专利名称：突变型gl－7－aca酰化酶及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。更具体地说，本发明涉及新的突变型戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶及其应用。
背景技术：
作为催化头孢类抗生素母核7-氨基头孢烷酸(7-ACA)生成的关键酶，戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶(以下简称为“GL-7-ACA酰化酶”，EC.3.5.1.11)在工业生产中有着重要的应用价值。
然而，该酶还存在许多不尽人意之处。目前应用于工业生产中有固定化细胞和固定化酶。由于细菌有细胞壁，底物进入胞内时有透性屏障作用(permeability barrier)，细胞经固定化后更加减慢了酶与底物的结合以及产物的释放。另外固定化细胞在生产中易染菌，所以目前大多用固定化酶。酶作为催化剂有不同的半衰期，GL-7-ACA酰化酶的稳定性较低，酶反应的最适温度为37℃，在30-42℃范围内稳定性较好，超出此范围则酶的活力丧失很快，在65℃时，酶的残余活力不到12％。GL-7-ACA酰化酶反应的最适pH是7.0，pH高于8.0或低于7.0则酶活力迅速下降。在工业生产中固定化酰化酶水解GL-7-ACA不断产生戊二酸和7-ACA，使反应环境偏酸，通常需要大量加入碱来使pH值不下降以保持酶的活力。这常常造成反应溶液酸碱度不均一，而且中和掉了一部分产物7-ACA，降低了得率，增加了成本。另外，固定化GL-7-ACA酰化酶的稳定性也很低，仅为固定化青霉素酰化酶的千分之一。所以，提高GL-7-ACA酰化酶的稳定性有着重要的工业意义。
另一方面，本领域中也迫切希望能够进一步提高GL-7-ACA酰化酶的催化活力。Sanggu Kim等曾经做过CAD催化中心和底物结合中心关键氨基酸的定点突变工作，但是并没有得到GL-7-ACA酰化酶活力提高的突变体。
发明内容
为了提高GL-7-ACA酰化酶CA130的催化活力并改善其在反应体系中使用的稳定性，本发明人在蛋白质晶体结构的基础上进行有理计算机设计，通过定点突变来提高酶的活力、半衰期及碱稳定性，结果在底物结合区域以及蛋白表面分别设计了两个系列的突变体，从而实现了本发明的发明目的。
具体而言，本发明一方面提供了一种突变型戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶，其特征在于，该酶的β亚基第50位的氨基酸谷胺酰胺突变成了天冬酰胺。
本发明另一方面提供了一种突变型戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶，其特征在于，该酶的β亚基第198位的氨基酸赖氨酸突变成了丙氨酸。
本发明还有一个方面提供了一种突变型戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶，其特征在于，该酶的β亚基第50位的氨基酸谷胺酰胺突变成了天冬酰胺，同时β亚基第198位的氨基酸赖氨酸突变成了丙氨酸。
本发明另一方面还提供了编码上述突变型戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的DNA序列，含有所述DNA序列的载体和转化的宿主细胞。在一个较佳的实施方案中，所述宿主细胞是原核宿主细胞，例如大肠杆菌、枯草杆菌等。
本发明另一方面还涉及本发明所述的突变型戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶或宿主细胞的在生产7-氨基头孢烷酸中的应用。
天然的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的氨基酸序列和核苷酸序列是现有技术中已知的(例如参见Li Y.，L.Chen，W.Jiang et al.In vivo post-translational processing andsubunit reconstitution of cephalosporin acylase from Pseudomonas sp.130.Eur.J.Biochem.1999，262(3)713-719)，其基因核苷酸序列为GeneBank AF085353。