专利名称：一种齐考诺肽的固相合成方法
技术领域：
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种齐考诺肽的固相合成方法。
背景技术：
齐考诺肽(ziconotide)是ω-芋螺毒素MVIIA的合成形式，天然型存在于南太平洋海洋蜗牛(Conusmagus)体内，是由25个氨基酸组成的阳离子多肽,包括3对二硫键连接的6个半胱氨酸残基,分子量为2639.12。它是强效的、特异性、选择性、可逆的的N型电压敏感性钙通道(N-typevoltage-sensitive calcium channels, N-type VSCCs)阻滞剂，可阻止脊髓初级疼痛传入神经元上钙离子的涌入，抑制神经递质如P物质、降钙素基因相关肽以及谷氨酸等的释放，从而阻止或降低疼痛信号的传导，对其他离子通道没有明显的亲和力。鞘内注射齐考诺肽可以阻断初级伤害感受器的传入神经递质的释放，同时阻止疼痛信号从脊髓向脑部传导，从而产生镇痛作用。长期给药不会引起耐受性，优于鞘内注射吗啡，可用于治疗难治性、阿片类药物无效或已产生耐药性的病例。一系列的临床实验已经证明鞘内注射齐考诺肽可以治疗带状疱疹后遗神经痛，幻肢痛，HIV相关神经病理性疼痛，难治性癌痛，手术后疼痛。而且齐考诺肽不与阿片受体、胆碱能受体、单胺类受体或肽能受体结合。此外，齐考诺肽仍存在部分副作用，表现为:头晕，恶心，眼球震颤，步态异常，便秘，尿潴留，嗜睡，体位性低血压，呕吐，思维混乱，视力异常。头晕，恶心，思维混乱，头痛最为常见。通过剂量调整和缓慢滴定，其副作用是可控，可逆的。有精神病史的病人不能用齐考诺肽治疗。对有精神缺陷、幻觉情绪改变的病人要严密监护。如果有精神问题发生，应当终止齐考诺肽治疗并改用精神药物治疗。2004年美国食品及药物管理局批准其用于鞘内注射治疗，主要适用于其他治疗方法不能耐受或不能控制的严重慢性疼痛患者。在欧洲，齐考诺肽也被允许用于严重慢性疼痛患者的治疗。2007年，联合镇痛会议专门小组推荐齐考诺肽作为一线鞘内镇痛药物。生物提取现受到现有有限生物资源的影响，提取过程较繁琐，效率低，且比较难得到高纯度的产物。低温自然成环反应属于热力学控制，环化过程慢，过程控制较复杂，反应收率低。齐考诺肽的合成技术主要是液态合成法，很少有固相合成法的报道。其相关专利主要集中在药理和治疗方面，如US2007269528，US2006234936, LU91181。2007年中国专利局公布一篇相关专利CN101412752A介绍了一种采用Fmoc策略固相合成齐考诺肽的方法[I]，合成路线如下:该方法以Fmoc-Rink Amide-MBHA树脂为固相载体，以HOBt和DIC为缩合剂，依次将侧链保护的氨基酸连到树脂上，得到含25个氨基酸的线性全保护肽树脂，其中形成二硫键的三组Cys分别由Trt、Acm、Mob保护,不同组Cys由不同的保护基保护，同组Cys由同一种保护基保护。将线性全保护肽树脂溶于I %的TFA/DCM溶液，室温反应20分钟脱 去Trt保护基，过滤后加入水、乙腈、DMSO (体积比10:15:1)，稀氨水调节PH至8，室温下搅拌反应4小时，得到齐考诺肽一环肽树脂。将得到的一环肽树脂中加入0.4mmol/ml的碘/甲醇溶液，室温反应2小时，洗涤过滤得到齐考诺肽二环肽树脂。将得到的二环肽树脂溶于三氟醋酸、三氟甲磺酸、硫代苯甲醚、乙二硫醇(体积比:80:8:8:4)混合溶液中，室温反应3小时，过滤沉淀后得到齐考诺肽二环肽粗品。将得到的二环肽粗品溶于水中，调PH至8，双氧水存在下室温反应一小时，得到齐考诺肽三环粗肽，HPLC制备纯化得到齐考诺肽。整个合成过程反应流程如
图1所示。该方法的优势在于采用纯固相方法，操作比较简单。但是，在固相条件下完成前两个二硫键的氧化，重复难度很大；切割肽树脂时，容易导致两对二硫键的断裂和重排而使产物纯化复杂；最后一步双氧水作用的环化过程中肽浓度要求非常低，不适于商品化大规模生产，并且该过程很容易形成二聚物或多聚物。2009年中国专利局公布一篇相关专利CNlO 1709082A介绍了一种齐考诺肽的制备方法[2]，合成路线如下:该方法以氨基树脂为固相载体，在HATU/HOAt作用下首先与Fmoc-Cys (Acm) -OH缩合得到Fmoc-Cys (Acm)-氨基树脂。该树脂肽与Fmoc氨基酸在偶联剂作用下生成全保护的线性全保护肽，其中全部Cys侧链均用Acm保护。使用TFA、苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇(90:5:3:2)裂解肽树脂，得到Cys侧链含有Acm的齐考诺肽线性粗肽。将粗肽用TFA溶解，加入Tl (TFA) 3反应脱除Acm保护基，然后DTT辅助自然氧化得到齐考诺肽，纯化，总收率在30 %以上。整个合成过程反应流程如图2所示。该方法的优势在于合成步骤简便。但是，Cys的保护基全部选用Acm，同时脱除，同时形成三对二硫键，导致二硫键的连接准确率低，产率低，纯化困难。