专利名称：用于检测b族链球菌特有序列的引物、短柄圆环探针、试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测细菌的装置和方法，尤其涉及一种用于检测B族链球菌特有序列的引物、短柄圆环探针、以及试剂盒及方法。
背景技术：
B族链球菌(GBS)学名为无乳链球菌(S.agalactiae)，是一种有荚膜的细菌，能够引起牛乳房炎，危害畜牧业非常严重，所以早为畜医界注目。后来发现该细菌能够感染人类，尤其是新生儿。该细菌所引起的败血病、脑膜炎、肺炎等疾病的死亡率极高，并且通常伴有神经系统后遗症，由此又被医学界所重视。鉴于该细菌引起的感染不只限于乳房炎，其细菌壁中多糖物质又属于抗原构造分类中的B族，故目前一般采用B族链球菌来代替学名无乳链球菌。
B族链球菌通常寄居于阴道和直肠，带菌率可高达30％左右。在健康人的鼻咽部也可分离到B族链球菌。新生儿感染与母体带菌有着密切关系，当分娩时胎儿经过带菌产道时可能受感染，也可能由医护人员呼吸道所携带病菌而引起感染。
B族链球菌感染也称作乙型链球菌感染，是新生儿败血症和脑膜炎、以及母亲感染的重要原因。健康妇女中15-35％带有生殖道和消化道B族链球菌菌落。一般健康良好的并不致病，但孕妇可感染，表现为菌血症、泌尿系感染、胎膜感染、宫内膜感染、以及创伤感染。大约25％妊娠妇女可检测出B族链球菌，其中约有一半会带给新生儿，有1-2％新生儿会发病。在美国统计发病率是1-4‰，澳大利亚、英国、和芬兰也有相似的数据报道。这种母婴传播发生在临产，由于新生儿暴露于有B族链球菌产道，可吞进和吸入细菌，也可能宫内感染，其结果不仅可发病和致死，也可遗留长期病理状态如耳聋、视力受损、发育障碍、以及脑瘫痪等后遗症。
新生儿B族链球菌感染表现为菌血症、脑膜炎、和皮肤感染，新生儿B族链球菌感染有两种类型①早期发病的爆发性败血症常见于1周内的婴儿，并且第一周内发病者的80％发生在第一天。具有败血症的一般表现，伴有呼吸窘迫，约1/3患儿有脑膜炎，也称新生儿呼吸窘迫症或新生儿休克综合症。病情凶险，1-2天死亡，死亡率高达50％-70％。此类感染主要来自带菌的产妇，B族链球菌血清型可以分为I、II、或III型。②晚期发病的化脓性脑膜炎发病的年龄在1周-3月之间，平均为4周，呼吸道症状不多见，多伴随有败血症。病死率约15％，存活者可有痴呆、脑积水等后遗症。此类感染一般是医院内感染，B族链球菌血清型主要是III型。
1990年以来，美国由于分娩前采取预防性筛查，使早发的B族链球菌感染降低了70％。根据分娩前得到筛查结果，患者可在住院后立即得到静脉注射抗生素治疗。目前，通常采用标准细菌培养方法来检测B族链球菌的存在，该方法从阴道和肛门取材，由于需要进行细菌培养，需要在35-37周孕期取材，大约需要18-48小时得到检测结果。如果检测结果为阳性，需要给孕妇使用抗生素以预防她将细菌传染给婴儿。
B族链球菌感染是导致新生儿疾病和死亡的主要病因，通常采用标准的细菌培养的检测方法进行检测，要得到结果需要18-48小时。因而采用这种方法比较费时，不能够有效、快速地检测出B族链球菌的存在。
发明内容
因此，针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测B族链球菌特有序列的引物、短柄圆环探针、以及试剂盒及方法，以供实验室、临床研究使用，并能够应用于普查和预防工作，寻找可能的动物来源及从动物到人的转移与进化。
为了实现上述目的，针对B族链球菌的特点，首先选择相应的靶序列，然后针对所选择的特定靶序列设计特异性的引物，特异性地扩增出目的DNA片段。因此，根据待测基因两端的DNA顺序的引物设定也是本发明的要点。
本发明提供了一种为进行PCR扩增B族链球菌选定的靶序列而设计的引物，其中该引物序列为5’CGG TTA ATG AGG CTA TTACTA 3’和5’CAA TCA CAT CTG TTA AGG C 3’，且该靶序列选定在537-656之间。
本发明还提供了一种为了检测该特定靶序列而设计的探针。首先选定用于识别和检测B族链球菌的靶序列，将该靶基因片段选定在573-597之间。将该短柄圆环探序列设计成5’CAG GGT TGGCAC GCA ATG AAG TCT 3’，其中短柄是由该序列两端互补的六对碱基构成的寡核苷酸，该圆环序列与选定的靶基因片段互补。
