专利名称：T超家族芋螺毒素肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及T超家族芋螺毒素中的几种新型肽及其作为新药开发的候选药物和先导药物的用途。
背景技术：
芋螺属于海洋软体动物，它们通过注射毒液来捕获猎物。毒液是由约100种芋螺多肽毒素所组成的混合物，分别专一性地作用于不同的细胞靶点。毒液中的肽混合物随芋螺摄食的猎物不同而不同。
T超家族芋螺毒素是一类短肽，一般为10-17个氨基酸，具有四个特征性半胱氨酸骨架(-CC-CC-)以及二硫键连接方式(C1-C3，C2-C4)。T超家族芋螺毒素在三种不同食性(食鱼，食螺，食虫)的芋螺中都有发现，而且在芋螺毒液中的含量比较高，说明其有比较重要的生理功能。
T超家族芋螺毒素成熟肽的氨基酸序列有很大的可变性，在已发现的T超家族芋螺毒素中未发现明显的同源性，即使在同一种芋螺分泌的不同种T超家族芋螺毒素的氨基酸序列也有很大的不同。同时T超家族芋螺毒素在其成熟肽的翻译后加工上也有很大的不均一性，在同种芋螺所含有的T超家族毒素中，某些可能有高密度和多种类的翻译后修饰，而某些可能完全没有翻译后加工。正是由于以上二个原因，T超家族芋螺毒素表现出很高的多样性，预示着其功能的多样性。
T超家族芋螺毒素从总体上来说是一类兴奋性的毒素，它们能引起鱼类的狂躁不安，某些对小鼠也有作用。从织锦芋螺中分离纯化到的一种T超家族芋螺毒素-ε芋螺毒素Tx IX能够引起软体动物神经突触间隙的乙酰胆碱的释放量升高，从而使兴奋性突触后电位增强，它可能作用于突触前的钙通道或者G蛋白偶联受体。而其他的T超家族芋螺毒素功能研究还处于摸索的阶段，它的分子靶位还没有完全搞清。
因此，本领域中仍然需要开发出新的T超家族芋螺毒素肽。
发明内容
为实现上述目的，本发明一方面提供了一种芋螺毒素肽，所述芋螺毒素肽具有选自SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10任一所示的氨基酸序列。
本发明另一方面还提供编码上述芋螺毒素肽的分离的核酸序列，含有所述核酸序列的表达载体，经所述表达载体转化的宿主细胞。
本发明另一方面还提供了一种制备上述芋螺毒素肽的方法，其特征在于，该方法包括a)提供一表达载体，该表达载体含有编码芋螺毒素肽的核酸序列以及与该核酸序列操作性相连的表达调控序列；b)用步骤a)中的表达载体转化宿主细胞；c)在适合表达所述芋螺毒素肽的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；和d)分离纯化获得所表达出的芋螺毒素肽。
本发明获得的T超家族芋螺毒素是从芋螺的毒液管中分离得到的，经实验证明，该毒素是一种中枢神经系统兴奋性毒素，其能使鱼类变得好斗，易发怒，进攻性增强。对于哺乳动物，此类芋螺毒素能使小鼠上窜下跳，高度兴奋，直至死亡。本发明的T超家族芋螺毒素作用于中枢神经系种兴奋性神经元。另外，本发明的芋螺毒素肽经点突变后，有可能产生新的靶点特异性，因而其在靶点的研究中具有重要价值，是新药开发的候选药物和先导药物。
附图简述
图1a显示了T超家族芋螺毒素Mr5.1a的前体肽序列，图1b显示了T超家族芋螺毒素Mr5.1a的cDNA序列，其中阴影表示信号肽，其后为前导肽，粗体表示成熟肽。
图2a显示了T超家族芋螺毒素Mr5.1b的前体肽序列，图2b显示了T超家族芋螺毒素Mr5.1b的cDNA序列，其中阴影表示信号肽，其后为前导肽，粗体表示成熟肽。
图3a显示了T超家族芋螺毒素Mr5.2的前体肽序列，图3b显示了T超家族芋螺毒素Mr5.2的cDNA序列，其中阴影表示信号肽，其后为前导肽，粗体表示成熟肽。
图4a显示了T超家族芋螺毒素Mr5.3的前体肽序列，图4b显示了T超家族芋螺毒素Mr5.3的cDNA序列，其中阴影表示信号肽，其后为前导肽，粗体表示成熟肽。
图5a显示了T超家族芋螺毒素Mr5.4a的前体肽序列，图5b显示了T超家族芋螺毒素Mr5.4a的cDNA序列，其中阴影表示信号肽，其后为前导肽，粗体表示成熟肽。
图6a显示了T超家族芋螺毒素Mr5.4b的前体肽序列，图6b显示了T超家族芋螺毒素Mr5.4b的cDNA序列，其中阴影表示信号肽，其后为前导肽，粗体表示成熟肽。
图7a显示了T超家族芋螺毒素Lp5.1的前体肽序列，图7b显示了T超家族芋螺毒素Lp5.1的cDNA序列，其中阴影表示信号肽，其后为前导肽，粗体表示成熟肽。
图8a显示了T超家族芋螺毒素Lp5.2的前体肽序列，图8b显示了T超家族芋螺毒素Lp5.1的cDNA序列，其中阴影表示信号肽，其后为前导肽，粗体表示成熟肽。
图9a显示了T超家族芋螺毒素Mi5.1的前体肽序列，图9b显示了T超家族芋螺毒素Mi5.1的cDNA序列，其中阴影表示信号肽，其后为前导肽，粗体表示成熟肽。