然而，本发明的术语“戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶”的含义不仅包括具有天然氨基酸序列的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶，而且还包括戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的修饰物、类似物或衍生物，例如相对于天然氨基酸序列有一个或多个(如1-10个)氨基酸增加、缺失、置换，只要所述修饰物、类似物或衍生物保留了戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的酶活性。因此，本发明的突变型戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶中除了具有上述指明的突变外，还可具有其他不影响突变型戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶催化活力和/或稳定性的其他变化。
本发明人根据不同的出发点和设计原则，得到了两组突变体。通过筛选，在第一系列中得到了催化效率(Kcat/Km)分别提高2-3倍的突变体Y151αF和Q50βN。Y151αF和Q50βN的Km降低了大约50％，而Kcat分别由12.3s-1提高至14.4s-1和16.9s-1.他们对底物类似物GL-6-APA和AD-7-ACA的催化活力也有所上升。在第二系列中，R121βA，K198βA和D286βA表现出与野生型相似的Km和Kcat值，表达水平、发酵总活力和纯化后的比活力相差无几，与设计方法所预期的吻合。同时，他们的半衰期和最适pH有所改变。R121βA和K198βA的半衰期分别延长了30％和58％(由68.1小时提高到88.3和107.5小时)。最适pH的变化也很明显K198βA和D286βA的最适pH分别碱移了1.0和2.0个pH单位。R121βA的最适pH酸移了大约0.8个pH单位。选择K198βA在37℃，不同的pH环境下(pH7.0，8.0，9.0，10.0)保温4小时，检测其碱性pH稳定性，发现K198βA比野生型CA130具有较高的活力保持能力。随着pH的上升，K198βA的稳定性与野生型CA130的稳定性差值越大。
将两个活力和稳定性分别提高的单突变体融合，本发明人得到了具有二者优点的双突变体(Q50βN/K198βA)。通过发酵和固定化双突变酶，证实Q50βN/K198βA的每升发酵总活力比野生型CA130高530单位，提高了约43.4％，固定化后的比活力比CA130高116.5个单位，提高了约34.3％。结果显示，双突变酶Q50βN/K198βA在工业生产7-ACA中具有一定的应用价值，同时也证明运用蛋白质工程的方法，通过定点突变改造工业用酶是一个有效的手段。
附图简述
图1显示了底物类似物AD(己二酰基)-6-APA和GL(戊二酰基)-6-APA的化学结构式。
图2显示了GL-7-ACA酰化酶CAD与CA130的催化中心的叠加。
图3显示了野生型CA130(△)，K198βA(□)，R121βA()以及D286βA(○)在37℃，pH7.0下的残余活性随时间变化的曲线。
图4显示了野生型CA130(△)，K198βA(□)，R121βA()以及D286βA(○)在37℃，pH5.0-10.0下的残余活性随pH变化的曲线。
图5显示了野生型CA130(△)和K198βA(□)在不同pH(37℃，pH7.0，8.0，9.0，和10.0)下的稳定性曲线。
较佳实施方案下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(如Sambrook等，分子克隆实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989中所述条件)实施，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1.突变体的获得及活性测定根据CA130的晶体结构推测功能基团。通过替换酶分子中与底物结合部位的氨基酸残基，以提高催化活力；替换酶分子表面的极性氨基酸残基，而增加稳定性。具体是，在DNA引物中引入突变碱基，通过Megaprimer PCR或Overlapping PCR的方法获得含有突变的DNA片段，并构建到表达载体pKKCAI(Li Y，W.Jiang，Y.Yang，et al.Overproduction and purification of glutaryl 7-amino cephalosporanic acid acylase.ProteinExpr.Purif.1998，12(2)233-238.)中，替换相应的氨基酸(表1)，然后转化入大肠杆菌宿主内进行培养。