此外，本发明还提供了一种用于确定在生物样品中B族链球菌是否存在的方法，包括以下步骤a)采集生物样品，并且进行预处理；b)制备DNA模板；c)将步骤b)得到的DNA模板进行PCR扩增处理，其中所用的一对引物序列为5’CGG TTA ATG AGG CTATTA CTA 3’和5’CAA TCA CAT CTG TTA AGG C 3’；以及d)将步骤c)得到的扩增靶序列进行检测。
另外，本发明还提供了一种用于检测B族链球菌的试剂盒，该试剂盒每人份包括0.5-1ml拭子洗脱液，含有Tris和EDTA缓冲液，pH值在6-8之间；裂解液管，内装0.05-0.1ml玻璃珠；核酸扩增和杂交反应管，内装0.02-0.04ml的核酸扩增混和液、一对序列为5’CGG TTA ATG AGG CTA TTA CTA 3’和5’CAA TCA CAT CTGTTA AGG C 3’的引物、dNTP、B族链球菌探针、以及内参照引物和探针；0.05-0.1ml溶解液；以及0.02-0.05ml自备试剂。
本发明用于识别B族链球菌的基因检测方法与现有培养技术相比，具有以下特点和优点1.根据本发明的方法，可以方便、安全地采集生物样本，适于批量处理，样品检测最快可以在2-3小时内完成，具有检测速度快、检测成本低的特点；2.根据本发明用于检测B族链球菌的试剂盒，具有灵敏性和特异性高、以及稳定性好的优点，有着广阔的市场应用前景；以及3.根据本发明用于检测B族链球菌的方法及试剂盒，可以供实验室和临床研究使用，并应用于普查和预防工作。
图1是根据本发明的B族链球菌检测的设计流程图；图2是短柄圆环探针进行靶序列检测的作用原理图；以及图3示意性说明了本发明的短柄圆环探针构象。
具体实施例方式
如图1所示，本发明用于检测生物样本中B族链球菌的方法包括以下步骤1.本发明根据国际上报道的B族链球菌序列来选择靶点；2.针对选定靶点设计引物和探针序列；3.提取患者的DNA样本；以及4.进行核酸扩增和杂交检测DNA样本中是否存在B族链球菌。
通过以下对上述各个步骤的详细描述，本领域技术人员可以进一步了解本发明的目的和优点。
步骤1选择靶点以下为国际上报道的B族链球菌序列，结合于此作为参考，该序列是本发明选择靶点的依据。
CTTTCAACTCAAGAAATTGGCATGCTCTAATAGATCTTCCCCCTCGTTGACAAACAAGATAATATTCCTTATTTTTATCTAACTGTTCAAACTTATGACTGAGTTGACTCAAAGGAAGATTTATCGCACCTGAAATATGCCCCCCACGATACTCATGCTCTTCACGAACGTCTATCAAATGGATATTATGCTGGGCAATCAATGTTTCTAATGCTACAACAGTTATCTTTTTAGTCATAATCTTTATTTCCTTTGATACTTGGCAAATTTAGTCAAATGACTAATCACTTTATTATTTAAAATGGTGACATCGTTCTACTATTATGACTATTATCGTAAACCTTTTAATCATAAAAACCATGGTAGTACAAAATCACGAAGTCGACAGCATCACACGAAAAATACAAATATTATTTTAATGCTGTTTGAAGTGCTGCTTGTAATGTTACAATCTCTTGATCAACTTGTTGTACCGTAACATTTGGATTCAACTGAACTCCAACAGCATGTGTGATTGCTTTATTTAAAGTATTGTAAACTTTAAATTCTTTGACGTTAAGTACTTTTTTATCTCTAGTAAAGCGTGTATTCCAGATTTCCTTATCAAGTTTTGATTTTGTATAGATTGTAGCTCTATCAGTTGGTTTTAAATCAGGATAAGTTAAAACCTTTTGTTCTAATGCCTTTACATCGTTAACTTGAGCTTTAATTGAATCAACTGAAGCAAATGGATCTAAAATGCGAATAACCAGCTTAGTTATCCCAAATCCCATATCAATATTTGCTTGACTAACCTTATTTGCTAAATGTTGAGTTGAAAAAGTGATTGCTTCAATCACATCTGTTAAGGCTTCTACACGACTACCAATAGAATTCAAATCATAAACTGTCTCAGGGTTGGCACGCAATGAAGTCTTTAATTTTTCAACACTAGTAATAGCCTCATTAACCGTTTTTTCATAATCTGTTCCCTGAACATTATCTTTGATATTTCTCAACTGAATGCTATCTTGATCAAGCTTTTGAGCCATTTGCTGGGCTTGATTATTACTGTTTACATGATTTACCACTTGTGGAGTTGTCACTTGATCAGCATGTACTTCTAATACAGCTGGTGAAAATAACAATGCACCAGCCACTAGAGTTCCAGATAGATACATCATATGTTTAACGTTCATAATGAATTTCCTCCTTTAAACTAAAATCACTTTTACTGCAGTATTTTTAATTTACAGGGCCCATGTTTGTATCTTACTACTTGTCCAAAAGGTCGTCAAGCGCTTTCTTTTCCCCTATATTTTACATTATTACAAATAAACTGCATTTTTTTCATAAAACTAATATTATCATTTTGCTATAATATACTTGCGCCTATCCTTTTGTTAATTTCTGATAATTTAATTTATATTTTCATGTAAAAAACCATAACGATAATTTACCACCTTATATAAATCTAAATATTTTAGAAAATTTCTACTTATCACTATTTTTATCAAATAGATTAGCCTAATGTTTTTCTTAAAAAATAAATTTAATAAGAAGCGTACTATTTTAGATAAAATCGTTCCATTATGCCCAAAAACCATACTAAAACTCATTATTTTTACTTTCTGTTTAGAAATTCATACTAGACCAAGTATTTTAGACACTTAAAAAGCCTTAAACATAATAAGTTCAAGACTTTTTATTACTTAGTATTTTAAACTGTGAGTTTGTTTGGCAGTTCCCTCCGATGATTTTTACCCCAATTTTTTGAACCAAAAGTTAACAATATCGTCAGCCATAGTATTGATATCTAGATTACATTTACTGGTAACTATGTTACCATGTGTATGGATAACTTATATCAAAAATATATTAATCTAAAAAAGTGAATAACCCT TATAAAATAAGTAAATCCTAAGTACAGCATTAACTTCAAGTAAACAATTTAACGGAGGTAGTATATGAAAATAGCAATAATCGGATATAGTGGGTCGGGTAAGTCCACTTTAGCAAGAAAATTGGGAAATTACTATAATTGCAATGTATTACATCTTGATAGTATTCACTTCGCCCCAAATTGGGAAGAGAGAAAATATGATGACATGATTGACG靶点选择是本发明的引物设计的基础，要求所选的靶点稳定，没有突变区，长度在120-180bp之间。由于临床采样中细菌数量少，需要针对选定的靶序列进行扩增(即扩增靶序列的拷贝数量)，从而提高检测方法的灵敏度。
根据本发明所选择的靶点与迄今收集到的国际报道已知序列比较，其稳定、无突变、且适合应用于基因检测。
步骤2针对选定靶点设计引物和探针序列一般而言，基因检测要求靶分子数量足够高，而多数临床样本中靶分子量远低于此限，其采样量不能很大。因此，单独应用基因检测技术存在灵敏度低的问题。
目前聚合酶链式反应(以下简称“PCR”)技术的建立使基因诊断进入了一个崭新的阶段，其是一种基因扩增技术，在现代分子生物学研究中是很有价值的工具，可应用于不同领域。PCR技术于1983年由美国Centus公司人类遗传室的科学家Kary Mullis发明。以PCR技术为主的体外核酸扩增技术的发展，使低拷贝临床样本的检测成为可能。PCR能使样品中靶序列的拷贝数特异性地快速扩增，将检测阈值降至1-10拷贝数，大大提高了杂交检测的灵敏度。
然而，评价PCR扩增是否成功，关键在于针对靶序列的引物设计，并且靶序列的选择更是PCR扩增成功的关键。本发明通过精确地计算和设计以及实验和筛选，确定了理想的靶序列及引物，以获得理想的靶序列扩增结果，从而为应用各种分子检测技术进行靶序列检测提供了基础。