2011年中国专利局公布一篇相关专利CN102268082A介绍了一种齐考诺肽的固相合成方法[3]，合成路线如下:该方法以Fmoc-氨基树脂为固相载体，以HOBt和HBTU为缩合剂，依次将侧链保护的氨基酸连到树脂上，得到含25个氨基酸的线性全保护肽树脂，其中形成二硫键的三组Cys分别由Trt、Acm、tBu保护,不同组Cys由不同的保护基保护，同组Cys由同一种保护基保护。将线性全保护肽树脂溶于三氟乙酸、苯甲硫醚、二巯基乙烷和苯甲醚(90:5:2.5:2.5),室温反应2小时脱去Trt保护基，得到Cys侧链含有Acm和tBu的线性粗肽。将该粗肽溶于乙酸溶液，加入10倍摩尔当量的I2，室温反应I小时，同时形成两对二硫键得到二环肽。将得到的二环肽溶于二甲基亚砜、苯甲醚和三氟乙酸(258:1.6:100000)混合溶液中，室温反应5小时，冻干得到齐考诺肽三环肽粗品，HPLC制备纯化得到齐考诺肽。整个合成过程反应流程如图3所示。该方法的优势在于简化了合成步骤。但是前两个二硫键同时形成，会形成三种二硫键连接方式不同的异构体，而这三种异构体因极性差异很小，导致很难在HPLC制备纯化中分开，导致最终得到的产物纯度低，杂质多。而且二甲基亚砜和苯甲醚氧化强度不大，形成三环肽的过程很难重复出来，且反应时间较长，易形成二聚体。参考文献:[I]路杨，李新宇。齐考诺肽的固相合成方法:中国，200710301598.8[P].2009-04-22。
[2]宓鹏程，李红玲，马亚平，袁建成。一种齐考诺肽的固相合成方法:中国，200910188686.0[P]。2010-05-19。[3]董守良，李梅兴。一种齐考诺肽的固相合成方法:中国，201110139661.9[P]。2011-12-07。
发明内容
本发明提供了一种定向二硫键形成、高产率、纯化简便、反应条件温和、有利于实现工业化生产的固相齐考诺肽合成方法。为实现上述目的，本发明采取以下技术方案:一种齐考诺肽的固相合成方法，所述方法包括如下顺序步骤:(I)以Fmoc-氨基树脂为固相载体，从C端到N端依次缩合反应连接25个侧链保护的氨基酸，得到25个氨基酸的线性全保护肽树脂，其中，形成二硫键的三组Cys (1-16，8-20, 15-25)分别连接Trt、Acm或tBu保护基，同组的Cys连接相同保护基,不同组的Cys连接不同的保护基；(2)将步骤⑴得到的线性全保护肽树脂进行线性切割，切割的同时脱去除Cys (Acm)和Cys (tBu)外的其它所有氨基酸的侧链保护基,得到含Cys (Acm)和Cys (tBu)的线性肽；(3)氧化步骤(2)得到的线性肽形成第一对二硫键，得到单二硫环肽；(4)脱除步骤(3)得到的单二硫环肽中Cys (Acm)的Acm保护基，同时环化形成第二对二硫键，得到双二硫环肽；(5)脱除步骤(4)·得到的双二硫环肽中Cys (tBu)的tBu保护基，同时环化形成第三对二硫键，得到三二硫环肽；(6)步骤(5)得到的三二硫环肽经HPLC纯化、冻干得到齐考诺肽。步骤(I)中，所述的氨基树脂为Rink Amide树脂、Rink Amide-MBHA树脂、RinkAmide-BHA 树脂、Rink Amide-AM 树脂、PAL 树脂、Knorr 树脂或 Sieber 树脂。步骤(I)中，以Fmoc-氨基树脂为固相载体，从C端到N端依次缩合反应连接如下25 个侧链保护的氨基酸:Fmoc_Cys (Acm)-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser (tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Cys(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Thr-0H, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Cys(tBu)-OH, Fmoc-Lys (Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(Boc) -OH, Fmoc-Cys (Trt) -OH,得到的25个氨基酸的线性全保护肽树脂如下:NH2-Cys (Acm)-Lys(Boc)-Gly-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Cys(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Thr-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Asp (OtBu)-Tyr(tBu)-Met-Leu-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Cys(tBu)-Lys (Boc) -Ala-Gly-Lys (Boc) -Gly-Lys (Boc) -Cys (Trt) -NH-Rink Amide MBHA 树脂。