突变子经过发酵培养，细胞收集后破壁并提取、纯化突变酶蛋白。将得到的纯突变酶进行各项动力学参数测定和活力测定，同时跑SDS-PAGE检验酶的剪切加工情况。
在所有突变体中，大部分均全部或者部分的丧失了催化活力。只有两个突变体，Tyrl51αPhe和Gln50βAsn表现出降低了的Km值和提高了的Kcat值(结果见下表1)。Q50βN的Km值比野生酶大约降低了50％，也就是说突变酶与底物GL-7-ACA的结合能力比野生酶有所提高。同时，Q50βN的Kcat值比野生酶提高了大约42％，这样使得其对GL-7-ACA的催化效率(Kcat/Km)大约提高到了野生CA130的3倍左右。突变体Y151αF的Kcat值并没有很大的提高，但是其Km值也降低了大约50％，所以也表现出大约两倍于野生酶的催化效率。
摇瓶培养带有突变酶基因的大肠杆菌，经离子柱和分子筛纯化后发现Y151αF和Q50βN的纯酶比活力分别提高了大约22％到48％。每升培养液的总活力(单位/升)分别提高了200单位和400单位。
表1野生酶CA130和突变酶的酶学特性
另外，发明人又测定了突变酶对GL-7-ACA的底物类似物AD-6-APA和GL-6-APA(化学结构见图1)以及对CPC(头孢菌素C)的相对活力。结果发现两个突变酶均没有提高对CPC的水解活力，而对AD-6-APA和GL-6-APA的水解活力都有一定程度的提高(表2)。
表2野生酶和突变酶的底物特异性
实施例2.CA130与底物GL-7ACA复合体结构的模拟以及催化中心和底物结合区域的结构研究由于目前只有GL-7-ACA酰化酶CAD与底物GL-7-ACA复合体共结晶的结构，所以对于GL-7-ACA酰化酶CA130的催化中心和底物结合区域的结构分析只有借助于计算机模拟。发明人以CAD与底物共结晶的复合体晶体结构为模板，将CA130的晶体结构叠加上去(图2)，发现CA130的催化中心的关键氨基酸与CAD的非常一致，而且大部分残基的侧链构象也很保守。但是也有几残基的侧链走向有所不同，例如Q50β、R157α。
在CAD与GL-7-ACA的复合体晶体结构中，Q50β已经被证实与GL-7-ACA之间不存在直接的氢键作用，但是GL-7-ACA与R57β和Y151α之间有着直接的氢键作用。而后二者与GL-7-ACA的侧链有重要的氢键相互作用。Q50β的突变看来间接影响了GL-7-ACA侧链与CA130的结合。Asn与Gln有着相似的特性，但是其侧链却比Gln更短，所以推测突变体Q50βN可能比野生CA130提供了一个更宽敞的结合空间来容纳底物。模拟突变酶N50β与GL-7定点突变后的结果是氨基酸N50β比Q50β占有更少的空间，因而使得戊二酸侧链更深地进入，并且更紧地结合到酶的底物结合区域。
两个单突变体Y151αF和Q50βN在3L摇瓶培养后，每升的总活力以及纯化后的比活力都有一定程度的提高，而且没有观察到稳定性有所下降。从7-ACA的结构发现GL-7-ACA侧链与R57β和Y151α之间的氢键仍然存在。这些结果表明它们在7-ACA的工业生产中有一定的应用价值。
虽然所有构建的突变体都没有提高对CPC的催化活力，但是发现Y151αF和Q50βN在提高对GL-7-ACA活力的同时也提高了对另外两种底物类似物的水解活力。AD-6-APA和GL-6-APA是由发明人合成的用来筛选具有CPC和GL-7-ACA水解活力的菌株的化合物。AD-6-APA有一个与CPC相类似的侧链，区别仅仅在于没有一个手性的氨基。这些结果说明突变体确实增强了对更大底物(六碳侧链)的催化能力，但是依然不能与手性氨基很好的结合。同时也进一步说明突变体之所以能更好的容纳底物GL-7-ACA的原因是因为底物结合区域空间变大。