杂交方法是一种分子生物学的标准技术，用于检测DNA或RNA分子的特定序列(靶序列)。杂交方法有很多种，最常见的可以采用DNA或RNA先转移并固定到硝酸纤维素或尼龙膜上，与其互补的单链DNA或RNA探针可用放射性或非放射性标记。如图2所示，在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针。
最近发展起来的短柄圆环探针技术，也称分子信标技术，也是一种杂交检测的方法，其具有快速灵敏的特点。在探针5’和3’端之间可形成一个具有20个碱基左右的圆环结构，当溶液中有模板序列时，探针的圆环序列与模板杂交，探针的发夹结构被破坏而线性展开；此时，荧光分子与淬灭分子分开并发出荧光，通过荧光的强度就可检测靶序列。现有技术已有将其应用于结核杆菌的耐药基因检测等。
对于应用核酸杂交检测，核酸杂交是提高基因诊断特异性的关键。短柄圆环探针体系特别值得推荐，这是因为其具有高特异性结合的特点。当采用DNA结合染料(如SYBR Green)进行的荧光即时检测系统时，需要知道SYBR Green与所有双链DNA结合的情况才能够进行检测。然而，短柄圆环探针的特殊性就在于仅与互补靶基因片段结合，只报告互补的靶序列或扩增产物。短柄圆环探针系统与其它线形探针比较，还具有可检测出单碱基对错配的功能。短柄圆环探针遇到有错配的单碱基对时，会很不稳定且不牢固，在这点上与一般线形探针有所不同，可应用于发现位点突变。与线形溶解探针比较，标记在短柄圆环探针上的荧光素与淬灭剂相邻，直接能量转换易于淬灭。因此，淬灭剂和荧光素的选择比较容易。
应用短柄圆环探针体系检测B族链球菌，关键在于确定合适的靶序列，需要其具有特异性和稳定性。进一步地，所选靶序列应当符合探针序列的设计要求，要考虑能够保持圆环结构而不发生自身序列的杂交，以及特异性杂交产生的力能够克服短柄序列之间的结合力等等，这些都是解决检测问题的要点。
目前，通常采用PCR产物电泳的方法检测PCR扩增是否成功，而采用这种方法会增加额外时间，增加实验室设备和试剂的污染危险。在检测操作中，必须将所有试管打开进行取样。另外，同样的引物-模板系统重复进行检测，前一次实验的扩增产物可作为随后实验导致污染的模板，从而产生假阳性。而应用短柄圆环探针可以减少电泳步骤，因而减少污染机会，反应和结果分析在密封的一个试管中进行，从而提高了检测的准确性。
本发明采用了核酸扩增技术，而扩增能否成功的关键是针对选定靶点的引物设计，该引物的设计是本发明所解决关键技术。选择每个引物的长度在18-25bp之间，同时设计引物要求避免其自身杂交，因而还要进一步考虑其TM值等设计参数。
本发明是根据世界上各研究机构公开发表的B族链球菌序列基础上，分析确定B族链球菌的特异性、稳定的序列。为利用PCR技术，经过计算、设计、及筛选，提供了一对优选的针对B族链球菌设计的特异性引物。
此外，本发明还设计了短柄圆环探针，能够检测实验室及临床的生物样本，通过以下对实施例的详细描述，本领域技术人员可以进一步了解本发明的目的和优点。
本发明提供了一种为进行PCR扩增B族链球菌选定的靶序列而设计的引物，其中该引物序列为5’CGG TTA ATG AGG CTA TTACTA 3’和5’CAA TCA CAT CTG TTA AGG C 3’，且该靶序列选定在537-656之间。
本发明还提供了一种用于检测B族链球菌的短柄圆环探针，将该短柄圆环探序列设计成5’CAG GGT TGG CAC GCA ATG AAGTCT 3’，其中短柄是由该序列两端互补的六对碱基构成的寡核苷酸，圆环序列与选定的靶基因片段互补。短柄圆环探针的5’端标记荧光素，3’端标记DABCYL淬灭剂，可以应用荧光检测技术检测杂交，报告靶基因序列。
优选地，将PCR技术与短柄圆环探针体系结合，用于检测B族链球菌的存在。
步骤3提取DNA样本提取DNA样本，即制备DNA模板，包括以下步骤(1)将拭子样本放置在TE液中，静置5-20分钟，震荡15-40秒；(2)将40-80μl拭子上清液加入裂解液管，高速震荡5-10分钟；(3)瞬时离心2-5秒；(4)在95℃下孵育2-10分钟，立即冰浴；以及(5)瞬时离心2-5秒。