其中，Fmoc=荷甲氧羰基,Trt=三苯甲基,Acm=乙酰胺甲基,tBu=叔丁基，Pbf=2, 2, 4, 6, 7-五甲二氢苯并呋喃-5-磺酰基，Boc=叔丁基氧羰基。步骤(I)中，从C端到N端依次缩合反应连接25个侧链保护的氨基酸，得到25个氨基酸的线性全保护肽树脂，方法为:按1: (4 8): (4 8)的摩尔比分别称取溶胀后的氨基树脂、Fmoc保护氨基酸、偶联剂，将Fmoc保护氨基酸和偶联剂溶于二甲基甲酰胺，预活化，然后加入溶胀后并已经脱除Fmoc保护基的氨基树脂，室温震荡反应0.5 3小时连接Fmoc保护氨基酸，连接下一个氨基酸前用哌啶的N，N- 二甲基甲酰胺溶液脱Fmoc保护基3次，时间分别为3 5分钟、3 5分钟、15 25分钟，每次连接一个氨基酸之后和脱除Fmoc保护基之后都需用二氯甲烷和二甲基甲酰胺交替洗涤3 10次，用量为5 10ml/g树脂；其中，所述的偶联剂为DIC与组分A摩尔当量比为1:2的混合物，或组分A、组分B和组分C三者摩尔当量比为1:1:2的混合物，其中组分A为HOBt或HOAt，组分B为HBTU、HATU, TBTU 或 PyBOP，组分 C 为 DIPEA 或 TMP。步骤⑵中，将三氟乙酸、苯酚、水、TIS按照体积比88:5:5:2混合，或者，将三氟乙酸、茴香硫醚、乙二硫醇、苯甲醚按照体积比90:5:3:2混合，将上述两种混合液中的任意一种加入到步骤(I)得到的线性全保护肽树脂中，震荡反应I 2小时后，将反应液逐滴滴入冰乙醚中，沉淀，离心，倒掉上清，收集沉淀物，反复洗漆5 8次,得到含Cys (Acm)和Cys (tBu)的线性肽。
权利要求
1.一种齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于，所述方法包括如下顺序步骤: (1)以Fmoc-氨基树脂为固相载体，从C端到N端依次缩合反应连接25个侧链保护的氨基酸，得到25个氨基酸的线性全保护肽树脂，其中，形成二硫键的三组Cys分别连接Trt、Acm或tBu保护基，同组的Cys连接相同保护基，不同组的Cys连接不同的保护基； (2)将步骤(I)得到的线性全保护肽树脂进行线性切割，切割的同时脱去除Cys(Acm)和Cys (tBu)外的其它所有氨基酸的侧链保护基,得到含Cys(Acm)和Cys (tBu)的线性肽； (3)氧化步骤(2)得到的线性肽形成第一对二硫键，得到单二硫环肽； (4)脱除步骤(3)得到的单二硫环肽中Cys(Acm)的Acm保护基，同时环化形成第二对_■硫键，得到双_■硫环妝； (5)脱除步骤(4)得到的双二硫环肽中Cys(tBu)的tBu保护基，同时环化形成第三对二硫键，得到三二硫环肽； (6)步骤(5)得到的三二硫环肽经HPLC纯化、冻干得到齐考诺肽。
2.根据权利要求1所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤⑴中，所述的氨基树脂为 Rink Amide树脂、Rink Amide-MBHA树脂、Rink Amide-BHA树脂、Rink Amide-AM树脂、PAL树脂、Knorr树脂或Sieber树脂。
3.根据权利要求1所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(I)中，以Fmoc-氨基树脂为固相载体，从C端到N端依次缩合反应连接如下25个侧链保护的氨基酸:Fmoc-Cys (Acm)-OH, Fmoc-Lys (Boc)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser (tBu)-0H，Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Cys(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Thr-OH,Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc -Cys (Acm)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-0H,Fmoc-Met-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Cys(tBu)-0H,Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Cys (Trt)-OH,得到的25个氨基酸的线性全保护肽树脂如下:NH2-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Gly-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Cys(tBu)-Ser (tBu)-Gly - Thr-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Asp (OtBu)-Tyr(tBu)-Met-Leu-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Cys(tBu)-Lys (Boc) -Ala-Gly-Lys (Boc) -Gly-Lys (Boc) -Cys (Trt) -NH-Rink Amide MBHA 树脂。