实施例3.计算机设计选择稳定性突变位点目前并没有一个通用的设计规则用以提高蛋白质的稳定性。蛋白质在其等电点(IP)处趋于最稳定的状态，而蛋白的等电点与其表面的电荷数有关。所以可以通过定点突变表面带电荷的残基来改变GL-7-ACA酰化酶的表面电荷从而改变其IP值。在改变蛋白的稳定性且不影响其催化活性的前提下，发明人根据以下设计原则，也进行了对CA130的突变位点设计(A)突变的残基必须不位于蛋白的关键的结构区域(如α-螺旋，β-折叠和β-转角)中；(B)通过几种微生物中的GL-7-ACA酰化酶基因同源性比较选择非保守的氨基酸残基进行突变(R.M.D.Verhaert等，1997)；(C)突变的氨基酸残基与相邻的氨基酸的相互作用尽可能地少，要求和相邻的氨基酸无盐桥，氢键尽可能少(＜3)。这样做的原因在于蛋白质中的盐桥的数目较少，但对蛋白质稳定性的作用很显著；氢键在蛋白质中有重要作用，因为它维持蛋白质的二级结构。所以在选择突变残基时不能破坏酶的盐桥和氢键；突变的氨基酸残基要远离酶的活性中心，这样做的目的是减少突变对酶活力的影响；把大的残基更改为小的残基(如Ala)。
根据上面的大分子稳定性设计原则，应用软件Rasmol找出位于酰化酶CA130表面的碱性和酸性氨基酸残基，得到9个Asp，12个Arg，5个Glu，4个His，3个Lys，共33个氨基酸；显示酶蛋白的所有二级结构，筛除位于螺旋、折叠、转角上的残基；筛除距离酶的活性中心较近的残基；随后进行同源蛋白序列比较，筛除保守的氨基酸残基；此时得到Arg292，Arg342，Lys369，Glu393，Glu455，Asp457，His471，Asp506，Arg586，Asp668(按照全序列命名)。计算酶蛋白中所有原子的氢键数目，判断区别出盐键(表3)。要求所选氨基酸残基中的原子不得与其他任何原子有盐键，且氢键数目尽量少(＜3)。
表3氨基酸的氢键受体、供体、类型
MM氢键在主链与主链中的基团之间形成SS氢键在侧链与侧链中的基团之间形成MS氢键在主链与侧链中的基团之间形成盐键定义为带电基团之间形成的氢键。
最终得到六个氨基酸残基位点，即Arg292(β121)、Lys369(β198)、Glu393(β222)、Glu455(β284)、Asp457(β286)、His471(β300)(表4)。
表4侯选氨基酸残基的氢键、盐键数目
实施例4.所选氨基酸的定点突变以及稳定性测定同样运用Megaprimer PCR或者Overlapping PCR的方法将实施例3所选的带电的残基突变为较小的中性氨基酸Ala。发现有三个突变体Arg121βAla，Lys198βAla和Asp286βAla的稳定性发生了良性变化表现在半衰期和最适pH的变化(图3，图4)。同时，它们对GL-7-ACA的Km和Kcat值与野生型CA130相似。纯化突变酶后研究发现，与设计时预料的相一致，它们的表达量和比活力并没有受到很大影响。在pH7.0，37℃，野生型CA130的半衰期大约是68.1小时，而R121βA，K198βA和D286βA的半衰期分别改变为88.3小时，107.5小时和53.9小时。与野生CA130比较，R121βA和K198βA分别将他们的半衰期延长了30％-58％。突变同时也影响了pH-活力曲线。K198βA和D286βA的最适pH向碱性pH方向移动了大约1.0-2.0个pH单位。而R121βA的最适pH移动到了pH6.2。对于温度-活力曲线，三个突变体都没有看到明显的变化。
突变体K198βA令人很感兴趣，因为它在半衰期增长的同时，最适pH也发生了碱移。为了研究K198βA在碱性条件下的稳定性，将K198βA和CA130在37℃下，不同的pH溶液中(pH7.0，8.0，9.0，10.0)持续保温4小时，测定其在不同时间的活力保持情况(图5)。虽然K198βA和CA130的活力都随着pH值的上升迅速下降，但是仍然可以看出K198βA在每一个pH下的剩余活力都高于CA130。而且，pH越高，K198βA的保持活力能力就相对更强。
在应用GL-7-ACA酰化酶催化GL-7-ACA生成7-ACA的生物催化系统中，由于产物的不断生成，pH值下降很快，导致酶的活力也同时下降。所以，碱溶液必须加入反应体系中来中和戊二酸。碱溶液的加入使得局部碱浓度过高，从而引起CA130的活力迅速下降。CA130的最适pH是7.0，当pH上升或者下降时，酶的活力下降很快。K198βA的最适pH为8.0，并且对碱的忍耐力比CA130好，表现为较好的稳定性。因此这些优点使K198βA在工业发酵生产中具有一定的应用价值。
实施例5.突变体Q50βN/K198βA的发酵与固定化考虑到突变体Q50βN和K198βA的优点(分别是活力提高和稳定性提高)，发明人又在质粒pKKCAI中构建了双突变体Q50βN/K198βA。实验证明，双突变体Q50βN/K198βA酶同时具备了单突变体Q50βN的高活力和K198βA的高稳定性(表5)。
