专利名称：来自荚膜毕赤氏酵母的氧化还原酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及氧化还原酶，羰基化合物到对应的(S)-羟基化合物的对映体选择性还原的方法和涉及获得手性(R)-羟基化合物的方法。
对于药理活性化合物，芳族物质，信息素，农业化学药品或酶抑制剂的合成光学活性羟基化合物是具有广泛应用的有价值的手性组分。
同时，合适于在生物催化中大规模应用并且可以以低成本足够量地获得的羰基还原酶的数量是极其有限的。下面的依赖NADH的S-特异性羰基还原酶是已知的来自马肝的醇脱氢酶(HLADH)(EnzymeEngineering，6卷，1982，107页)，来自酵母的醇脱氢酶(YADH)(Alcohol dehydrogenasesTheEnzymes(1963)，25-83页。纽约Academic Press)，来自近平滑假丝酵母的羰基还原酶(CPCR)(US 5,523,223和US5,763,236)，来自红串红球菌(RECR)(US 5,523,223)和深色诺卡氏菌(Norcardia fusca)的羰基还原酶(Biosci.Biotechnol.Biochem.，63(10)(1999)，1721-1729页)，来自博伊丁氏假丝酵母的醇脱氢酶(Biochim.，Biophys.Acta 716，(1982)，298-307页)或来自硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus Solfutaricus)的醇脱氢酶(FEMSMicrobiology Letters，170(1999)，31-39页)。
以上提到的羰基还原酶迄今没有一种被大规模使用。其中的主要原因，除了通常太窄的底物谱或低的酶对映体选择性，首先是所说的酶的可得性。迄今不可能足量地和低成本地提供大部分以上提到的酶。
在以上提到的羰基还原酶的应用中产生的另一个问题是辅因子NADH或NADPH的再生。已知的方法使用底物偶联的辅酶再生，例如用2-丙醇，或酶偶联的辅酶再生，例如用甲酸脱氢酶。
用甲酸脱氢酶的酶偶联的辅酶再生的缺点是其低的比活性(4-10U/mg)，因此，即使重组的甲酸脱氢酶也是相对昂贵的(J.Biotechnol.Bioeng.64，187-193页)。
用异丙醇的底物偶联的辅酶再生的缺点是不利的平衡位置和对于使用的共底物，例如异丙醇不足的酶稳定性。
本发明的目的是提供氧化还原酶，其特征在于广的底物谱，高的对映体选择性和对于有机溶剂的高稳定性。
所说的目的通过氧化还原酶以这样一种方法达到，即使得其在NADH和水存在的条件下将羰基化合物还原成对应的(S)-羟基化合物。
现在已经发现以上提到的现有技术方法的缺点可以通过新的氧化还原酶避免。
本发明合适地涉及氧化还原酶，其可以从毕赤氏酵母属或假丝酵母属的酵母，特别是从荚膜毕赤氏酵母(Pichia capsulata)中获得。
在进一步的实施方案中，本发明涉及来自荚膜毕赤氏酵母的氧化还原酶，其具有根据SEQ ID NO8的DNA-序列和根据SEQ IDNO9的氨基酸序列。这些序列在附后的序列列表中描述。
在一种实施方案中，本发明涉及氧化还原酶，其中超过70％的氨基酸与氨基酸序列SEQ ID NO9是相同的并且其具有每mg蛋白质超过1μmol的比活性，基于乙基-4-氯-3-氧代丁酸到(R)-乙基-4-氯-3-羟基丁酸的反应。优选其中80％-99.5％，特别是90％-99.5％，更特别是99％-99.5％是与SEQ ID NO9的氨基酸序列相同的氨基酸的氧化还原酶。通过在实施例1中描述的试验体系进行根据SEQ ID NO9的氧化还原酶或其如以下所定义的衍生物或其类似物的比活性测定。
根据本发明的氧化还原酶特征是它比具有氨基酸序列SEQ IDNO9的氧化还原酶具有另外1-40个氨基酸或少1-40个氨基酸并且它具有每mg蛋白质超过1μmol的比活性，基于乙基-4-氯-3-氧代丁酸到(R)-乙基-4-氯-3-羟基丁酸的反应。优选与在SEQ ID NO9的氨基酸序列中的相比其中多或少存在1-25个氨基酸，特别是2-20个氨基酸，或优选3-10个氨基酸的氧化还原酶。
进一步地，本发明涉及氧化还原酶，其具有SEQ ID NO9的氨基酸序列并且通过可水溶聚合物修饰一次，两次，三次，四次或五次和其中比活性达到每mg蛋白质超过1μmol，基于乙基-4-氯-3-氧代丁酸到(R)-乙基-4-氯-3-羟基丁酸的反应。例如，可水溶聚合物是聚乙二醇。聚乙二醇的结合优选在根据SEQ ID NO9的蛋白质的N-端基末端发生。根据SEQ ID NO9的氧化还原酶也可以与固体，例如聚乙烯，聚苯乙烯，多糖，纤维素或纤维素衍生物结合。
进一步地，本发明涉及代表具有氨基酸序列SEQ ID NO9的片段的蛋白质片段，每个片段具有5-30个氨基酸数量。优选具有SEQ IDNO9的片段，其具有6-25个氨基酸，特别8-20个氨基酸或10-18个氨基酸，特别是氨基酸序列SEQ ID NO10的链长。所说的片段可以，例如，用于发现根据本发明的来自荚膜毕赤氏酵母或来自任何其他微生物的氧化还原酶。
进一步地，本发明涉及融合蛋白，其特征在于它代表具有氨基酸序列SEQ ID NO9或具有氨基酸序列SEQ ID NO9的片段的氧化还原酶，具有5-30个数量的通过肽键在N-端基或羧基-端基末端连结到进一步的多肽上的氨基酸。融合蛋白可以，例如，更易于从其它的蛋白质上分离并在在细胞中更大量地表达。
进一步地，本发明涉及抗体，其特异性地结合到根据SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的氧化还原酶上。根据已知的方法通过免疫接种合适的哺乳动物进行所说的抗体的制备并随后获得该抗体。抗体可以是单克隆的或多克隆的。
本发明还涉及分离的核酸序列，其为根据SEQ ID NO9和SEQ IDNO10的氧化还原酶编码。
进一步地，本发明涉及分离的氧化还原酶的DNA-序列，其在NADH和水存在的条件下催化羰基化合物到对应的(S)-羟基化合物的还原，其中DNA-序列选自a)具有根据SEQ ID NO8，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6或SEQ ID NO7的核苷酸序列的DNA-序列，或各个互补链，b)杂交一个或几个根据a)的DNA-序列的DNA-序列或杂交其互补链的DNA-序列，杂交在严格的条件下发生，和c)DNA-序列，其由于遗传密码的简并编码通过一个或几个根据a)或b)的DNA-序列编码的蛋白质。
杂交中普遍的条件在Sambrok和Russel，Molecular Cloning aLaboratory Manual，卷1，章1，Protocol 30-32中描述。
进一步地，本发明涉及DNA-序列，其中超过70％的核酸碱基与根据SEQ ID NO8的DNA-序列或与其互补链是相同的并且编码氧化还原酶，该氧化还原酶具有每mg蛋白质超过1μmol的比活性，基于乙基-4-氯-3-氧代丁酸到(R)-乙基-4-氯-3-羟基丁酸的反应。优选其中80％-99.5％，特别是90％-99.5％，更特别是99％-99.5％的核酸碱基与根据SEQ ID NO8的DNA-序列相同的DNA-序列。
进一步地，本发明涉及具有10-50个核酸碱基的核酸序列，其具有对应根据SEQ ID NO8的DNA-序列的一部分或几部分或对应其互补链的序列。优选具有15-45个以上提到的DNA-序列的核酸碱基，特别是20-40个碱基或30-40个核酸碱基的核酸序列。以上提到的核酸序列作为分子探针或作为聚合酶链反应(PCR)的引物是合适的。
进一步地，本发明涉及包含一个或几个以上提到的核酸或DNA序列的克隆载体。进一步地，本发明涉及位于细菌，昆虫，植物或哺乳动物细胞内的并包含一个或几个以上提到的核酸或DNA序列的表达载体，该序列以合适的方式连接到表达控制序列上。进一步地，本发明涉及宿主细胞，其是细菌，酵母，昆虫，植物或哺乳动物细胞并已经用表达载体转化或转染。
