专利名称：牛皮蝇素a(ha)在毕赤酵母系统中的表达及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及牛皮蝇素A(Hypodermotin A，HA)基因的克隆，含有该基因的酵母表达载体的构建及将该基因产物在含有表达质粒的毕赤酵母中的HA蛋白的生产方法，及牛皮蝇素A(HA)在牛皮蝇蛆病免疫诊断和免疫预防中的应用。
背景技术：
牛皮蝇蛆病(Hypodermosis)是危害我国畜牧业生产，特别是我国西部地区牛羊的重要寄生虫病之一，每年给畜牧业生产和皮革工业带来数十亿元的经济损失。
由于牛皮蝇蛆病对家畜危害严重，呈区域性流行，且在家畜体内移行期长。对该病的诊断和防治带来了诸多困难。现阶段国际上主要采用的是大环内酯类药物如阿维菌素、伊维菌素等。这类药物的使用，特别是微小剂量的应用获得了良好的防治效果。虽然如此，药物的长期使用对动物的影响尚不可知，随着血清学、流行病学，特别是分子生物学的快速进展，为多年来一直希望能寻找的高效、安全、无毒、无害的药物的产生提供了可能。
法国农科院成功地从第一期牛皮蝇幼虫中筛选出天然牛皮蝇素A(HA)，建立了皮蝇素A、B1、B2和C等重组基因，已经应用于免疫诊断和免疫预防的研究。HA天然牛皮蝇素的免疫防治技术已经得到了加拿大家畜公司的认证许可。
随着对牛皮蝇蛆病的控制工作的进展，一方面，获得天然牛皮蝇素越来越困难，另一方面，寻找免疫预防的途径来巩固控制牛皮蝇病的成果显得十分重要。为了解决这一难题，重组基因蛋白就显示了它的优势。
为此，本实验室先后用大肠杆菌、果蝇细胞、杆状病毒和毕赤酵母对HA蛋白进行了表达。
大肠杆菌作为常用的原核表达载体，价廉周期短，可操作性强，产量高，但免疫活性差，不具有酶活性，不太可能带来理想的保护效果。
果蝇细胞表达的方法是由法国农科院提供，作为非裂解系统的一种结合了昆虫细胞的高表达和哺乳动物细胞的稳定表达的优点，能够高效连续表达。本实验室现已利用果蝇表达系统成功地对重组HA蛋白进行了表达及分离纯化，产量约为25mg/L，具有免疫原性和酶活性。28只山羊和30头牦牛的免疫保护试验表明所表达的蛋白对预防感染牛皮蝇蛆病有一定保护效果。但果蝇表达系统培养基过于昂贵，难以推广使用。
杆状病毒以分泌的形式表达蛋白，具有二级结构，同时保留原蛋白的修饰作用和功能，具有免疫原性和酶活性。但表达产量甚微，远不足以满足生产的需要。
毕赤酵母可快速利用培养基中的碳源，稳定复制基因组中的DNA，采用高密度连续培养，蛋白产量高。它除含有真核表达系统共有的翻译后修饰功能等优点外，同时也具有原核表达系统方便、简单和价廉等优点。
发明内容
针对已有技术存在的不足，本发明的目的之一在于提供牛皮蝇素A(HA)在毕赤酵母系统中的表达；本发明的目的之二在于提供牛皮蝇素A(HA)的生产方法；本发明的目的之三在于提供牛皮蝇素A(HA)的应用。
本发明的发明目的是通过如下技术方案实现的1、重组质粒的构建设计含EcoRI和NotI酶切位点的特异性引物，用PCR扩增出本实验室已构建PET28b-HA上的HA基因(见附图1)。用EcoRI和NotI分别酶切载体pPIC9k和片段HA，并用T4连接酶将其连接，形成重组质粒pPIC9k-HA(见附图2)。将重组产物转化入大肠杆菌TG1中进行扩增，酶切、PCR鉴定，测序确认。
2、重组质粒转化与筛选SacI酶切使之线性化，1.5kv，200Ω，25μF电击转化入制备好的酵母GS115细胞中，涂布于MD平板，30℃培养，2天后出现菌落，菌株为GS115/pPIC9k-HA。PCR鉴定。将菌涂布于含2.0mg/mlG418的YPD平板筛选多拷贝。
3、细胞培养与蛋白诱导分泌用BMGY培养基对筛选出的GS115细胞30℃扩增，3天后离心收集细胞，用含甲醇的BMMY培养基30℃诱导表达，每天添加0.5％的甲醇，然后收集上清。
4、表达产物纯化
将收集的上清液，浓缩至1/3体积后，于25nm Tris-HCl PH8.0缓冲液中透析。2小时换液一次，透析过夜，0.22um滤膜过滤。0～14CV 100％A液(25mM Tris-HCl PH8.0)洗。15～30CV 100％～90％A液和0～10％B液(2MNaCl)洗。流速5ml/分；进样量20ml。280nmUV检测，见峰收集。
5、纯化蛋白分子量、抗原性及酶活性的鉴定将收集到的峰电泳分析。用12％的PAGE胶做凝胶检测其分子量的大小并做Westem blotting，5％BSA PH7.4 0.01M PBS封闭液中温育2小时，一抗为兔抗HA血清1∶500，二抗为山羊抗兔IgG-HRP1∶2000。