具体实施例方式
具体而言，本发明人从我国海南三亚附近海域采集的大理石芋螺(C.marmoreus)，豹芋螺(C.leopardus)，勇士芋螺(C.miles)中发现了几种芋螺多肽毒素，并通过蛋白质分离纯化和N端测序，或是通过cDNA克隆的方法获取芋螺毒素的cDNA序列来推测出其成熟肽的序列，从而完成了本发明。本发明获得的芋螺多肽毒素(芋螺毒素肽)为T超家族芋螺毒素，其具有以下序列T超家族芋螺毒素mr5a的多肽序列NACCIVRQCC(SEQ ID NO1)；T超家族芋螺毒素Mr5.1a的多肽序列CCPGWELCCEWDEW(SEQ ID NO2)；T超家族芋螺毒素Mr5.1b的多肽序列CCPGWELCCEWDDGW(SEQ ID NO3)；T超家族芋螺毒素Mr5.2的多肽序列FCCRTQγVCCγAIKN*(其中γ表示γ羧基谷氨酸，*表示-C末端酰胺化)(SEQ ID NO4)；T超家族芋螺毒素Mr5.3的多肽序列CCITFγSCCγFDLK(其中γ表示γ羧基谷氨酸)(SEQ ID NO5)；T超家族芋螺毒素Mr5.4a的多肽序列CCQVMPQCCEWN(SEQ ID NO6)；T超家族芋螺毒素Mr5.4b的多肽序列CCQIVPQCCEWN(SEQ ID NO7)；T超家族芋螺毒素Lp5.1的多肽序列SCCPQEFLCCLYLVK(SEQ ID NO8)；T超家族芋螺毒素Lp5.2的多肽序列GSVCCKVDTSCCSN(SEQ ID NO9)；T超家族芋螺毒素Mi5.1的多肽序列CCPGNFACC*(其中*表示C末端酰胺化)(SEQ ID NO10)。
本发明的T超家族芋螺毒素多肽序列还包括与上面所示的序列相比，有一个或多个(例如1-3个)氨基酸序列添加、缺失、取代且保留所述多肽序列的至少部分生物活性的氨基酸序列或其修饰物或衍生物。
本发明包括的“取代”还可以是“非保守的”，其中，多肽中存在的一个氨基酸残基被一个具有不同特征的氨基酸，例如来自不同类的天然氨基酸(如以丙氨酸置换一个带电的氨基酸或疏水性氨基酸)所置换，或者是，其中，一个天然氨基酸被非常规氨基酸所取代。氨基酸取代一般是单一的残基，但也可以是多个残基，或者是成簇的，或者是分散的。
在本文定义中，“添加”包括一个或多个天然的或非常规的氨基酸残基的添加。“缺失”包括一个或多个氨基酸残基的缺失。所述“修饰物或衍生物”包括用本领域已知的方法从残基侧链上的官能团或N-或C-端基团制得的衍生物。这类修饰可能对肽的稳定性和其它特性、甚至其疗效都很重要。如氨基酸的侧链连接一亲脂基团可增加肽的膜渗透性，而不影响肽的生物活性，而某些残基的修饰有可能增强肽的生物活性或改变其靶的选择性。所有这些修饰的肽衍生物都应属于本发明的范围内。本发明预期的其它衍生物还将包括肽经糖基化后的一系列的糖基化变体。
本发明的肽可能是天然的T超家族芋螺毒素多肽序列，也可能是这类天然肽的衍生物。它们之间的不同处在于一个和多个氨基酸残基被取代、缺失或添加。
本发明另一方面还提供了编码上述芋螺毒素肽的分离的核酸序列，含有所述核酸序列的表达载体，经所述表达载体转化的宿主细胞。
本发明的核酸分子可以是DNA或RNA。当该核酸分子呈DNA形式时，它可以是基因组DNA或cDNA。而当该核酸分子呈RNA形式时，它一般是mRNA形式。
虽然本发明的核酸分子一般呈分离的形式，但它们可被整合入或连接到其它基因分子或者与其它基因分子融合或结合，所述其它基因分子可为载体分子(特别是表达载体分子)。载体和表达载体通常能在原核细胞或真核细胞中的一种或两者中复制和表达(如果合适的话)。因此，本发明的另外一方面提供了一种基因构建物，它包括载体部份和能编码本发明的肽的基因。优选地，所述基因构建物的基因部份可操纵地被连接到所述载体上的启动子，以至所述启动子能在合适细胞中指导基因部份的表达。
本发明的芋螺毒素肽可这样制备通过应用标准的肽合成方法、接着形成氧化二硫键。例如，线性肽可通过应用Boc化学的固相法合成。在去保护和从固体载体分离后，应用制备色谱法纯化还原的肽，纯化后的还原肽在缓冲体系中被氧化，形成二硫键配对。应用制备色谱法纯化氧化的肽。
本发明的芋螺毒素肽还可通过分子重组方法来获得。因此，本发明另一方面还提供了一种制备上述芋螺毒素肽的方法，该方法包括a)提供一表达载体，该表达载体含有编码芋螺毒素肽的核酸序列以及与该核酸序列操作性相连的表达调控序列；b)用步骤a)中的表达载体转化宿主细胞；c)在适合表达所述芋螺毒素肽的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；和
d)分离纯化获得所表达出的芋螺毒素肽。
首先提供含有编码本发明的芋螺毒素肽的核酸序列。这些核酸序列例如具有图1b、2b、3b、4b、5b、6b、7b、8b、9b中所示的DNA序列。然而，本领域技术人员也可利用本领域中熟知的遗传密码的简并性获得编码上述多肽序列的所有其它核酸序列。
