专利名称：中药肉苁蓉聚合酶链反应的鉴定引物序列及其鉴定方法
技术领域：
本发明是一种用于分子生物学方法检测中药材的技术领域的鉴定引物序列及其鉴定方法，特别是一种中药肉苁蓉聚合酶链反应的鉴定引物序列及其鉴定方法。
背景技术：
中药肉苁蓉(Herba Cistanches)为列当科植物肉苁蓉(Cistanche deserticolaY.C.Ma)的干燥带鳞叶的肉质茎，是传统的补益中药。现代研究证明肉苁蓉具有调节神经内分泌系统、免疫调节、抗氧化、增强体力和抗疲劳、抗肝炎、抗肿瘤、通便作用以及镇静、抗衰老及促进创伤愈合等作用。肉苁蓉生于干旱沙漠，为根寄生植物，寄主为梭梭(Haloxylon ammodena Bunge)、白梭梭(H.persicum Bunge)、柽柳、盐爪爪、珍珠柴和白刺等。肉苁蓉属植物全世界约有20余种，主要分布于欧、亚洲温暖的干燥地区，我国分布有4种，即肉苁蓉、盐生肉苁蓉(C.salsa(C.A.Mey.)G.Beck)、管花肉苁蓉(C.tubulosa(Schrenk.)R.Wight)、沙苁蓉(C.sinensis G.Beck)，其中肉苁蓉为《中华人民共和国药典》规定的中药肉苁蓉的基源植物，因其药材粗壮、密被鳞片、质感柔润而备受欢迎。由于肉苁蓉生长繁殖的特殊性，加之疗效显著而被人为的滥挖以及大批砍伐其寄主梭梭，致使肉苁蓉野生资源急骤减少，因此同属其它植物也在各地区作肉苁蓉入药。市场上甚至有锁阳(Cynomorium songaricum Rupr.)混淆使用。
鉴于肉苁蓉药材资源紧缺以及市场上伪品较多等问题，因此需要快速、准确鉴别药材真伪的方法。然而传统的形态及理化方法鉴定要求有一定的经验，对于破碎后的药材就更加难以准确鉴别。基于DNA序列的分子遗传标记技术则不存在这方面的问题，同时具有用量少、效率高、准确可靠的特点。对于肉苁蓉的开发与生产有着重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种中药肉苁蓉聚合酶链反应的鉴定引物序列及其鉴定方法。使其能够对肉苁蓉药材准确鉴别其真伪，有益于控制药材质量，同样适用于海关检验等相关部门的使用。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明肉苁蓉聚合酶链式反应的鉴定引物序列为引物15’-AGA GAG AGA GAG AGA GTC-3’，引物25’-AAC TCG TGA CAA CCA CAC-3’。
本发明的中药肉苁蓉聚合酶链反应的鉴定方法为1)药材DNA的提取按常规方法进行，用无离子水将受试样品模板DNA浓度调节至0.2～0.5ng/μl。
2)鉴别性聚合酶链式反应反应体系以50μl为参考，引物用无离子水调至10pmol/μl，各试剂的用量分别为10×TaqDNA聚合酶缓冲液 5μlMgCl2(25mM) 3μldNTP(10mM) 1μl引物1 1.5～2.0μl引物2 1.5～2.0μl供试样品DNA模板40～60ngTaq DNA聚合酶 1.0～2.0单位无离子水 加到50μl混匀后，瞬时离心3)鉴定反应条件反应在基因扩增仪上进行，94℃预变性5分钟，然后按照下列参数进行40次循环反应变性94℃ 50秒复性50～55℃ 1分钟延伸72℃ 1分钟循环结束后在72℃保持8分钟，反应结束后在4℃保存。
4)反应产物的电泳检测取出上述反应混和液6～8μl，与2μl加样缓冲液混合均匀，用2％琼脂糖凝胶，电压5v/cm，电泳检测扩增结果。
所述的2％琼脂糖凝胶是指含0.5％溴化乙锭，即EB。
5)若有阳性扩增，则供试样品为正品肉苁蓉；若为阴性，即无扩增条带，则供试样品不为肉苁蓉。
本发明解决了中药材肉苁蓉真伪的鉴别问题，在对肉苁蓉的研究中设计了可以鉴别肉苁蓉的一对高效特异性引物。该引物在给定的反应条件下只特异性地鉴别肉苁蓉，对于其他种类的肉苁蓉药材或伪品均不能扩增出该基因片段。由于应用了聚合酶链式反应的方法，因此可以快速方便地检测样品的真伪，通常只需要极少量的样品，用此引物还可以制造用于肉苁蓉鉴别的试剂盒。本发明对于从事中药生产、销售的部门快速准确地鉴定肉苁蓉，控制药材质量是十分必要，对于各地药检部门打击假冒伪劣药材，净化药材市场将是十分有效的。肉苁蓉植物为濒危保护植物，其资源的保护尤为重要，本发明的方法同样适用于海关检验等相关部门的使用。
图1是实施例的聚合酶链式反应结果示意图其中M为100bp分子量梯度，1为盐生肉苁蓉，2为沙苁蓉，3为肉苁蓉，4为管花肉苁蓉，5为空白对照。