4.根据权利要求1或2或3所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(I)中，从C端到N端依次缩合反应连接25个侧链保护的氨基酸，得到25个氨基酸的线性全保护肽树脂，方法为:按1: (4 8): (4 8)的摩尔比分别称取溶胀后的氨基树脂、Fmoc保护氨基酸、偶联剂，将Fmoc保护氨基酸和偶联剂溶于二甲基甲酰胺，预活化，然后加入溶胀后并已经脱除Fmoc保护基的氨基树脂，室温震荡反应0.5 3小时连接Fmoc保护氨基酸，连接下一个氨基酸前用哌啶的N，N- 二甲基甲酰胺溶液脱Fmoc保护基3次，时间分别为3 5分钟、3 5分钟、15 25分钟，每次连接一个氨基酸之后和脱除Fmoc保护基之后都需用二氯甲烷和二甲基甲酰胺交替洗涤3 10次，用量为5 10ml/g树脂； 其中，所述的偶联剂为DIC与组分A摩尔当量比为1:2的混合物，或组分A、组分B和组分C三者摩尔当量比为1:1:2的混合物，其中组分A为HOBt或HOAt，组分B为HBTU、HATU、TBTU 或 PyBOP，组分 C 为 DIPEA 或 TMP。
5.根据权利要求1所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(2)中，将三氟乙酸、苯酚、水、TIS按照体积比88:5:5:2混合，或者，将三氟乙酸、茴香硫醚、乙二硫醇、苯甲醚按照体积比90:5:3:2混合，将上述两种混合液中的任意一种加入到步骤(I)得到的线性全保护肽树脂中，震荡反应I 2小时后，将反应液逐滴滴入冰乙醚中，沉淀，离心，倒掉上清，收集沉淀物，反复洗漆5 8次,得到含Cys (Acm)和Cys (tBu)的线性肽。
6.根据权利要求1所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(3)中，将步骤(2)得到的线性肽溶于乙酸水溶液，碳酸胺调节pH值至6，加入体积百分含量为20%的DMSO，室温下搅拌反应2小时，反应结束，加入两倍体积的三氟乙酸、乙腈与水的混合液终止反应，冻干溶液，得到单二硫环肽；其中，三氟乙酸、乙腈与水的混合液中，三氟乙酸的体积百分含量为0.05%,乙腈的体积百分含量为5%。
7.根据权利要求1所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤⑷中，将步骤(3)得到单二硫环肽溶于乙酸水溶液中，加入10 15倍摩尔当量的I2单质，室温搅拌反应I 2小时，反应完全后，加入2倍体积的四氯化碳和水按照体积比1:1的混合物终止反应，静置分层，收集水相，用四氯化碳反复洗涤5 6次，然后反萃取2 3次，收集水相，冻干溶液，得到双二硫环肽。
8.根据权利要求1所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(5)中，将步骤(4)得到的双二硫环肽溶于三氟乙酸中，依次加入10倍摩尔当量的二苯基亚砜，150倍摩尔当量的三氯甲基硅烷，100倍摩尔当量的苯甲醚，室温搅拌反应15分钟，将溶液逐滴滴入冰乙醚中，静置，离心， 倒掉上清，收集沉淀物，乙醚重复洗涤2 3遍，风干，得到三二硫环肽。
全文摘要
本发明公开了一种齐考诺肽的固相合成方法，以Fmoc-氨基树脂为固相载体，缩合反应连接25个侧链保护的氨基酸，得到线性全保护肽树脂，其中，形成二硫键的三组Cys分别连接Trt、Acm或tBu保护基；将树脂进行线性切割，切割的同时脱去除Cys(Acm)和Cys(tBu)外的其它所有氨基酸的侧链保护基；氧化线性肽形成第一对二硫键，得到单二硫环肽；脱除单二硫环肽中Cys(Acm)的Acm保护基，同时环化形成第二对二硫键，得到双二硫环肽；脱除双二硫环肽中Cys(tBu)的tBu保护基，同时环化形成第三对二硫键，得到三二硫环肽；三二硫环肽经纯化、冻干得到齐考诺肽。
文档编号C07K14/435GK103242441SQ20131020221
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月27日 优先权日2013年5月27日
发明者董守良, 曹硕, 陈强, 常民, 彭雅丽 申请人:江苏施美康药业股份有限公司