来自巴斯德毕赤酵母的酵母启动子的制作方法
【专利说明】来自巴斯德毕赤酵母的酵母启动子
[0001] 与相关申请的交叉引用 本申请要求于2013年3月8日提交的美国临时申请序列号61/774,982的权益，该临 时申请通过引用结合到本文中。
[0002] 公开内容领域 本发明涉及用于生产蛋白质的分离核酸、表达方法、宿主细胞、表达载体和DNA构建 体，并且涉及使用所述表达方法生产的蛋白质。更特别地，本发明涉及从巴斯德毕赤酵母 (/VcAia/Λ36·ioris)分离的核酸，其中所述核酸具有启动子活性。本发明还涉及用于使用巴 斯德毕赤酵母启动子生产蛋白质的表达方法、宿主细胞、表达载体和DNA构建体，并涉及使 用所述表达方法生产的蛋白质。
[0003] 背景和发明概述 酵母表达系统可用于有效地生产蛋白质，例如酶、激素和疫苗蛋白质，部分上是因为一 些酵母迅速生长至高细胞密度，在简单和廉价的培养基中生长，并且为真核生物，因此可以 以与哺乳动物中天然蛋白质相似的方式修饰蛋白质。此外，用合适的信号序列，表达的蛋白 质可被分泌入培养基中以方便分离和纯化。一些酵母表达系统还为食品和制药工业所接 受，因为其对于药物和食物产品的生产是安全的，不像真菌和细菌表达系统，它们可能在一 些情况下是不安全的，例如对于人食品制造。
[0004] 因此，开发或改善可用于表达高水平蛋白质以增加产率、减少蛋白质分离和纯化 费用以及降低人和动物健康产品和食物产品的成本的酵母表达系统，对多种工业例如食品 和动物饲料工业、人和动物健康工业等是有益的。
[0005]已经开发了多种类型的酵母表达系统，包括使用编码同源或异源蛋白质的核酸在 酵母启动子控制下的诱导性或组成型蛋白质表达。启动子为连接编码蛋白质的核酸的5' 末端的调节元件，并且可与宿主细胞（例如，酵母宿主细胞）中的多种调节因子相互作用以 控制RNA从DNA转录。启动子还可控制RNA从DNA转录的时机。例如，在酵母的巴斯德毕 赤酵母中已经鉴定出A0X1启动子，并通常用于酵母表达系统中，因为其为紧密调节的强启 动子。
[0006] 由于酵母表达系统对包括人类制药工业以及人食品和动物饲料工业在内的多种 工业的重要性，酵母表达系统的改善为许多研究和开发的焦点。因此，本发明人从巴斯德毕 赤酵母中鉴定了对用于蛋白质在酵母中表达特别有效的启动子。本文所述启动子可用在例 如用于蛋白质组成型表达的表达系统中。
[0007] 在本发明一个说明性实施方案中，提供了一种分离核酸，其中所述分离核酸的序 列包含例如与选自本文所述的SEQIDN0:1和SEQIDN0:2的序列具有至少90%、95%或 98%同一性，或与其片段具有至少90%、95%或98%同一性的序列，其中所述分离核酸包含组 成型巴斯德毕赤酵母启动子序列。在其它实施方案中，提供包含这些启动子序列的表达载 体、宿主细胞和DNA构建体。
[0008] 在另一个实施方案中，提供使用这些启动子序列生产蛋白质的方法。所述方法包 括在培养基中培养含有包含与编码蛋白质的异源编码序列操作性连接的任何上述启动子 序列的第一表达盒的宿主细胞的步骤，其中所述培养在允许该蛋白质表达的条件下进行。 在另一个说明性实施方案中，提供根据该方法生产的分离蛋白质。
[0009] 下列条款清单中描述的所有实施方案也被考虑为按照本发明使用。对于下列条款 中所述的所有实施方案，认为实施方案的任何可应用的组合均与本发明一致。
[0010] 1. 一种分离核酸，其中所述分离核酸的序列包含与选自SEQIDNO: 1和SEQID NO:2的序列具有至少90%同一性或与其片段具有至少90%同一性的序列，其中所述分离核 酸包含组成型巴斯德毕赤酵母启动子序列。
[0011] 2.条款1的分离核酸，其中所述分离核酸的序列与选自SEQIDNO: 1和SEQID NO:2的序列具有至少95%同一性，或与其片段具有至少95%同一性。
[0012] 3.条款1的分离核酸，其中所述分离核酸的序列与选自SEQIDNO: 1和SEQID NO:2的序列具有至少98%同一性，或与其片段具有至少98%同一性。