具体实施方法首先用植物DNA提取试剂盒(QIAGEN，Germany)从不同肉苁蓉植物中提取总DNA，用ISSR-PCR方法扩增并比较扩增产物，对不同种植物的特异性片段进行纯化、克隆，并测序，根据测序后DNA序列再设计引物并进行不同植物样品的PCR扩增，直至根据克隆、测序所获得的引物能够针对某种植物或药材只能扩增出单一条带。针对肉从药材以及伪、混品出现的情况，分别设计一对鉴别性PCR引物引物15’-AGA GAG AGA GAG AGA GTC-3’，引物25’-AAC TCG TGA CAA CCA CAC-3’。
用全自动DNA合成仪按上述DNA序列进行合成，即可得到鉴定引物的白色粉末结晶。以上均为本发明的基础工作，本发明的使用者只需按实施例实施即可药材DNA的提取按常规方法进行，用无离子水将受试样品模板DNA浓度调节至0.2～0.5ng/μl。
鉴别性聚合酶链反应反应体系以50μl为参考，引物用无离子水调至10pmol/μl，各物品的用量分别为10×TaqDNA聚合酶缓冲液 5μlMgCl2(25mM) 3μldNTP(10mM) 1μl引物117μl引物216μl供试样品DNA 2.0～3.0μlTaq DNA聚合酶1.0单位无离子水 加到50μl混匀后，瞬时离心。
聚合酶链反应条件反应在PCR仪上进行，94℃预变性5分钟，然后按照下列参数进行40次循环反应变性94℃ 50秒复性50～55℃ 1分钟延伸72℃ 1分钟循环结束后在72℃保持8分钟，反应结束后在4℃保存。
反应产物的电泳检测取出上述反应混和液6～8μl，与2μl加样缓冲液混合均匀，用2％琼脂糖凝胶(含0.5％溴化乙锭，即EB)，电压5v/cm，电泳检测扩增结果，如图1所示。
权利要求
1.一种中药肉苁蓉聚合酶链反应的鉴定引物序列，其特征在于，肉苁蓉聚合酶链式反应的鉴定引物序列为引物15’-AGA GAG AGA GAG AGA GTC-3’，引物25’-AAC TCG TGA CAA CCA CAC-3’。
2.一种中药肉苁蓉聚合酶链反应的鉴定方法，其特征是，具体方法为1)药材DNA的提取按常规方法进行，用无离子水将受试样品模板DNA浓度调节至0.2～0.5ng/μl；2)鉴别性聚合酶链式反应反应体系以50μl为参考，引物用无离子水调至10pmol/μl；3)鉴定反应条件反应在基因扩增仪上进行，94℃预变性5分钟，然后进行40次循环反应；4)反应产物的电泳检测取出上述反应混和液6～8μl，与2μl加样缓冲液混合均匀，用2％琼脂糖凝胶，电压5v/cm，电泳检测扩增结果；5)若有阳性扩增，则供试样品为正品肉苁蓉；若为阴性，即无扩增条带，则供试样品不为肉苁蓉。
3.根据权利要求2所述的中药肉苁蓉聚合酶链反应的鉴定方法，其特征是，所述的聚合酶链式反应各试剂的用量分别为10×TaqDNA聚合酶缓冲液5μl，MgCl2(25mM)3μl，dNTP(10mM)1μl，引物1 1.5～2.0μl，引物2 1.5～2.0μl，供试样品DNA模板2.0～3.0μl，Taq DNA聚合酶1.0～2.0单位，无离子水加到50μl，混匀后，瞬时离心。
4.根据权利要求2所述的中药肉苁蓉聚合酶链反应的鉴定方法，其特征是，所述的循环反应按照下列参数进行变性94℃50秒，复性50～55℃1分钟，延伸72℃1分钟，循环结束后在72℃保持8分钟，反应结束后在4℃保存。
5.根据权利要求2所述的中药肉苁蓉聚合酶链反应的鉴定方法，其特征是，所述的2％琼脂糖凝胶是指含0.5％溴化乙锭。
全文摘要
一种中药肉苁蓉聚合酶链反应的鉴定引物序列及其鉴定方法，鉴定引物序列为引物15’－AGA GAG AGA GAG AGA GTC－3’，引物25’－AAC TCG TGACAA CCA CAC－3’。具体方法为药材DNA的提取按常规方法进行，用无离子水将受试样品模板DNA浓度调节至0.2～0.5ng/μl；鉴别性聚合酶链式反应反应体系以50μl为参考，引物用无离子水调至10pmol/μl；鉴定反应条件在基因扩增仪上进行，94℃预变性5分钟，然后进行40次循环反应；反应产物的电泳检测取出上述反应混和液6～8μl，与2μl加样缓冲液混合均匀，用2％琼脂糖凝胶，电压5v/cm，电泳检测扩增结果；若阳性，则为正品；若为阴性，则不为正品。本发明能够对肉苁蓉药材能够准确鉴别其真伪，有益于控制药材质量，同样适用于海关检验等相关部门的使用。
文档编号C12Q1/68GK1635148SQ20041006678
公开日2005年7月6日 申请日期2004年9月29日 优先权日2004年9月29日
发明者李晓波, 屠鹏飞, 金鑫, 王敬 申请人:上海交通大学