前面提到的DNA-序列或氨基酸序列的同一性通过与各个蛋白质或DNA序列的部分序列相同的氨基酸或核酸碱基的数量相加并除以氨基酸或核酸碱基的总数并乘以一百计算的。
合适的克隆载体是，例如ppCR-Script，pCMV-Script，pBluescript(Stratagene)，pDrive克隆载体(Quiagen，Hilden，德国)，pS Blue，pET Blue，pET LIC-载体(Novagen，Madison，美国)和TA-PCR克隆载体(Invitrogen，Karlsruhe，德国)。
合适的表达载体是，例如pKK223-3，pTrc99a，pUC，pTZ，pSK，pBluescript，pGEM，pQE，pET，PHUB，pPLc，pKC30，pRM1/pRM9，pTrxFus，pAS1，pGEx，pMAL或pTrx。
合适的表达控制序列是，例如trp-lac(tac)-启动子，trp-lac(trc)-启动子，lac-启动子，T7-启动子或λpL-启动子。
来自荚膜毕赤氏酵母的氧化还原酶是具有34±2kDa的分子量(在SDS-凝胶中测定)和140±10kDa的分子量(通过凝胶渗透层析测定)的同型四聚体。氧化还原酶的最佳温度范围是40℃-45℃，还原反应的最佳pH是6.5-7.0和氧化反应的最佳pH是7.8-8.2。来自荚膜毕赤氏酵母的氧化还原酶显示了好的温度和pH稳定性并且在5.5-8.5的pH范围和在15℃-40℃的温度范围稳定5小时，并且显示了在有机溶剂中的高稳定性。
酶可以特别从来自毕赤氏酵母属的酵母分离并且可以在分光光度试验中在合适底物，例如乙基-4-氯-3-氧代丁酸盐(butyrat)或2-丁酮存在的条件下通过在340nm下的NADH的减少检测。
克隆根据本发明的来自荚膜毕赤氏酵母的氧化还原酶并且可以在具有1000-10000U/g E.coli湿重的活性的大肠杆菌(E.coli)中过表达。该酶不昂贵并且可以大量获得。数据库中的序列对比显示根据本发明的来自荚膜毕赤氏酵母的氧化还原酶是依赖锌的羰基还原酶。
本发明还涉及从荚膜毕赤氏酵母中获得氧化还原酶的方法。为此目的，为来自荚膜毕赤氏酵母的氧化还原酶编码的DNA例如在合适的原核或真核微生物中表达。优选地，来自荚膜毕赤氏酵母的氧化还原酶转化成E.coli菌株并特别在E.coli BL21star(DE3)细胞中表达。
可以获得来自荚膜毕赤氏酵母的氧化还原酶，例如培养以上提到的重组E.coli细胞，诱导氧化还原酶的表达并且之后，大约10-18小时(h)后，通过超声处理或在球磨机中用玻璃珠湿研磨消化细胞(RetschGmbH，Haan，德国，10min，24Hz)。获得的细胞提取物可以直接使用或进一步纯化。为此目的，例如离心细胞提取物，并且获得的上清液经过离子交换层析，例如通过在Q-Sepharose Fast Flow装置(Pharmacia)中的离子交换层析。
进一步地，本发明涉及羰基化合物对映选择性还原成对应的(S)-羟基化合物的方法，该方法特征在于a)在根据权利要求1-9的一项或几项的氧化还原酶，NADH和水存在的条件下羰基化合物还原成对应的(S)-羟基化合物，和b)分离形成的手性(S)-羟基化合物。
根据本发明的方法具有高的使用寿命，超过95％的制备的手性(S)-羟基化合物的对映体纯度和基于加入的羰基化合物的高产率。
术语“NADH”理解成还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
术语“NAD”理解成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
术语“羰基化合物”理解成例如具有下式I的化合物。
R1-C(O)-R2(I)
基团R1是，例如1)-(C1-C20)-烷基，其中烷基是线性链的或分支的，2)-(C2-C20)-烯基，其中烯基是线性链的或分支的并包含一个，二个，三个或四个双键，取决于链长，3)-(C2-C20)-炔基，其中炔基是线性链的或分支的并任选包含一个，二个，三个或四个三键，4)-(C6-C14)-芳基，5)-(C1-C8)-烷基-(C6-C14-)-芳基，6)-(C5-C14)-杂环，其是未取代的或被卤素，羟基，氨基或硝基取代一至三次，或7)-(C3-C7)-环烷基，其中在1)-7)下提到的部分是未取代的或彼此独立地被以下基团取代一，二或三次a)-OH，b)卤素，例如氟，氯，溴或碘，c)-NO2或d)-NH2。
基团R2是，例如1)-(C1-C6)-烷基，其中烷基是线性链的或分支的，2)-(C2-C6)-烯基，其中烯基是线性链的或分支的并包含一个，二个或三个双键，取决于链长，3)-(C2-C6)-炔基，其中炔基是线性链的或分支的并任选包含一个或二个三键，4)-(C0-C10)-烷基-C(O)-O-(C1-C6)-烷基，其中烷基是线性的或分支的并且是未取代的或被卤素，羟基，氨基或硝基取代一至三次，其中在1)-4)下提到的部分是未取代的或彼此独立地被以下基团取代一，二或三次a)-OH，b)卤素，例如氟，氯，溴或碘，c)-NO2或d)-NH2。
术语手性“(S)-羟基化合物”理解成例如具有下式II的化合物，R1-C(OH)-R2 (II)其中-OH-基团通常位于相对于其连接的碳原子的(S)-构型中，并且R1和R2具有在式I中相同的意思。
然而，如果羰基基团或卤原子位于与醇接近的位置，则名称改变并且之后对映体选择性醇也称作(R)-醇。然而，这仅仅是名称并且不改变根据本发明的氧化还原酶怎样进行还原的立体选择性方法的问题。
术语“芳基”，理解成在环内包含6-14个碳原子的芳族碳部分。-(C6-C14)芳基部分是，例如，苯基，萘基，1-萘基，2-萘基，联苯基，2-联苯基，3-联苯基和4-联苯基，蒽基或芴基。联苯基部分，萘基部分和特别是苯基部分是优选的芳基部分。术语“卤素”，理解成氟，氯，溴和碘的元素。术语“-(C1-C20)-烷基”，烃部分理解成碳链，其是线性-链或分支的并包含1-20个碳原子，例如甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，叔丁基，戊基，己基，庚基，辛基，壬基或癸基。术语“-C0烷基”，理解成共价键。
术语“-(C3-C7)环烷基”，理解成环烃部分，例如环丙基，环丁基，环戊基，环己基或环庚基。
术语“-(C5-C14)杂环”代表部分或完全饱和的单环或双环5元-14元杂环。杂原子的例子是N，O和S。术语“-(C5-C14)杂环”的例子是衍生自吡咯，呋喃，噻吩，咪唑，吡唑，噁唑，异噁唑，噻唑，异噻唑，四唑，1，2，3，5-噁噻二唑-2-氧化物，三唑酮，噁二唑酮，异噁唑酮，噁二唑啉硫酮，被F，-CN，-CF3或-C(O)-O-(C1-C4)烷基取代的三唑，3-羟基吡咯-2，4-二酮，5-氧代-1，2，4-噻二唑，吡啶，吡嗪，嘧啶，吲哚，异吲哚，吲唑，2，3-二氮杂萘，喹啉，异喹啉，喹喔啉，喹唑啉，噌啉的部分，所说的杂环的咔啉-和苯-anellated的，环戊-，环己-或环庚-anellated的衍生物。该部分特别优选2-或3-吡咯基，苯基吡咯基，例如4-或5-苯基-2-吡咯基，2-呋喃基，2-噻吩基，4-咪唑基，甲基咪唑基，例如1-甲基-2-，-4-或-5-咪唑基，1，3-噻唑-2-基，2-吡啶基，3-吡啶基，4-吡啶基，2-，3-或4-吡啶-N-氧化物，2-吡嗪基，2-，4-或5-嘧啶基，2-，3-或5-吲哚基，取代的2-吲哚基，例如1-甲基，5-甲基，5-甲氧基-，5-苄氧基-，5-氯-或4，5-二甲基-2-吲哚基，1-苄基-2-或-3-吲哚基，4，5，6，7-四氢-2-吲哚基，环庚[b]-5-吡咯基，2-，3-或4-喹啉基，1-，3-或4-异喹啉基，1-氧代-1，2-二氢-3-异喹啉基，2-喹喔啉基，2-苯并呋喃基，2-苯并噻吩基，2-苯并噁唑基或苯并噻唑基或二氢吡啶基(dihydropyrinidyl)，吡咯烷基，例如2-或3-(N-甲基吡咯烷基)，哌嗪基，吗啉基，硫代吗啉基，四氢噻吩基或苯并二氧戊环基。