然后，在获得了所述核酸序列后，就可通过本领域熟知的各种方法，例如DNA重组技术，将所述核酸序列克隆到合适的表达载体中，并与表达调控序列操作性相连。本文所用的术语“表达调控序列”通常指参与控制核苷酸序列表达的序列。表达调控序列包括与目标核苷酸序列操作性相连的启动子和终止信号。它们通常还包括核苷酸序列适当翻译所需的序列。“操作性相连”是指线性核酸序列的某些部分能够影响同一线性核酸序列其他部分的活性。例如，如果启动子或增强子增加了编码序列的转录，则它与编码序列是操作性相连的。本发明中所用的表达载体是本领域技术人员已知的各种市售的表达载体。
然后，用上述获得的表达载体转化合适的宿主细胞。在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞等。
最后，在适合本发明的芋螺毒素肽表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后用离子交换层析、疏水层析、分子筛层析以及亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段即可纯化得到本发明的芋螺毒素肽。
在某些情况下，可能需要在肽表达后再以化学形式对表达产物进行氧化、二硫键配对。本领域技术人员可以轻易确定肽的还原和氧化的合适条件。
下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(如Sambrook等，分子克隆实验室手册，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，1989中所述条件)实施，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 T超家族芋螺毒素mr5a的分离纯化和测序1.1芋螺毒素粗毒的制备将活的大理石芋螺(C.marmoreus)解剖，在1.1％的乙酸缓冲液中匀浆毒液管，将溶液5000g离心10分钟，取上清，在用1.1％的乙酸抽提，重复三次，合并三次的上清，冻干备用。
1.2芋螺毒素mr5a的分离，纯化将粗毒样品经低压层析系统用Sephadex G-25层析柱，用1.1％的乙酸为缓冲液，按分子量范围分级，去除大蛋白和小分子化合物，获得多肽组分。将多肽组分通过高压液相色谱进一步分离，其中第八个组分，经过质谱，N端测序确定其一级结构。
实施例2 其它T超家族芋螺毒素的获得2.1芋螺毒液管中RNA的提取将毒液管放入盛有液氮的研钵中，用研钵棒研成细粉。将粉末转入一个Eppendorf管中，加入1ml TRIzol(Invitrogen Life Technology)，于30℃温育5分钟，加入200uL氯仿，用手剧烈震荡Eppendorf管15秒，然后在30℃温育3分钟后，在4℃12000g离心15分钟，将上层水相转入一个新的Eppendorf管中，加入500uL异丙醇沉淀RNA混匀，于30℃温育10分钟。在4℃12000g离心10分钟，弃上清，用lmL的75％乙醇洗涤沉淀，最后用适量DEPC水重溶RNA。
2.2芋螺毒液管cDNA文库的构建取5ug溶于DEPC水的总RNA，加入10uM的衔接引物(Adapter Primer)1.0uL，混匀，65℃水浴10分钟，转入冰浴2分钟。加入10xPCR缓冲液2.0uL，10mM dNTPMix 1.0uL，0.1M DTT 2.0uL，混匀，42℃水浴2分钟。加入1.0uL的SuperScriptTMIIRT(200U/uL)，42℃水浴50分钟。70℃水浴15分钟后转入冰浴，加入1.0uL RNaseH，混匀，37℃水浴20分钟。
2.3芋螺毒素基因的克隆根据芋螺毒素基因的保守性，设计了A-Superfamily，O-Superfamily，T-Superfamily的特异性5’端引物，以通用引物AUAP为3’端引物，以上述cDNA文库为模板，分别进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，连接到pGEM-T Easy载体上。连接产物转化大肠杆菌DH5α，将阳性克隆进行测序。
序列表<110>戚正武王琪韩禹宏蒋辉邵晓霞<120>T超家族芋螺毒素肽<130>046251<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>10<212>PRT<213>大理石芋螺(Conus marmoreus)<400>1Asn Ala Cys Cys Ile Val Arg Gln Cys Cys1 5 10<210>2<211>14<212>PRT<213>大理石芋螺(Conus marmoreus)<400>2Cys Cys Pro Gly Trp Glu Leu Cys Cys Glu Trp Asp Glu Trp1 5 10<210>3<211>15<212>PRT<213>大理石芋螺(Conus marmoreus)<400>3Cys Cys Pro Gly Trp Glu Leu Cys Cys Glu Trp Asp Asp Gly Trp1 5 10 15