将收集到的峰经1％明胶电泳分析，样品不经变性处理。电泳后用2.5％TritonX-100溶液4度洗涤2次，Revelation Buffer 37度温浴30分钟。考马斯兰染色。
7、结果重组后PCR及酶切(附图3)均证实了片断的正确插入，测序结果(附图4)表明未有发生碱基移码、丢失和增加。
电激转化后PCR证实菌落中含有重组质粒。
诱导表达后蛋白电泳表明，分泌蛋白中含有预计的30KD蛋白。(附图5)阴离子交换层析分离到一个高峰及若干个小峰。(附图6)收集到的第一峰蛋白为30KD蛋白。(附图7)Western Blotting显示了第一峰蛋白能与兔抗HA抗体特异性结合。(附图7)明胶电泳显示第一峰蛋白对明胶有水解作用，具有水解酶活性。(附图8)由于HA基因是插入到毕赤酵母基因组DNA中去的，所以能够在高密度连续培养的情况下稳定表达。酵母表达所使用的培养基由酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖、甘油等低廉原料组成，成本低。3天为一个培养周期，每升培养基中可获得约1500mg蛋白。阴离子交换层析柱一次进样量达20ml，一次能分离到蛋白15mg左右，时间约4小时。
本发明中用毕赤酵母表达牛皮蝇素A蛋白，并用FPLC阴离子交换层析的方法分离纯化HA。这是一种低廉且产量高的表达HA的方法，为产业化生产奠定了基础。且毕赤酵母可快速利用培养基中的碳源，稳定复制基因组中的DNA，采用高密度连续培养，蛋白产量高，它除含有真核表达系统共有的翻译后修饰功能等优点外，同时也具有原核表达系统方便、简单和价廉等优点。
图1为本发明GeneBank上登录的HA序列；图2为本发明pPIC9k-HA构建示意图；图3为本发明重组后PCR和酶切鉴定图；(其中1为重组质粒pPIC9k-HA扩增产物，2为重组质粒pPIC9k-HA经EcoRI和NotI酶切产物，3为空载体pPIC9k酶切产物，4为DL2000Marker)图4为本发明重组后α-Factor和3’AOX1测序结果；图5为本发明细胞培养上清液SDS-PAGE电泳图；(其中1为Marker，2、3、5分别为1、2、3天的细胞培养上清液，4为空载体阴性对照)
图6为本发明阴离子交换层析分离图；图7为本发明纯化蛋白SDS-PAGE电泳图；(1为Marker，2为阴性对照，3、4为纯化蛋白)图8为本发明纯化蛋白Western-blotting检测图；(1为纯化蛋白，2为阴性对照，3为Marker)图9为本发明纯化蛋白明胶电泳图；(1为由果蝇系统所表达的蛋白阳性对照，2为阴性对照，3、4为纯化蛋白)具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明是如何实现的实施例11重组质粒的构建1.1HA基因的扩增根据已报道的HA序列，设计一对含EcoRI和NotI酶切位点的引物，P15’-GTAGAATTCATGCTGAAGTTTG-3’，P25’-TTCGCGGCCGCTTAAATGGATTCTGCA-3’，按常规方法进行PCR扩增PET28b-HA上的HA基因。PCR参数94℃3min；30cycles94℃45s，58℃45s，72℃90s；72℃延伸10min。
1.2pPIC9k-HA的构建用EcoRI和NotI(购自TAKARA)分别酶切载体pPIC9k(上海农科院生物技术中心提供)和HA片段，37℃水浴2h后中止反应，用DNA胶回收试剂盒(购自上海生物工程公司)回收HA片段和pPIC9k，T4连接酶16℃连接过夜。
1.3重组质粒的鉴定将重组产物转化入感受态大肠杆菌TG1(本实验室保存)中，挑取氨苄抗性克隆(100mg/ml)，接种于LB培养基，37℃振荡培养过夜，抽提重组质粒，经酶切和PCR鉴定后测序。
2重组质粒的转化和筛选2.1重组质粒的转化重组质粒经SacI酶切2h后，1.5kv 200Ω 25μF电击转化入制备好的感受态酵母细胞GS115(上海农科院生物技术中心提供)中。
2.2多拷贝重组质粒的筛选菌液涂布于组氨酸缺陷培养基MD平板，30℃培养，2天后出现菌落。将各菌落分别点于含2mg/mlG418的YPD平板上，30℃培养，2天后PCR鉴定。
3细胞培养与蛋白诱导分泌将筛选后含多拷贝pPIC9k-HA质粒的GS115用以甘油为碳源的BMGY培养基30℃培养。当OD600值为10～20时，收集细胞，改用以甲醇为碳源的BMMY培养基30℃诱导表达，每24h添加0.5％的甲醇，3天后收集上清。