优选的具有式I的化合物是，例如，乙基-4-氯-乙酰乙酸酯，甲基乙酰乙酸酯，乙基-8-氯-6-氧代辛酸，乙基-3-氧代戊酸酯，4-羟基-2-丁酮，乙基-2-氧代戊酸酯，乙基-2-氧代-4-苯基丁酸，丙酮酸乙酯，乙醛酸乙基苯基酯，1-苯基-2-丙酮，2，3-二氯乙酰苯，乙酰苯，2-辛酮，3-辛酮或2-丁酮。
对应形成的S-醇是，例如，(R)-乙基-4-氯-3-羟基丁酸，乙基-(S)-2-羟基-4-苯基丁酸，(S)-2-辛醇或(R)-乙基-8-氯-6-羟基辛酸。
合适的氧化还原酶来自，例如荚膜毕赤氏酵母。在根据本发明的方法中，氧化还原酶可以以完全纯化的状态或以部分纯化的状态使用。该方法用根据本发明的氧化还原酶或用包含根据本发明的氧化还原酶的细胞进行。在这样做的过程中，使用的细胞可以以天然的，可渗透的或溶胞的状态提供。优选地，使用根据SEQ ID NO9的克隆氧化还原酶。
使用的氧化还原酶的体积活性是100单位/ml(U/ml)-5000U/ml，优选-大约500U/ml。
每kg反应的具有式I的化合物使用5000-2000000U的氧化还原酶，优选大约10000-200000U。由此，酶单位1U对应每分钟反应1μmol具有式I的化合物需要的酶的数量。
进一步地，本发明涉及羰基化合物对映体选择性还原成对应的(S)-羟基化合物的方法，其中a)在根据本发明的氧化还原酶，NADH和水存在的条件下羰基化合物还原成对应的(S)-羟基化合物，b)通过氧化还原酶形成的NAD用共底物还原成NADH，和c)分离形成的手性(S)-羟基化合物。
使用的羰基化合物和氧化还原酶的量等于以上提到的在描述的方法中的量。对于根据本发明的方法合适的共底物是醇，例如乙醇，2-丙醇(异丙醇)，2-丁醇，2-戊醇或2-辛醇。这些共底物通过根据本发明的氧化还原酶和NAD反应生成对应的酮和NADH。由此，再生NADH。
对于NAD到NADH的再生的共底物，例如异丙醇的量是5％-50％，基于总体积，优选8％-20％，特别是10％-15％。
进一步地，本发明涉及(S)-羟基化合物对映体选择性回收的方法，其中a)在根据本发明的氧化还原酶，NADH和水存在的条件下羰基化合物还原成对应的(S)-羟基化合物，b)通过氧化还原酶形成的NAD用脱氢酶和共底物还原成NADH，和c)分离形成的手性(S)-羟基化合物。
合适的脱氢酶是，例如，来自面包酵母，来自博伊丁氏假丝酵母或近平滑假丝酵母的依赖于NADH的醇脱氢酶。对于使用的醇脱氢酶合适的共底物是醇，例如乙醇，2-丙醇(异丙醇)，2-丁醇，2-戊醇或2-辛醇。
进一步地，NAD还原也可以通过甲酸脱氢酶(Tishkov等，J.Biotechnol.Bioeng.64，187-193，中试规模的生产和重组NAD和NADP特异性甲酸脱氢酶的分离(Pilot-scale production and isolation ofrecombinant NAD and NADP specific formate dehydrogenase))进行。合适的甲酸脱氢酶的共底物是，例如，甲酸的盐，例如甲酸铵，甲酸钠或甲酸钙。
底物偶联的辅酶的再生优选使用仲醇，例如乙醇，2-丙醇(异丙醇)，2-丁醇，2-戊醇或2-辛醇。因此，该方法优选在无另外的脱氢酶的条件下进行。
在本方法中优选向使用的水中添加缓冲液，例如具有5-10的pH，优选6-9的pH的磷酸钾，三/HCl或三乙醇胺缓冲液。缓冲液浓度是10mM-150mM。
缓冲液还可以包含稳定或激活酶的离子，例如锌离子或镁离子。
温度是，例如，10℃-60℃，优选30℃-55℃。
进一步地，本发明涉及(S)-羟基化合物对映体选择性回收的方法，其中a)在氧化还原酶，NADH和水存在的条件下羰基化合物还原成对应的(S)-羟基化合物，b)在有机溶剂存在的条件下进行该反应，和c)分离形成的手性(S)-羟基化合物。
优选的有机溶剂是，例如，乙醚，叔丁基甲基醚，二异丙基醚，二丁基醚，乙酸丁酯，庚烷，己烷或环己烷。
如果使用另外的溶剂，反应批料由含水相和有机相组成。有机相通过合适溶剂或通过本身不溶于水的底物形成，在该溶剂中底物以溶解状态存在。
有机相占总反应体积的5％-80％，优选10％-40％。
在根据本发明的两相体系中，水形成一种液相，和有机溶剂形成第二液相。另外，可以任选提供固相或另一液相，其例如产生自还未完全溶解的氧化还原酶和/或添加的酶或羰基化合物。然而，优选没有固相的两种液相。优选两种液相机械混合以便在两液相之间形成大的表面积。
辅因子NADH的浓度是0.01mM-1mM，特别是0.05mM-0.2mM，基于含水相。
在根据本发明的方法中，羰基化合物以基于总体积的3％-30％，优选5％-15％，特别是10％的量使用。
进一步地，本发明涉及羰基化合物对映体选择性还原成对应的(S)-羟基化合物的方法，其中a)在氧化还原酶，NADH和水存在的条件下羰基化合物还原成对应的(S)-羟基化合物，b)在有机溶剂存在的条件下进行该反应，c)通过氧化还原酶形成的NAD用共底物还原成NADH，和d)分离形成的手性(S)-羟基化合物。
使用的羰基化合物和氧化还原酶的量对应以上提到的方法。对于本方法合适的共底物是醇，例如乙醇，2-丙醇(异丙醇)，2-丁醇，2-戊醇或2-辛醇。这些共底物通过氧化还原酶和NAD反应生成对应的酮和NADH。由此，再生NADH。
对于NAD到NADH的再生的共底物，例如异丙醇的量是5％-50％，基于总体积，优选8％-20％，特别是10％-15％。
进一步地，本发明涉及羰基化合物对映体选择性还原成对应的(S)-羟基化合物的方法，其中a)在氧化还原酶，NADH和水存在的条件下羰基化合物还原成对应的(S)-羟基化合物，b)通过氧化还原酶形成的NAD同时用脱氢酶和共底物还原成NADH，c)在有机溶剂存在的条件下进行该反应，和d)分离形成的手性(S)-羟基化合物。
对于醇脱氢酶优选在根据本发明的方法中使用进一步的稳定剂。合适的稳定剂是，例如，甘油，山梨糖醇，1，4-DL-二硫苏糖醇(DTT)或二甲基亚砜(DMSO)。
例如，根据本发明的方法在由玻璃或金属制成的密闭反应容器中进行。为此目的，组分各自转移到反应容器中并在例如氮或空气氛下搅拌。取决于使用的底物和羰基化合物，反应时间达1小时-48小时，特别是2小时-24小时。
随后，后处理反应混合物。为此目的，分离含水相并过滤有机相。任选含水相可再萃取一次并可以象有机相一样后处理。之后，任选从过滤的有机相蒸发溶剂。以这种方法，获得了具有超过99％的对映体纯度和基本不含原料乙基-4-氯乙酰乙酸酯的产物(R)-乙基-4-氯-3-羟基丁酸。产物蒸馏后，本方法的总产率达50％-95％，基于使用的原料的量。
进一步地，本发明涉及具有下式II的手性(R)-羟基化合物的回收方法，其包含如前面所定义的R1和R2部分。
R1-C(OH)-R2 (II)在所说的方法中，a)包含具有式II的消旋化合物的混合物用根据本发明的氧化还原酶，NAD和水培养，和b)分离残余的具有式II的手性(R)-羟基化合物。
由此，具有式II的(S)-羟基化合物反应成对应的酮化合物和NADH。
进一步地，本发明涉及具有式II的手性(R)-羟基化合物的回收方法，其中a)包含具有式II的消旋化合物的混合物用根据本发明的氧化还原酶，NAD和水培养，b)通过氧化还原酶形成的NADH用共底物氧化成NAD，和c)分离残余的具有式II的手性(R)-羟基化合物。
进一步地，本发明涉及具有式II的手性(R)-羟基化合物的回收方法，其中a)包含具有式II的消旋化合物的混合物用根据本发明的氧化还原酶，NAD和水培养，b)通过氧化还原酶形成的NADH用脱氢酶和共底物氧化成NAD，和c)分离残余的具有式II的手性(R)-羟基化合物。
