施方案中，提供包含这些启动子序列的 表达载体、宿主细胞和DNA构建体。
[0010] 在另一个实施方案中，提供使用这些启动子序列生产蛋白质的方法。所述方法包 括在培养基中培养含有包含任何上述启动子序列与编码蛋白质的异源编码序列操作性连 接的第一个表达盒的宿主细胞的步骤，其中所述培养在允许该蛋白质表达的条件下进行。 在另一个说明性实施方案中，提供根据该方法生产的分离蛋白质。
[0011] 下列条款清单中描述的所有实施方案也被考虑为按照本发明使用。对于下列条款 中所述的所有实施方案，认为实施方案的任何可应用的组合均与本发明一致。
[0012] 1. -种分离核酸，其中所述分离核酸的序列包含与选自SEQIDN0:1、SEQID N0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5 和SEQIDN0:6 的序列具有至少 90% 同一 性，或与其片段具有至少90%同一性的序列，其中所述分离核酸包含甲醇-诱导性巴斯德毕 赤酵母启动子序列。
[0013] 2.条款1的分离核酸，其中所述分离核酸的序列与选自SEQIDN0:1、SEQID N0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5 和SEQIDN0:6 的序列具有至少 95% 同一 性，或与其片段具有至少95%同一性。
[0014] 3.条款1的分离核酸，其中所述分离核酸的序列与选自SEQIDN0:1、SEQID N0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5 和SEQIDN0:6 的序列具有至少 98% 同一 性，或与其片段具有至少98%同一性。
[0015] 4.条款1的分离核酸序列，其中所述分离核酸的序列为选自SEQIDN0:1、SEQID N0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5 和SEQIDN0:6 的序列，或其片段。
[0016] 5.条款1-4中任一项的分离核酸，与异源编码序列操作性连接。
[0017] 6.条款5的分离核酸，其中所述异源编码序列编码选自毒素、抗体、激素、酶、生 长因子、细胞因子、结构蛋白、免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白的蛋白质。
[0018] 7.条款6的分离核酸，其中所述蛋白质为用于动物饲料的酶。
[0019] 8.条款7的分离核酸，其中所述蛋白质选自植酸酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、淀 粉酶、葡聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶和木聚糖酶。
[0020] 9.条款8的分离核酸，其中所述蛋白质为植酸酶。
[0021] 10.条款8的分离核酸，其中所述蛋白质为半乳糖苷酶。
[0022] 11.包含条款1-10中任一项的分离核酸的表达载体。
[0023] 12.包含条款11的表达载体的宿主细胞。
[0024] 13.包含条款1-10中任一项的分离核酸的宿主细胞。
[0025] 14.条款12或13中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞为毕赤酵母属物种。
[0026] 15.条款14的宿主细胞，其中所述毕赤酵母属物种为巴斯德毕赤酵母。
[0027] 16.包含条款1-10中任一项的分离核酸的DNA构建体。
[0028] 17.生产蛋白质的方法，所述方法包括步骤 在培养基中培养含有包含条款1-4中任一项的分离核酸与编码蛋白质的异源编码序 列操作性连接的第一个表达盒的宿主细胞，其中所述培养在允许该蛋白质表达的条件下进 行。
[0029] 18.条款17的方法，其中所述蛋白质选自毒素、抗体、激素、酶、生长因子、细胞因 子、结构蛋白、免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白。
[0030] 19.条款18的方法，其中所述蛋白质为用于动物饲料的酶。
[0031] 20.条款19的方法，其中所述蛋白质选自植酸酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、淀粉 酶、葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶和木聚糖酶。
[0032] 21.条款20的方法，其中所述蛋白质为植酸酶。
[0033] 22.条款20的方法，其中所述蛋白质为半乳糖苷酶。
[0034] 23.条款17-22中任一项的方法，其中所述蛋白质使用第一个表达盒与第二个表 达盒组合表达。
[0035] 24.条款23的方法，其中所述第二个表达盒包含编码蛋白质的异源编码序列与 具有包含SEQIDN0:15或SEQIDN0:16的序列或任何其它A0X1或A0X2启动子序列的序 列的分离核酸操作性连接，其中SEQIDN0:15和SEQIDN0:16具有启动子活性。
[0036] 25.条款24的方法，其中所述蛋白质使用第一个表达盒、第二个表达盒和第三个 表达盒表达。
[0037] 26.条款25的方法，其中所述第三个表达盒包含编码蛋白质的异源编码序列与 具有与选自SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5 和SEQ IDNO: 6的序列具有至少90%同一"性，或与其片段具有至少90%同一"性的序列的分离核酸操 作性连接。
[0038] 27.条款23的方法，其中所述第二个表达盒包含编码蛋白质的异源编码序列与 具有与选自SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5 和SEQ IDNO: 6的序列具有至少90%同一"性，或与其片段具有至少90%同一"性的序列的分离核酸操 作性连接。
[0039] 28.根据条款17-27中任一项的方法生产的分离蛋白质。