4分离纯化将细胞上清于25nm Tris-HCl PH8缓冲液中透析。每2h换液一次，透析过夜。再通过0.22um滤膜过滤。0～14CV 100％A液(25mM Tris-HClPH8.0)洗。15～30CV 100％～90％A液，0～10％B液(2M NaCl)洗。流速5ml/分；进样量20ml。280nmUV检测，分别收集各峰。
5表达产物的生物特性鉴定5.1分子量测定将收集的上清及各峰蛋白分别进行电泳分析。分离胶和积层胶的浓度分别为12％和15％，加样20μl，电压条件分别为130V和80V，以低分子量标准蛋白作对照。考马斯兰染色。
5.2抗原性检测将各峰蛋白进行12％的SDS-PAGE电泳，100V1h转移至硝酸纤维素膜(NC)上，5％BSA封闭，与1∶500兔抗HA血清(本实验室制备)反应2h，1∶2000羊抗兔IgG-HRP(购自上海华美生物工程公司)室温温育1h，加底物二氨基联苯胺和H2O2显色。
5.3酶活性检测各峰蛋白经0.1％明胶电泳分析，样品不经变性处理。电泳后2.5％TritonX-100溶液4℃洗涤，Revelation Buffer 37℃温浴30min。考马斯兰染色。
6、结果重组后PCR及酶切(附图3)均证实了片断的正确插入，测序结果(附图4)表明未有发生碱基移码、丢失和增加。
电激转化后PCR证实菌落中含有重组质粒。
诱导表达后蛋白电泳表明，分泌蛋白中含有预计的30KD蛋白。(附图5)阴离子交换层析分离到一个高峰及若干个小峰。(附图6)收集到的第一峰蛋白为30KD蛋白。(附图7)Western Blotting显示了第一峰蛋白能与兔抗HA抗体特异性结合。(附图7)明胶电泳显示第一峰蛋白对明胶有水解作用，具有水解酶活性。(附图8)实施例2由果蝇表达系统表达的重组牛皮蝇素A已在意大利和我国甘肃进行了免疫防治的现场试验，结果如下
*在甘肃渭源的试验从2001年下半年开始，2002年3月第一次计数虫孔。
试验结果表明，免疫重组HA蛋白能对山羊、牦牛带来一定的保护效果。
权利要求
1.牛皮蝇素A(HA)在毕赤酵母系统中的表达，其特征在于酵母表达载体为pPIC9k-HA。
2.根据权利要求1所述的牛皮蝇素A(HA)在毕赤酵母系统中的表达，其特征在于所述表达载体转化的能表达牛皮蝇素A(HA)的毕赤酵母菌株为GS115/pPIC9k-HA。
3.根据要求2所述的牛皮蝇素A(HA)在毕赤酵母系统中的表达，其特征在于所述的毕赤酵母菌株GS115/pPIC9k-HA生产牛皮蝇素A(HA)的方法为(1)细胞培养与蛋白诱导分泌用培养基对筛选出的GS115细胞扩增，3天后收集细胞，用含甲醇的BMMY培养基诱导表达，每天添加0.5％的甲醇，收集1～6天的上清。(2)表达产物纯化将收集的上清液，浓缩至1/3体积后，用阴离子交换层析柱交换层析分离纯化HA。
4.根据权利要求3所述的毕赤酵母菌株GS115/pPIC9k-HA生产牛皮蝇素A(HA)的方法，其特征在于所述的培养基是BMMY培养基。
5.根据权利要求3所述的毕赤酵母菌株GS115/pPIC9k-HA生产牛皮蝇素A(HA)的方法，其特征在于其中所述的培养温度为30℃。
6.根据权利要求3所述的毕赤酵母菌株GS115/pPIC9k-HA生产牛皮蝇素A(HA)的方法，其特征在于其中阴离子交换层析柱采用MoNoQ HR10/16柱。
7.根据权利要求3、4、5或6所述的方法生产得到的牛皮蝇素A(HA)用于牛皮蝇蛆病免疫诊断和免疫预防。
全文摘要
本发明公开了牛皮蝇素A(HA)在毕赤酵母系统中的表达及其应用，本发明中酵母表达载体为pPIC9k－HA，表达载体转化的能表达牛皮蝇素A(HA)的毕赤酵母菌株为GS115/pPIC9k－HA。毕赤酵母菌株GS115/pPIC9k－HA生产牛皮蝇素A(HA)的方法为先进行细胞培养与蛋白诱导分泌；再进行表达产物的纯化。本发明中用毕赤酵母表达牛皮蝇素A蛋白，并用FPLC阴离子交换层析的方法分离纯化HA，这是一种低廉且产量高的表达HA的方法，且毕赤酵母可快速利用培养基中的碳源，稳定复制基因组中的DNA，采用高密度连续培养，蛋白产量高，它除含有真核表达系统共有的翻译后修饰功能等优点外，同时也具有原核表达系统方便、简单和价廉等优点。所得产物应用于牛皮蝇蛆病免疫诊断和免疫预防。
文档编号C12N15/09GK1664097SQ20041006765
公开日2005年9月7日 申请日期2004年10月29日 优先权日2004年10月29日
发明者孙怡, 徐梅倩, 何国声, 张大兵, 梁婉琪, 朱顺海, 曹杰, 严凤, 黄燕 申请人:中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所