[0013] 4.条款1的分离核酸序列，其中所述分离核酸的序列为选自SEQIDN0:1和SEQ IDNO:2的序列或其片段。
[0014] 5.条款1-4中任一项的分离核酸，其中所述分离核酸与异源编码序列操作性连 接。
[0015] 6.条款5的分离核酸，其中所述异源编码序列编码选自毒素、抗体、激素、酶、生 长因子、细胞因子、结构蛋白、免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白的蛋白质。
[0016] 7.条款6的分离核酸，其中所述蛋白质为用于动物饲料的酶。
[0017] 8.条款7的分离核酸，其中所述蛋白质选自植酸酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、淀 粉酶、葡聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶和木聚糖酶。
[0018] 9.条款8的分离核酸，其中所述蛋白质为植酸酶。
[0019] 10.条款8的分离核酸，其中所述蛋白质为半乳糖苷酶。
[0020] 11.包含条款1-10中任一项的分离核酸的表达载体。
[0021] 12.包含条款11的表达载体的宿主细胞。
[0022] 13.包含条款1-10中任一项的分离核酸的宿主细胞。
[0023] 14.条款12或13中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞为毕赤酵母属 (/YcAia)物种。
[0024] 15.条款14的宿主细胞，其中所述毕赤酵母属物种为巴斯德毕赤酵母。
[0025] 16.包含条款1-10中任一项的分离核酸的DNA构建体。
[0026] 17.生产蛋白质的方法，所述方法包括在培养基中培养含有包含与编码蛋白质的 异源编码序列操作性连接的条款1-4中任一项的分离核酸的第一表达盒的宿主细胞的步 骤，其中所述培养在允许该蛋白质表达的条件下进行。
[0027] 18.条款17的方法，其中所述蛋白质选自毒素、抗体、激素、酶、生长因子、细胞因 子、结构蛋白、免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白。
[0028] 19.条款18的方法，其中所述蛋白质为用于动物饲料的酶。
[0029] 20.条款19的方法，其中所述蛋白质选自植酸酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、淀粉 酶、葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶和木聚糖酶。
[0030] 21.条款20的方法，其中所述蛋白质为植酸酶。
[0031] 22.条款20的方法，其中所述蛋白质为半乳糖苷酶。
[0032] 23.条款17-22中任一项的方法，其中所述蛋白质使用第一表达盒与第二表达盒 组合表达。
[0033] 24.条款23的方法，其中所述第二表达盒包含：与具有包含SEQIDN0:3或SEQ IDNO:4的序列或任何其它A0X1或A0X2启动子序列的序列的分离核酸操作性连接的编码 蛋白质的异源编码序列，其中SEQIDN0:3和SEQIDN0:4具有启动子活性。
[0034] 25.条款24的方法，其中所述蛋白质使用第一表达盒、第二表达盒和第三表达盒 表达。
[0035] 26.条款25的方法，其中所述第三表达盒包含：与具有与选自SEQIDN0:1和SEQ IDN0:2的序列具有至少90%同一性或与其片段具有至少90%同一性的序列的分离核酸操 作性连接的编码蛋白质的异源编码序列。
[0036] 27.条款23的方法，其中所述第二表达盒包含：与具有与选自SEQIDN0:1和SEQ IDN0:2的序列具有至少90%同一性或与其片段具有至少90%同一性的序列的分离核酸操 作性连接的编码蛋白质的异源编码序列。
[0037] 28.根据条款17-27中任一项的方法生产的分离蛋白质。