在另一实施方案中，本发明涉及具有式II的手性(R)-羟基化合物的回收方法，其中a)包含具有式II的消旋化合物的混合物用根据本发明的氧化还原酶，NAD和水培养，b)在有机溶剂存在的条件下进行该反应，和c)分离残余的具有式II的手性(R)-羟基化合物。
根据本发明具有式II的手性(R)-羟基化合物的进一步的方法特征在于a)包含具有式II的消旋化合物的混合物用根据本发明的氧化还原酶，NAD和水培养，b)在有机溶剂存在的条件下进行该反应，c)通过氧化还原酶形成的NADH用脱氢酶和共底物氧化成NAD，和d)分离残余的具有式II的手性(R)-羟基化合物。
反应条件与在前面具有式I的酮化合物的对映体选择性还原方法中的基本相同。然而，仅仅具有式II的(S)-羟基化合物对映体选择性地氧化成对应的酮化合物，而非具有式I的酮化合物由具有式II的化合物的消旋混合物对映体选择性还原。因此，具有式II的(R)-羟基化合物保留并可以被分离。
进一步地，其对应的酮，例如丙酮用于NAD的再生方法而非用作共底物的醇，例如乙醇，2-丙醇(异丙醇)，2-丁醇，2-戊醇或2-辛醇。例如，丙酮和NADH用根据本发明的氧化还原酶或另外的脱氢酶反应成NAD和异丙醇。使用的酮的量是5％-50％，基于总体积，优选8％-20％和特别是10％-15％。
在以下中，本发明通过实施例解释。
实施例实施例1对于S-特异性醇脱氢酶酵母的筛选为了筛选，许多不同的酵母菌株在以下的培养基(所有数据以g/l表示)中培养酵母提取物(3)，麦芽提取物(3)，蛋白胨(5)和葡萄糖(10)。在121℃下培养基灭菌并且在25℃下和在160转/分钟(rpm)的摇动器上在未进一步调整pH的条件下培养酵母。随后，用800μl消化缓冲液(100mM三乙醇胺(TEA)，pH＝7.0)重悬浮125mg细胞，在球磨机(Retsch)中在4℃下用1g玻璃珠混合并消化10分钟(min)。在12000rpm下离心2min后获得的上清液(溶菌产物)用于以下的活性筛选和测定对映体过量(ee-值)。乙基-4-氯乙酰乙酸酯和2-氯-1-(3-氯苯基)乙烷-1-酮用作底物。
用于活性筛选的批料860μl0.1M KH2PO4/K2PO4pH＝7.01mM MgCl220μl NADPH或NADH(10mM)20μl 溶菌产物100μl各个底物(100mM)反应在340nm的波长下进行1分钟。
用于测定ee-值的批料20μl 溶菌产物100μlNADH或NADPH(50mM)60μl 底物(乙基-4-氯乙酰乙酸酯100mM)24小时(h)后，测定ee的批料用氯仿萃取并且通过气相色谱(GC)测定对映体过量。
对映体过量计算如下ee(％)＝((R-醇-S-醇)/(R-醇+S-醇))×100。
DSMZ代表Deutsche Sammlung für Mikroorganismen undZellkulturen，Mascheroder Weg 1b，38124 Braunschweig酶单位的定义1U对应每分钟反应1μmol底物需要的酶的量实施例2来自于荚膜毕赤氏酵母依赖于NADH的(S)-特异性氧化还原酶的分离为了从荚膜毕赤氏酵母(P.capsulata)中分离依赖于NADH的氧化还原酶，微生物如实施例1描述培养。一旦达到稳定期，收获细胞并通过离心从培养基中分离。通过使用玻璃珠湿研磨进行酶释放但也可以通过其它的消化方法取得。为此目的，用400ml消化缓冲液(100mM三乙醇胺，1mM MgCl2，pH＝7.0)悬浮100g P.capsulata并通过弗氏细胞压碎器均化。
离心(7000rpm)后获得的粗提取物之后进一步纯化并通过FPLC(快速蛋白质液相层析)后处理。
根据本发明的氧化还原酶可以在Q-Sepharose Fast Flow(Messrs.Pharmacia)和Uno Q(Biorad，慕尼黑，德国)上通过离子交换层析以两个连续的步骤纯化。为此目的，离心后获得的溶菌产物直接应用于Q-Sepharose FF-柱，该柱用50mM的磷酸钾缓冲液，pH＝7.0平衡，并用增加的线性盐梯度洗脱。在这样做的过程中，在0.2-0.3MNaCl下洗脱氧化还原酶。合并包含氧化还原酶的级分并通过超滤(排阻限10kDa)浓缩至适当的体积。随后，后处理浓缩的氧化还原酶级分并进一步通过Uno Q纯化，使用以上提到的相同缓冲液。由此酶在0.1M NaCl下洗脱。
紧随其后，通过凝胶渗透(Superdex 200HR；Pharmacia，100mM三乙醇胺，pH＝7.0，0.15M NaCl)测定获得的纯化的氧化还原酶的分子量。
过氧化氢酶(232kDa)，醛缩酶(158kDa)，清蛋白(69.8kDa)和卵清蛋白(49.4kDa)用作分子量标准。
下表2总结了获得的结果。
表2
氧化还原酶的酶活性在根据实施例1(批料活性筛选)的试验体系中测定，并且根据Lowry等，Journal of Biological Chemistry，193(1951)265-275或Peterson等，Analytical Biochemistry，100(1979)201-220进行蛋白质数量的测定。酶活性与蛋白质数量的商产生了比活性，其中每分钟1μmol的转化率对应1单位(U)。
通过凝胶渗透测定的根据本发明的氧化还原酶的的分子量在天然状态下是140±10kDa。
实施例3根据本发明的氧化还原酶的N-末端序列的测定凝胶渗透后，根据实施例2的酶制剂在10％的十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶中分级并转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF-膜)上。在大约35-45kDA下的显著带(band)通过埃德曼降解(procise 492(PE-Biosystems)进行N-末端序列测定。获得以下的N-末端序列。
SEQ ID NO10KTQAGYIFKKGA实施例4来自荚膜毕赤氏酵母的氧化还原酶的克隆真核微生物荚膜毕赤氏酵母属于糖酵母科。所说的生物的基因结构显示了外显子-内含子排列。因此，为了确定为对映体选择性氧化还原酶编码的基因序列由荚膜毕赤氏酵母的活性细胞制备cDNA文库。
4.1由荚膜毕赤氏酵母细胞制备总的RNA600mg来自荚膜毕赤氏酵母的新细胞重悬浮于2.5ml冰冷的LETS(10mM三-HCl，pH＝7.4，10mM EDTA，100mM LiCl，0.2％SDS)缓冲液中。向所说的细胞悬浮液中添加5ml(大约20g)在硝酸中洗涤过并用3ml苯酚(pH 7.0)平衡过的玻璃珠。因此，整个批料交替一次摇动30秒(Vortex Genie，Scientific Industries Inc.，纽约，美国)和在冰上冷却30秒并处理总共10分钟。随后，添加另外5ml冰冷的LETS缓冲液。所说的细胞悬浮液在11000g和4℃下离心5分钟。除去含水相并用相同体积的苯酚∶氯仿∶3-甲基-1-丁醇(24∶24∶1)萃取两次。接着是用氯仿萃取。最后萃取后，通过添加1/10体积的5M LiCl在-20℃下沉淀获得的总RNA。
通过寡-dT纤维素(mRNA PrpKit，Qiagen)1mg分离的RNA用于回收m-RNA。
随后沉淀后，5μg mRNA用于cRNA的合成(pBluescript II X RcDNA Library Construction Kit，Stratagene)。根据生产商的指导建造的文库转化成XL-10Gold E.coli并检查(S)-ADH活性。
确定两个克隆(2/1和2/2)并在灭绝下降的基础上用作为辅因子的NADH和作为底物的乙基-4-氯乙酰乙酸酯分离。通过包含在克隆中的质粒的多个克隆位点用Primer T7(SEQ ID NO3)和Primer T3(SEQ ID NO4)测序导致了具有1175bp(SEQ ID NO1)大小的片段。所说的片段为包含366个氨基酸(SEQ ID NO2)的融合蛋白编码并该片段由β-半乳糖苷酶的a-片段和根据本发明的氧化还原酶的序列构成。