[0040] 29. -种分离核酸，其中所述分离核酸的序列包含与选自SEQIDN0:7、SEQID N0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:11、SEQIDN0:12、SEQIDN0:13和SEQID NO: 14的序列具有至少90%同一性，或与其片段具有至少90%同一性的序列，其中所述核酸 包含组成型巴斯德毕赤酵母启动子的序列。
[0041] 30.条款29的分离核酸，其中所述分离核酸的序列与选自SEQIDN0:7、SEQID N0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:11、SEQIDN0:12、SEQIDN0:13和SEQID NO: 14的序列具有至少95%同一性，或与其片段具有至少95%同一性。
[0042] 31.条款29的分离核酸，其中所述分离核酸的序列与选自SEQIDN0:7、SEQID N0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:11、SEQIDN0:12、SEQIDN0:13和SEQID NO: 14的序列具有至少98%同一性，或与其片段具有至少98%同一性。
[0043] 32.条款29的分离核酸序列，其中所述分离核酸的序列为选自SEQIDN0:7、SEQ IDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:11、SEQIDN0:12、SEQIDN0:13和SEQ IDNO: 14的序列，或其片段。
[0044] 33.条款29-32中任一项的分离核酸，与异源编码序列操作性连接。
[0045] 34.条款33的分离核酸，其中所述异源编码序列编码选自毒素、抗体、激素、酶、 生长因子、细胞因子、结构蛋白、免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白的蛋白质。
[0046] 35.条款34的分离核酸，其中所述蛋白质为用于动物饲料的酶。
[0047] 36.条款35的分离核酸，其中所述蛋白质选自植酸酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、 淀粉酶、葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶和木聚糖酶。
[0048] 37.条款36的分离核酸，其中所述蛋白质为植酸酶。
[0049] 38.条款36的分离核酸，其中所述蛋白质为半乳糖苷酶。
[0050] 39.包含条款29-38中任一项的分离核酸的表达载体。
[0051] 40.包含条款39的表达载体的宿主细胞。
[0052] 41.包含条款29-38中任一项的分离核酸的宿主细胞。
[0053] 42.条款40或41中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞为毕赤酵母属物种。
[0054] 43.条款42的宿主细胞，其中所述毕赤酵母属物种为巴斯德毕赤酵母。
[0055] 44.包含条款29-38中任一项的分离核酸的DNA构建体。
[0056] 45.生产蛋白质的方法，所述方法包括在培养基中培养含有包含条款29-38中任 一项的分离核酸与编码蛋白质的异源编码序列操作性连接的第一个表达盒的宿主细胞的 步骤，其中所述培养在允许该蛋白质表达的条件下进行。
[0057] 46.条款45的方法，其中所述蛋白质选自毒素、抗体、激素、酶、生长因子、细胞因 子、结构蛋白、免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白。
[0058] 47.条款46的方法，其中所述蛋白质为用于动物饲料的酶。
[0059] 48.条款47的方法，其中所述蛋白质选自植酸酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、淀粉 酶、葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶和木聚糖酶。
[0060] 49.条款48的方法，其中所述蛋白质为植酸酶。
[0061] 50.条款48的方法，其中所述蛋白质为半乳糖苷酶。
[0062] 51.条款45-50中任一项的方法，其中所述蛋白质使用第一个表达盒与第二个表 达盒组合表达。
[0063] 52.条款51的方法，其中所述第二个表达盒包含编码蛋白质的异源编码序列与 具有包含SEQIDN0:15或SEQIDN0:16的序列或任何其它A0X1或A0X2启动子序列的序 列的分离核酸操作性连接，其中SEQIDN0:15和SEQIDN0:16具有启动子活性。
[0064] 53.条款51的方法，其中所述蛋白质使用第一个表达盒、第二个表达盒和第三个 表达盒表达。
[0065] 54.条款53的方法，其中所述第三个表达盒包含编码蛋白质的异源编码序列与 具有与选自SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:11、SEQ IDNO: 12、SEQIDNO: 13的序列具有至少90%同一性，或与其片段具有至少90%同一性的 序列的分离核酸操作性连接。
[0066] 55.条款51的方法，其中所述第二个表达盒包含编码蛋白质的异源编码序列与 具有与选自SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:11、SEQ IDNO: 12、SEQIDNO: 13的序列具有至少90%同一性，或与其片段具有至少90%同一性的 序列的分离核酸操作性连接。
[0067] 56.根据条款45-55中任一项的方法生产的分离蛋白质。
[0068] 57.条款40或41中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属 物种、毕赤酵母属（/YcAia)物种、酵母菌属物种、裂殖 酵母属（物种、有孢圆酵母属（物种、假丝酵母属 物种、耶氏酵母属（/arroria)物种和克鲁维酵母属物种。 [0069] 58.包含条款44的DNA构建体的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属 物种、毕赤酵母属物种、酵母菌属物种、裂殖