[0038] 29.条款12或13中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞为甲基营养型酵母。
[0039] 30.条款29的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属（你物种、 毕赤酵母属物种和假丝酵母属物种。
[0040] 31.包含条款16的DNA构建体的宿主细胞，其中所述宿主细胞为甲基营养型酵 母。
[0041] 32.条款31的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属物种、毕赤酵母属物 种和假丝酵母属物种。
[0042] 33.条款17-27中任一项的方法，其中所述宿主细胞为甲基营养型酵母。
[0043] 34.条款33的方法，其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属物种、毕赤酵母属物种和 假丝酵母属物种。
[0044] 35.条款25的方法，其中所述第三表达盒包含：与具有包含SEQIDΝ0:3或SEQ IDNO:4的序列或任何其它A0X1或A0X2启动子序列的分离核酸操作性连接的编码蛋白质 的异源编码序列，其中SEQIDN0:3和SEQIDN0:4具有启动子活性。
[0045] 36.生产一种或多种蛋白质的方法，所述方法包括在培养基中培养包含第一表达 盒、第二表达盒以及一个或多个额外表达盒的宿主细胞的步骤，其中所述一个或多个额外 表达盒的每个包含与编码一种或多种蛋白质的异源编码序列操作性连接的条款1-4中任 一项的分离核酸，其中所述培养在允许该一种或多种蛋白质表达的条件下进行。
[0046] 37.条款17的方法，进一步包括从所培养的宿主细胞的培养基中纯化蛋白质的 步骤。
[0047] 38.条款36的方法，进一步包括从所培养的宿主细胞的培养基中纯化所述一种 或多种蛋白质的一种或多种的步骤。
[0048] 39.条款1-38中任一项的分离核酸、宿主细胞、表达载体、分离蛋白质、DNA构建 体或方法，其中所述分离核酸由SEQIDN0. 1-2中的任一个或其片段组成。
[0049] 40.由SEQIDN0. 1-2中的任一个或其片段组成的分离核酸。
[0050] 41.条款12或13的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属物种、毕赤酵母 属物种、酵母属物种、裂殖酵母属（5bAizasaccA3re^ce6·)物种、有孢圆 酵母属（Tbi^aSjDora)物种、假丝酵母属物种、耶氏酵母属（/amia)物种和克鲁维酵母 属 〇?7?/Κ6>_/??^6>6·)物种。
[0051] 42.条款5的分离核酸，其中所述异源编码序列编码选自毒素、抗体、激素、酶、生 长因子、细胞因子、结构蛋白、免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白的蛋白质或多肽。
[0052] 43.生产蛋白质或多肽的方法，所述方法包括在培养基中培养含有包含与编码蛋 白质的异源编码序列操作性连接的条款1-4中任一项的分离核酸的第一表达盒的宿主细 胞的步骤，其中所述培养在允许该蛋白质表达的条件下进行。
[0053] 44.条款23的方法，其中所述第二表达盒包含：与具有包含SEQIDΝ0:3或SEQ IDN0:4的序列或任何其它启动子序列的序列的分离核酸操作性连接的编码蛋白质的异源 编码序列，其中SEQIDN0:3和SEQIDN0:4具有启动子活性。
[0054] 45.条款25的方法，其中所述第三表达盒包含：与具有SEQIDN0:3或SEQID N0:4的序列或任何其它启动子序列的分离核酸操作性连接的编码蛋白质的异源编码序列， 其中SEQIDN0:3和SEQIDN0:4具有启动子活性。
[0055] 附图简述 图1显示Chrl-0469启动子的核苷酸序列（SEQIDN