4.2通过PCR(聚合酶链反应)由荚膜毕赤氏酵母合成为(S)-ADH编码的全长转录物基于SEQ ID NO1，为了随后的全长转录物的克隆特异性引物被建造成适当的表达体系。在这样做的过程中，改性(SEQ ID NO5；SEQ ID NO6；SEQ ID NO7)具有对Nde I(或Sph I，分别)识别序列的5′-引物和具有对Hind III识别序列的3′-引物。寡1-Nde I5‘-GGAATTCCATATGTCTGCTCTCTCCAAAAC-3’寡2-Sph I5‘-CACTGCATGCTGATGTCTGCTCTCTCCAAAAC-3’寡3-Hind III5′-CCCAAGCTTTCATGGAAGCATAACCAATCTT-3′从荚膜毕赤氏酵母的表达文库的克隆2/1分离的质粒DNA作为聚合酶链反应的模板。用50ng模板和以下的温度循环在PCR缓冲液[10mM三-HCl，(pH 8.0)；50m KCl；10mM MgSO4；1mM dNTP混合物(由此N代表碱基A，T，C或G)中进行扩增；每30pMol引物和2.5U platinum Pfx DNA-Polymerase(Invitrogen)]循环1 94℃，2min
循环2×3094℃，15sec58℃，30sec68℃，75sec循环368℃，7min4℃，∞纯化后，产生的PCR产物通过1％琼脂糖凝胶在内切核酸酶NdeI和Hind III或内切核酸酶Sph I和Hind III的帮助下消化并连接到pET21a载体(Novagen)或pQE30载体(Qiagen)的骨架，该骨架已经用相同的内切核酸酶处理。2il连接批料转化成E.coli Top 10F的细胞(Invitrogen)后，抗氨苄青霉素的克隆的质粒DNA通过使用内切酶限制性酶切分析测试具有1100bp的大小的插入片段的存在，该限制性内切酶酶切分析使用内切核酸酶Nde I和Hind III或内切核酸酶Sph I和Hind III。测序该表达构造物pET21-PC#10。来自为根据本发明的氧化还原酶编码的荚膜毕赤氏酵母的转录物具有总共1026bp的可读框，该可读框对应341个氨基酸(SEQ ID NO9)。
4.3根据本发明来自荚膜毕赤氏酵母的氧化还原酶在Star BL 21(De3)大肠杆菌细胞中的表达感受态大肠杆菌Star BL 21(De3)细胞(Invitrogen)用为根据本发明的氧化还原酶编码的表达构造物pET21-PC#10转化。
转化的菌株在具有氨苄青霉素(50ig/ml)的LB培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl)中培养直到达到0.5的光密度，在500nm下测定。重组氧化还原酶蛋白质的产生通过以1mM的最终浓度添加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)引发。诱导批料在25℃和220rpm下再培养15h。
取得的酶活性达到大约6000U/g的湿细胞质量。
4.4根据本发明来自荚膜毕赤氏酵母的氧化还原酶在RB791大肠杆菌细胞中的表达感受态大肠杆菌RB791细胞(Invitrogen)用为根据本发明的氧化还原酶编码的表达构造物pQE30-PC#12转化。
转化的菌株在具有氨苄青霉素(50ig/ml)的LB培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl)中培养直到达到0.5的光密度，在500nm下测定。重组氧化还原酶蛋白质的产生通过以0.1mM的最终浓度添加IPTG引发。诱导批料在25℃和220rpm下再培养15小时。取得的酶活性达到大约1000U/g湿细胞质量。
实施例5来自荚膜毕赤氏酵母的重组氧化还原酶的特征5.1最佳pH制备在表3中指明的缓冲液。各个缓冲液组分的浓度在每一种情况下达到50mM。
表3
测定批料(30℃)870μl 每一种在表3中提到的缓冲液体系20μlNADH 10mM(8.6mg/ml水)10μl稀释酶培养持续大约2-3min，因此添加100μl底物溶液(100mM乙基-4-氯-3-氧代丁酸)。
为了测定最佳pH，在表3中指明的各个缓冲液中测定酶反应。为了测定氧化反应的最佳pH，NADH用作辅因子和(S)-甲基-3-羟基丁酸用作底物。为了根据本发明的酶，由此可以测定6.5-7为还原反应的最佳pH和7.8-8.2为氧化反应的最佳pH。
5.2pH稳定性重组氧化还原酶的活性的测定通过贮存在表3中提到的缓冲液体系中检查。为此目的，在4-11的pH范围制备各种缓冲液(50mM)，并且用其稀释根据实施例4制备的氧化还原酶。30，60和300min培养后，从批料中取出10μl并用于根据实施例1活性试验。
因此，初始值是测定值，其在磷酸钾缓冲液50mM pH＝7.0中稀释(1∶20)酶后立刻获得。在给定的条件下，所说的值对应大约0.70/min的灭绝变化并设定为100％值，并且所有以下的测定值与所说的值相关设定。
在这样做的过程中，检测到来自荚膜毕赤氏酵母的重组氧化还原酶在5.5-8.5的pH下是稳定的并且可以在活性无任何实质损失的情况下培养至少5h。在9.0以上和5.0以下的pH值下培养导致了酶的立刻失活。
5.3最佳温度为了测定最佳试验温度，在15℃-70℃的温度范围在标准测定批料中测定酶活性。正如在表4中可以看到的，酶在45℃下达到了它的最大活性，之后活性快速下降。
表4
5.4温度稳定性温度稳定性以在实施例5.2下描述的类似的方式在15℃-70℃的范围测定。为此目的，1∶20稀释的纯化氧化还原酶在每一种情况下在各个温度下培养60min和180min并随后在30℃下用以上提到的试验批料测定。也在这种情况下，在磷酸钾缓冲液50mM pH＝7.0中稀释纯化的氧化还原酶后立刻获得的测定值用作初始值。所说的值在本实施例中也设定为100％值。
这里，酶在15℃-40℃的温度范围是完全稳定的并3h的培养后未显示任何活性损失。在55℃下，30分钟后已经不再能够检测到酶活性。
5.5底物谱/对映体过量根据本发明的氧化还原酶的底物谱通过用多种酮，含氧酸和其酯测定酶活性来测定。为此目的，根据实施例5.1的标准测定批料和不同的底物一起使用。使用乙基-4-氯乙酰乙酸酯的活性等于100％并且所有的其它底物与其相关设定。
为了测定ee-值，使用下列的反应批料用于所选择的底物。
100μl NADH 50mM60μl 底物(100mM)+1-2U的根据本发明的氧化还原酶24小时后测定ee的批料用氯仿萃取并通过GC测定产生的醇的对映体过量。
表5
n.b.指未测定正如在表5中可以看到的，广谱的2-和3-含氧酸酯和芳族和脂族酮由根据本发明的氧化还原酶对映体选择性地还原。
5.5溶剂稳定性在有机溶剂存在的条件下测定来自荚膜毕赤氏酵母的氧化还原酶酶的稳定性。为此目的，在每一种情况下氧化还原酶用指明的溶剂混合物(在可水混溶的有机溶剂情况下)稀释1∶20并且在室温(20℃-24℃；RT)下培养。随后，10μl酶溶液用于标准试验批料。也在这种情况下，在缓冲液(磷酸钾缓冲液(KPP)100mM，pH＝7.0)中稀释后初始值等于100％，并且所有的其它值也与所说的初始值相关设定。
在可水混溶的有机溶剂情况下，稀释同样发生在磷酸钾缓冲液中，向批料中添加相同体积的有机溶剂并且该批料在RT下在170rpm的热混合器(thermomixer)中培养。活性由含水相测定。表6显示了结果。
表6
EtOH代表乙醇；DSMO代表二甲基亚砜正如在表6中可以看到的，来自荚膜毕赤氏酵母的氧化还原酶对于有机溶剂显示了惊人的稳定性。和确立的学说形成对比，与在纯的缓冲液中的培养相比较，根据本发明的氧化还原酶甚至在有机可水混溶的和不可水混溶的溶剂中是稳定的。因此，正如在DE 101 19274 A1中描述根据本发明的氧化还原酶可以用于两相体系。