<210>4<211>15<212>PRT<213>大理石芋螺(Conus marmoreus)<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>γ-羧基谷氨酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(11)..(11)<223>γ-羧基谷氨酸<220>
<221>AMIDATION<222>(15)..(15)<223>
<400>4Phe Cys Cys Arg Thr Gln Xaa Val Cys Cys Xaa Ala Ile Lys Asn1 5 10 15<210>5<211>14<212>PRT<213>大理石芋螺(Conus marmoreus)<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>γ-羧基谷氨酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>γ-羧基谷氨酸<400>5Cys Cys Ile Thr Phe Xaa Ser Cys Cys Xaa Phe Asp Leu Lys
1 5 10<210>6<211>12<212>PRT<213>大理石芋螺(Conus marmoreus)<400>6Cys Cys Gln Val Met Pro Gln Cys Cys Glu Trp Asn1 5 10<210>7<211>12<212>PRT<213>大理石芋螺(Comus marmoreus)<400>7Cys Cys Gln Ile Val Pro Gln Cys Cys Glu Trp Asn1 5 10<210>8<211>15<212>PRT<213>大理石芋螺(Conus marmoreus)<400>8Ser Cys Cys Pro Gln Glu Phe Leu Cys Cys Leu Tyr Leu Val Lys1 5 10 15<210>9<211>14<212>PRT<213>大理石芋螺(Conus marmoreus)<400>9Gly Ser Val Cys Cys Lys Val Asp Thr Ser Cys Cys Ser Asn1 5 10<210>10<211>9<212>PRT<213>大理石芋螺(Conus marmoreus)
<220>
<221>AMIDATION<222>(9)..(9)<223>
<400>10Cys Cys Pro Gly Asn Phe Ala Cys Cys1 权利要求
1.一种芋螺毒素肽，其特征在于，它具有选自SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10任一所示的氨基酸序列。
2.一种分离的核酸序列，其特征在于，它编码权利要求1所述的芋螺毒素肽。
3.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的核酸序列。
4.一种宿主细胞，其特征在于，它被权利要求3所述的表达载体转化。
5.一种制备权利要求1所述的芋螺毒素肽的方法，其特征在于，该方法包括a)提供一表达载体，该表达载体含有编码权利要求1所述的芋螺毒素肽的核酸序列以及与该核酸序列操作性相连的表达调控序列；b)用步骤a)中的表达载体转化宿主细胞；c)在适合表达所述芋螺毒素肽的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；和d)分离纯化获得所表达出的芋螺毒素肽。
全文摘要
本发明公开了一种新的芋螺毒素肽，它具有选自SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10任一所示的氨基酸序列。本发明还提供了编码上述芋螺毒素肽的分离的核酸序列，含有所述核酸序列的表达载体，经所述表达载体转化的宿主细胞，以及制备上述芋螺毒素肽的方法。
文档编号C12N15/63GK1765922SQ20041006751
公开日2006年5月3日 申请日期2004年10月27日 优先权日2004年10月27日
发明者戚正武, 王琪, 韩禹宏, 蒋辉, 邵晓霞 申请人:戚正武, 王琪, 韩禹宏, 蒋辉, 邵晓霞