为了考察双突变体Q50βN/K198βA在工业生产7-ACA中的应用，Q50βN/K198βA的基因又被克隆到表达载体pMFT7H6(Wang E.，Y.Zheng，Y.Li，et al.Expression ofgene encoding GL-7ACA acylase in E.coli.2002，34(4)526-531.)中，并转化大肠杆菌BL21(DE3)。载体pMFT7H6(Pt7，RBS，Tt7)的多克隆位点之前中带有6个组氨酸，表达出的蛋白便于应用His亲和树脂进行纯化。转化子BL21(DE3)/pMFT7H6-QR在3升LB培养基中发酵培养(180rpm，37℃)，当OD600达到0.8-1时用终浓度0.5mM的0IPTG诱导。生长14-16h后收集细胞，压榨破碎。应用实验室自制的固定化载体EPI-30-IDA-Co将酶同时纯化并固定化(参见Armisen P.，C.Mateo，E.Cortes，et al.Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelatesupports.J.ofChromatography A 1999，848(1-2)61-70)。
测定固定化后的野生CA130和双突变体Q50βN/K198βA的比活力(单位/g固定化载体)，发现后者的比活比前者增长了约34.3％(表5)。
表5.双突变Q50βN/K198βA在载体pMFT7H6中表达并固定化
根据不同的出发点和设计原则，得到了两组突变体。将两个活力和稳定性分别提高的单突变体融合，得到了具有二者优点的双突变体(Q50βN/K198βA)。通过发酵和固定化双突变酶，证实Q50βN/K198βA的每升发酵总活力比野生型CA130高530单位，提高了约43.4％，固定化后的比活力比CA130高116.5个单位，提高了约34.3％。结果显示，双突变酶Q50βN/K198βA在工业生产7-ACA中具有一定的应用价值，同时也证明运用蛋白质工程的方法，通过定点突变改造工业用酶是一个有效的手段。
在本发明前面以及下文提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种突变型戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶，其特征在于，该酶的β亚基第50位的氨基酸谷胺酰胺突变成了天冬酰胺。
2.一种突变型戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶，其特征在于，该酶的β亚基第198位的氨基酸赖氨酸突变成了丙氨酸。
3.一种突变型戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶，其特征在于，该酶的β亚基第50位的氨基酸谷胺酰胺突变成了天冬酰胺，同时β亚基第198位的氨基酸赖氨酸突变成了丙氨酸。
4.一种DNA序列，其特征在于，所述DNA序列编码如权利要求1、2、3任一所述的突变型戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶。
5.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求4所述的DNA序列。
6.一种转化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5所述的载体。
7.根据权利要求6所述的转化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是原核宿主细胞。
8.如权利要求1、2和3任一所述的突变型戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶或权利要求6中所述的宿主细胞在生产7-氨基头孢烷酸中的应用。
全文摘要
本发明涉及突变型戊二酰－7－氨基头孢烷酸酰化酶，所述酶的β亚基第50位的氨基酸谷胺酰胺突变成了天冬酰胺和/或所述酶的β亚基第198位的氨基酸赖氨酸突变成了丙氨酸。本发明还涉及所述酶在生产7－氨基头孢烷酸中的应用。
文档编号C12P7/40GK1763183SQ20041006730
公开日2006年4月26日 申请日期2004年10月20日 优先权日2004年10月20日
发明者姜卫红, 张伟, 郑华宝, 杨蕴刘, 杨晟 申请人:中国科学院上海生命科学研究院