5.7制备转化5.7.1乙基-4-氯乙酰乙酸酯到乙基-(R)-4-氯-3-羟基丁酸的还原为了制备批料，34l缓冲液(100mM TEA，pH＝7，1mM ZnCl2，10％甘油)，4l异丙醇，4l 4-氯乙酰乙酸酯，4g NAD和3.6百万U来自荚膜毕赤氏酵母的重组氧化还原酶在室温下在恒定混合下培养24h。24h后，使用的99％的4-氯乙酰乙酸酯被还原。随后，用乙酸乙酯萃取反应混合物，通过旋转蒸发器除去溶剂并蒸馏粗产物。以这种方式，回收2.8l(3.4kg)具有99％的对映体过量的乙基-(R)-4-氯-3-羟基丁酸。这对应70％的产率，基于使用的原料的量。
5.7.2 2-氯-1-(3-氯苯基)乙烷-1-酮到(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙烷-1-醇的还原为了制备批料，164ml缓冲液(100mM TEA，pH＝7,1mM ZnCl2，20％甘油)，16ml异丙醇，20g溶解于20ml甲基叔-丁基醚(MTBE)中的2-氯-1-(3-氯苯基)乙烷-1-酮，10mg NAD和20000U来自荚膜毕赤氏酵母的重组氧化还原酶在室温下在恒定混合下培养24h。24h后，使用的96％的2-氯-1-(3-氯苯基)乙烷-1-酮被还原。随后，用乙酸乙酯萃取反应混合物，并使用旋转蒸发器除去溶剂。以这种方式，回收15g具有100％的对映体过量的(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙烷-1-醇。这对应77％的产率，基于使用的原料的量。
序列表<110>Juelich Enzyme Products GmbH<120>来自荚膜毕赤氏酵母的氧化还原酶<130>(TH)4090<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1175<212>DNA<213>荚膜毕赤氏酵母<400>1cgcggtggcg gccgctctag aactagtgga tcccccgggc tgcaggaatt cggcacgagg 60atctttctca actacaatgt ctgctctctc caaaacccag gccggttaca tcttcaagaa120gggtgccggt cacatcgtca aggccgaggt tccaatcccc aagccaactg gtgcccaatc180tcttcttagg gtcaaggctg caggaatgtg ccactctgac ttgcacgtca ttggagaaac240attggaggtc cctaccgatg ggtacgtgct cggtcacgaa attgctggtg aattggtgga300gatcggagac tcggtcaacc ctgaagtttt taaggtggga ggccgttatg ctgttcatgg360actgaattcg tgtggatcct gtgagatgtg tcgtaccggt catgacaatg actgtactgg420aaatgaatcg aaatggtacg gtctgggaat tagtggtggt taccagcagt acctgctggt480gccaaattcg caccatctat tgcctattcc agataacgtg tcctacgaag ttgctgctgc540cacctctgat gctgtcttga ctccatacca tgctatcaag aattccggag tgactccatc600ttctaaggtg ttgatgtttg gtctgggtgg tttgggatcg aacgcacttc agatcctcaa660ggcatttgga gcctatgtgg ttgccgttga tgtcaagccc gcatccaaag caattgccga720cgaattcaaa gcggatgaat tctataccga tatcagccaa tcttcttgga aaccagcctc780gtttgattac tgttttgact tcgtttcgct gcaggtcacc ttcgacatct gccagaagta840tatcaagtcc cacggtacca tcttcccagt gggtctgggc tcgagcaagc tgactttcga900cttgggaaac ctggcattgc gtgaagtaaa aattgttggt aacttctggg gtacttctca960
ggaacagatc gaagcaatgg agctggttag ctcgggtagg gtcaagcctc aagttcacac1020caccgaactt gaaaaccttc ctgaatcact tgaaaaactg gaggagggta agatcaatgg1080aagattggtt atgcttccat gatcacaaac tatttataac gagatacgag aaaaagttta1140atatgatgtc gtttttccaa tcaaaagggg ggccc 1175<210>2<211>366<212>PRT<213>人工的<400>2Ala Val Ala Ala Ala Leu Glu Leu Val Asp Pro Pro Gly Cys Arg Asn1 5 10 15Ser Ala Arg Gly Ser Phe Ser Thr Thr Met Ser Ala Leu Ser Lys Thr20 25 30Gln Ala Gly Tyr Ile Phe Lys Lys Gly Ala Gly His Ile Val Lys Ala35 40 45Glu Val Pro Ile Pro Lys Pro Thr Gly Ala Gln Ser Leu Leu Arg Val50 55 60Lys Ala Ala Gly Met Cys His Ser Asp Leu His Val Ile Gly Glu Thr65 70 75 80Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Tyr Val Leu Gly His Glu Ile Ala Gly85 90 95Glu Leu Val Glu Ile Gly Asp Ser Val Asn Pro Glu Val Phe Lys Val100 105 110
Gly Gly Arg Tyr Ala Val His Gly Leu Asn Ser Cys Gly Ser Cys Glu115 120 125Met Cys Arg Thr Gly His Asp Asn Asp Cys Thr Gly Asn Glu Ser Lys130 135 140Trp Tyr Gly Leu Gly Ile Ser Gly Gly Tyr Gln Gln Tyr Leu Leu Val145 150 155 160Pro Asn Ser His His Leu Leu Pro Ile Pro Asp Asn Val Ser Tyr Glu165 170 175Val Ala Ala Ala Thr Ser Asp Ala Val Leu Thr Pro Tyr His Ala Ile180 185 190Lys Asn Ser Gly Val Thr Pro Ser Ser Lys Val Leu Met Phe Gly Leu195 200 205Gly Gly Leu Gly Ser Asn Ala Leu Gln Ile Leu Lys Ala Phe Gly Ala210 215 220Tyr Val Val Ala Val Asp Val Lys Pro Ala Ser Lys Ala Ile Ala Asp225 230 235 240Glu Phe Lys Ala Asp Glu Phe Tyr Thr Asp Ile Ser Gln Ser Ser Trp245 250 255Lys Pro Ala Ser Phe Asp Tyr Cys Phe Asp Phe Val Ser Leu Gln Val260 265 270Thr Phe Asp Ile Cys Gln Lys Tyr Ile Lys Ser His Gly Thr Ile Phe275 280 285
Pro Val Gly Leu Gly Ser Ser Lys Leu Thr Phe Asp Leu Gly Asn Leu290 295 300Ala Leu Arg Glu Val Lys Ile Val Gly Asn Phe Trp Gly Thr Ser Gln305 310 315 320Glu Gln Ile Glu Ala Met Glu Leu Val Ser Ser Gly Arg Val Lys Pro325 330 335Gln Val His Thr Thr Glu Leu Glu Asn Leu Pro Glu Ser Leu Glu Lys340 345 350Leu Glu Glu Gly Lys Ile Asn Gly Arg Leu Val Met Leu Pro355 360 365<210>3<211>17<212>DNA<213>人工的<400>3gtaatacgac tataggg17<210>4<211>21<212>DNA<213>人工的<400>4caattaaccc tcactaaagg g 21<210>5<211>30<212>DNA<213>人工的<400>5
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Lys Ser His Gly Thr Ile Phe Pro Val Gly Leu Gly Ser Ser Lys Leu260 265 270Thr Phe Asp Leu Gly Asn Leu Ala Leu Arg Glu Val Lys Ile Val Gly275 280 285Asn Phe Trp Gly Thr Ser Gln Glu Gln Ile Glu Ala Met Glu Leu Val290 295 300Ser Ser Gly Arg Val Lys Pro Gln Val His Thr Thr Glu Leu Glu Asn305 310 315 320Leu Pro Glu Ser Leu Glu Lys Leu Glu Glu Gly Lys Ile Asn Gly Arg325 330 335Leu Val Met Leu Pro340<210>10<211>12<212>PRT<213>荚膜毕赤氏酵母<400>10Lys Thr Gln Ala Gly Tyr Ile Phe Lys Lys Gly Ala1 5 10
权利要求
1.氧化还原酶，特征在于在NADH和水存在的条件下其将羰基化合物还原成对应的(S)-羟基化合物。
2.根据权利要求1的氧化还原酶，特征在于其可以从毕赤氏酵母属或假丝酵母属的酵母，特别是从荚膜毕赤氏酵母中获得。
3.根据权利要求1或2的氧化还原酶，特征在于其具有根据SEQ IDNO8的DNA-序列和根据SEQ ID NO9的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3之一项或几项的氧化还原酶，特征在于超过70％的氨基酸与氨基酸序列SEQ ID NO9是相同的并且其具有每mg蛋白质超过1μmol的比活性，基于乙基-4-氯-3-氧代丁酸到(R)-乙基-4-氯-3-羟基丁酸的反应。
5.根据权利要求4的氧化还原酶，特征在于80％-99.5％，特别是90％-99.5％，更特别是99％-99.5％是与SEQ ID NO9的氨基酸序列相同的氨基酸。
6.根据权利要求1-5之一项或几项的氧化还原酶，特征在于与具有SEQ ID NO9的氨基酸序列的氧化还原酶相比其具有另外1-40个氨基酸或少1-40个氨基酸并且其具有每mg蛋白质超过1μmol的比活性，基于乙基-4-氯-3-氧代丁酸到(R)-乙基-4-氯-3-羟基丁酸的反应。
7.根据权利要求4的氧化还原酶，特征在于比SEQ ID NO9的氨基酸序列中多或少存在1-25个氨基酸，特别是2-20个氨基酸，或3-10个氨基酸。
8.根据权利要求1-6之一项或几项的氧化还原酶，特征在于其具有SEQ ID NO9的氨基酸序列并且被可水溶聚合物改性一次，两次，三次，四次或五次并且比活性达到每mg蛋白质超过1μmol的比活性，基于乙基-4-氯-3-氧代丁酸到(R)-乙基-4-氯-3-羟基丁酸的反应。
9.根据权利要求8的氧化还原酶，特征在于可水溶聚合物是聚乙二醇。
10.蛋白质片段，特征在于其代表氨基酸序列SEQ ID NO9的片段，每个片段具有5-30个数量的氨基酸。
11.根据权利要求10蛋白质片段，特征在于该片段是SEQ ID NO9的片段，具有6-25个氨基酸，特别8-20个氨基酸或10-18个氨基酸，特别是氨基酸序列SEQ ID NO10的链长。
12.融合蛋白质，特征在于其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO9或具有氨基酸序列SEQ ID NO9的片段的氧化还原酶，具有5-30个数量的通过肽键在N-端基或羧基-端基末端连结到进一步的多肽上的氨基酸。
13.抗体，特征在于其特异性地结合到根据SEQ ID NO9或SEQ IDNO10的氧化还原酶上。
14.分离的核苷酸序列，其为根据SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的氧化还原酶编码。
15.分离的氧化还原酶的DNA-序列，其在NADH和水存在的条件下催化羰基化合物到对应的(S)-羟基化合物的还原，其中DNA-序列选自a)具有根据SEQ ID NO8，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6或SEQ ID NO7的核苷酸序列的DNA-序列，或其各个互补链，b)杂交一个或几个根据a)的DNA-序列的DNA-序列或杂交其互补链的DNA-序列，杂交在严格的条件下发生，和c)DNA-序列，其由于遗传密码的简并编码通过一个或几个根据a)或b)的DNA-序列编码的蛋白质。
16.分离的DNA序列，特征在于超过70％的核酸碱基与根据SEQID NO8的DNA-序列或与其互补链是相同的并且其编码氧化还原酶，该氧化还原酶具有每mg蛋白质超过1μmol的比活性，基于乙基-4-氯-3-氧代丁酸到(R)-乙基-4-氯-3-羟基丁酸的反应。
17.根据权利要求16的分离的DNA-序列，特征在于80％-99.5％，特别是90％-99.5％，更特别是99％-99.5％的核酸碱基与根据SEQ IDNO8的DNA-序列是相同的。
18.分离的DNA-序列，特征在于其是具有10-50个核酸碱基的核酸序列，该核酸序列具有对应于根据SEQ ID NO8的DNA-序列的一部分或几部分或对应其互补链的序列。
19.根据权利要求18的分离的DNA-序列，特征在于其是具有15-45个核酸碱基，特别是20-40个碱基或30-40个核酸碱基的核酸序列。
20.克隆载体，特征在于其包含一个或几个根据权利要求14-19的核酸或DNA序列。
21.表达载体，特征在于其包含一个或几个根据权利要求14-19的核酸或DNA序列并且以适当的方式连接到表达控制序列上。
22.宿主细胞，其是细菌，酵母，昆虫，植物或哺乳动物细胞并且已经用根据权利要求21的表达载体转化或转染。
23.羰基化合物选择性还原成对应的(S)-羟基化合物的方法，其特征在于a)在根据权利要求1-9的一项或几项的氧化还原酶，NADH和水存在的条件下羰基化合物还原成对应的(S)-羟基化合物，和b)分离形成的手性(S)-羟基化合物。
24.根据权利要求23的方法，特征在于具有下式I的化合物用作羰基化合物R1-C(O)-R2(I)包含来自以下的R1部分1)-(C1-C20)-烷基，其中烷基是线性链的或分支的，2)-(C2-C20)-烯基，其中烯基是线性链的或分支的并包含一个，二个，三个或四个双键，取决于链长，3)-(C2-C20)-炔基，其中炔基是线性链的或分支的并任选包含一个，二个，三个或四个三键，4)-(C6-C14)-芳基，5)-(C1-C8)-烷基-(C6-C14-)-芳基，6)-(C5-C14)-杂环，其是未取代的或被卤素，羟基，氨基或硝基取代一至三次，或7)-(C3-C7)-环烷基，其中在1)-7)下提到的R1部分是未取代的或彼此独立地被以下基团取代一，二或三次a)-OH，b)卤素，例如氟，氯，溴或碘，c)-NO2或d)-NH2和包含来自以下的R2部分1)-(C1-C6)-烷基，其中烷基是线性链的或分支的，2)-(C2-C6)-烯基，其中烯基是线性链的或分支的并包含一个，二个或三个双键，取决于链长，3)-(C2-C6)-炔基，其中炔基是线性链的或分支的并任选包含一个或二个三键，4)-(C0-C10)-烷基-C(O)-O-(C1-C6)-烷基，其中烷基是线性的或分支的并且是未取代的或被卤素，羟基，氨基或硝基取代一至三次，其中在1)-4)下提到的R2部分是未取代的或彼此独立地被以下基团取代一，二或三次a)-OH，b)卤素，例如氟，氯，溴或碘，c)-NO2或d)-NH2。
25.根据权利要求23或24的方法，特征在于a)在根据权利要求1-9之一项或几项的氧化还原酶，NADH和水存在的条件下羰基化合物还原成对应的(S)-羟基化合物，b)通过氧化还原酶形成的NAD用共底物还原成NADH，和c)分离形成的手性(S)-羟基化合物。
26.根据权利要求23或24的方法，特征在于a)在根据权利要求1-9之一项或几项的氧化还原酶，NADH和水存在的条件下羰基化合物还原成对应的(S)-羟基化合物，b)通过氧化还原酶形成的NAD用脱氢酶和共底物还原成NADH，和c)分离形成的手性(S)-羟基化合物。
27.根据权利要求23或24的方法，特征在于a)在根据权利要求1-9之一项或几项的氧化还原酶，NADH和水存在的条件下羰基化合物还原成对应的(S)-羟基化合物，b)在有机溶剂存在的条件下进行该反应，和c)分离形成的手性(S)-羟基化合物。
28.根据权利要求23或24的方法，特征在于a)在根据权利要求1-9之一项或几项的氧化还原酶，NADH和水存在的条件下羰基化合物还原成对应的(S)-羟基化合物，b)在有机溶剂存在的条件下进行该反应，c)通过氧化还原酶形成的NAD用共底物还原成NADH，和d)分离形成的手性(S)-羟基化合物。
29.根据权利要求23或24的方法，特征在于a)在根据权利要求1-9之一项或几项的氧化还原酶，NADH和水存在的条件下羰基化合物还原成对应的(S)-羟基化合物，b)通过氧化还原酶形成的NAD同时用脱氢酶和共底物还原成NADH，c)在有机溶剂存在的条件下进行该反应，和d)分离形成的手性(S)-羟基化合物。
30.根据权利要求25，26，28或29的方法，特征在于用作共底物的是乙醇，2-丙醇，2-丁醇，2-戊醇或2-辛醇。
31.根据权利要求26或29的方法，特征在于来自博伊丁氏假丝酵母或近平滑假丝酵母的面包酵母用作脱氢酶。
32.根据权利要求26或29的方法，特征在于依赖于NADH的甲酸脱氢酶用作脱氢酶并且甲酸的盐，例如甲酸铵，甲酸钠或甲酸钙用作共底物。
33.根据权利要求27或29的方法，特征在于乙醚，叔丁基甲基醚，二异丙基醚，二丁基醚，乙酸丁酯，庚烷，己烷或环己烷用作有机溶剂。
34.根据权利要求27或29的方法，特征在于有机相占总反应体积的5％-80％，优选10％-40％。
35.具有下式II的手性(R)-羟基化合物的回收方法，R1-C(OH)-R2 (II)其包含来自以下的R1部分1)-(C1-C20)-烷基，其中烷基是线性链的或分支的，2)-(C2-C20)-烯基，其中烯基是线性链的或分支的并包含一个，二个，三个或四个双键，取决于链长，3)-(C2-C20)-炔基，其中炔基是线性链的或分支的并任选包含一个，二个，三个或四个三键，4)-(C6-C14)-芳基，5)-(C1-C8)-烷基-(C6-C14-)-芳基，6)-(C5-C14)-杂环，其是未取代的或被卤素，羟基，氨基或硝基取代一至三次，或7)-(C3-C7)-环烷基，其中在1)-7)下提到的R1部分是未取代的或彼此独立地被以下基团取代一，二或三次a)-OH，b)卤素，例如氟，氯，溴或碘，c)-NO2或d)-NH2和包含来自以下的R2部分1)-(C1-C6)-烷基，其中烷基是线性链的或分支的，2)-(C2-C6)-烯基，其中烯基是线性链的或分支的并包含一个，二个或三个双键，取决于链长，3)-(C2-C6)-炔基，其中炔基是线性链的或分支的并任选包含一个或二个三键，4)-(C0-C10)-烷基-C(O)-O-(C1-C6)-烷基，其中烷基是线性的或分支的并且是未取代的或被卤素，羟基，氨基或硝基取代一至三次，其中在1)-4)下提到的R1部分是未取代的或彼此独立地被以下基团取代一，二或三次a)-OH，b)卤素，例如氟，氯，溴或碘，c)-NO2或d)-NH2，特征在于a)包含具有式II的消旋化合物的混合物用根据权利要求1-9之一项或几项的氧化还原酶，NAD和水培养，和b)分离残余的具有式II的手性(R)-羟基化合物。
36.根据权利要求35具有式II的手性(R)-羟基化合物的回收方法，特征在于a)包含具有式II的消旋化合物的混合物用根据权利要求1-9之一项或几项的氧化还原酶，NAD和水培养，b)通过氧化还原酶形成的NADH用共底物氧化成NAD，和c)分离残余的具有式II的手性(R)-羟基化合物。
37.根据权利要求35具有式II的手性(R)-羟基化合物的回收方法，特征在于a)包含具有式II的消旋化合物的混合物用根据权利要求1-9之一项或几项的氧化还原酶，NAD和水培养，b)通过氧化还原酶形成的NADH用脱氢酶和共底物氧化成NAD，和c)分离残余的具有式II的手性(R)-羟基化合物。
38.根据权利要求35具有式II的手性(R)-羟基化合物的回收方法，特征在于a)包含具有式II的消旋化合物的混合物用根据权利要求1-9之一项或几项的氧化还原酶，NAD和水培养，b)在有机溶剂存在的条件下进行该反应，和c)分离残余的具有式II的手性(R)-羟基化合物。
39.根据权利要求35具有式II的手性(R)-羟基化合物的回收方法，特征在于a)包含具有式II的消旋化合物的混合物用根据权利要求1-9之一项或几项的氧化还原酶，NAD和水培养，b)在有机溶剂存在的条件下进行该反应，c)通过氧化还原酶形成的NADH用脱氢酶和共底物氧化成NAD，和d)分离残余的具有式II的手性(R)-羟基化合物。
40.根据权利要求36，37或39的方法，特征在于丙酮用作共底物。
全文摘要
本发明涉及由毕赤氏酵母属的酵母，更特别的由荚膜毕赤氏酵母获得的依赖于NADH的氧化还原酶。所说的氧化还原酶之后用于有机酮化合物到对应的(S)－羟基化合物的对映体选择性还原的酶促方法和用于在两相体系中使用来自荚膜毕赤氏酵母的分离的，重组过表达的氧化还原酶对映体选择性制备(S)－羟基化合物的酶促方法。
文档编号C07K16/40GK1839153SQ200480023830
公开日2006年9月27日 申请日期2004年5月28日 优先权日2003年6月18日
发明者A·吉普塔, A·齐默, M·博布科瓦 申请人:Iep 有限责任公司