步骤4核酸扩增和杂交检测DNA样本根据本发明的用于确定在生物样品中B族链球菌是否存在的方法，包括以下步骤a)采集生物样品，并且进行预处理；b)制备DNA模板；c)将步骤b)得到的DNA模板进行PCR扩增处理，其中所用的一对引物序列为5’CGG TTA ATG AGG CTA TTA CTA3’和5’CAA TCA CAT CTG TTA AGG C 3’；以及d)将步骤c)得到的扩增靶序列进行检测。
根据本发明的基因诊断方法，优选地，对扩增的靶序列检测采用短柄圆环探针荧光检测，本领域技术人员也可以采用其它杂交技术来检测该扩增靶序列。
此外，根据本发明的用于检测B族链球菌的基因诊断试剂盒，该试剂盒每人份包括0.5-1ml拭子洗脱液，含有Tris和EDTA缓冲液，pH值在6-8之间；裂解液管，内装0.05-0.1ml玻璃珠；核酸扩增和杂交反应管，内装0.02-0.04ml的核酸扩增混和液、一对序列为5’CGG TTA ATG AGG CTA TTA CTA 3’和5’CAA TCA CATCTG TTA AGG C 3’的引物、dNTP、B族链球菌探针、以及内参照探针；0.05-0.1ml溶解液，优选地，该溶解液为经处理的高纯水、Tris-HCl、Triton X-100、或NaCl；以及0.02-0.05ml自备试剂，优选地，该自备试剂为石蜡油。
根据本发明提供的试剂盒及基因诊断方法，通过包括对患者的病变部位的分泌物和组织、血样、以及尿样的检查作为B族链球菌早期诊断参考依据，同时也可以实现更大范围采样检测，以检测和发现B族链球菌。目前，已从临床送检病变部位的分泌物和组织、以及血样中，检测出B族链球菌的特有基因序列。
下面结合实施例，对本发明进行进一步阐述，并且不会因此限制本发明的保护范围。
实施例1用于PCR引物的制备根据本发明的一对引物序列为5’CGG TTA ATG AGG CTATTA CTA 3’和5’CAA TCA CAT CTG TTA AGG C 3’，该序列可以有效地避免自身杂交，退火温度在50-60℃之间。仪器规格为ABI 391DNA合成仪，产地美国，该合成仪可从美国应用生物系中国公司购买，原料为ABI合成柱A、T、C、和G，ABI合成碱基A、T、C、和G。
短柄圆环探针的制备如图3所示，根据本发明的短柄圆环探针序列为5’CAG GGTTGG CAC GCA ATG AAG TCT 3’，其中短柄是该序列两端互补的六对碱基构成的寡核苷酸。采用ABI 391DNA合成仪，产地美国，该合成仪可从美国应用生物系中国公司购买，原料为ABI合成柱A、T、C、和G，ABI合成碱基A、T、C、和G，其中5’端标记FAM的荧光素，而3’端标记DABCYL淬灭剂。
短柄圆环探针荧光检测B族链球菌短柄圆环探针体系与核酸扩增在同一试管中进行，无需开盖，可以有效地避免污染，从而提高检测准确率。
每人份(25μl)核酸扩增体系设计如下体系组成 终浓度缓冲液 1xMgCl22.0mMdNTP 0.08mMTaq，酶2.5单位短柄圆环探针 0.5mM引物 0.5mMDNA模板5μlH2O 补充至25μl
即时PCR程序设置95℃2分钟1个循环94℃15秒55℃50秒 }40个循环72℃10秒实施例2根据本发明的用于确定在生物样品中B族链球菌是否存在的方法，包括以下步骤1.样本采集对于被检测者阴道和直肠的样本需用涤纶拭子，首先擦去被检测者阴道内过多的分泌物，将拭子小心地插入被检测者的阴道，采取阴道低位1/3处粘膜分泌物样本，再将拭子小心地插入被检测者的肛门，在肛门括约肌以上约2-5厘米处轻轻旋转取得样本，按照医院样本输送程序送至实验室，注意防止运送中的过热温度(一般不超过30℃)；2.样本检测将步骤1采集到的样本在室温下保存，24小时内检测，原则上样本在5-25℃可保存6天。如果不能在24小时内处理，应该置于冰箱(4℃)保存，荧光PCR法检测目的是找到特有序列，检测结果应该在分娩前4小时报告，此检测结果对于决定选用抗生素治疗，进行分娩前预防，是及时而有必要的；3.制备DNA模板，包括以下步骤(1)将拭子样本放置在1xTE液中，静置10分钟，震荡25秒；(2)将拭子上清液60μl加入裂解液管，高速震荡10分钟；(3)瞬时离心5秒；(4)在95℃下孵育5分钟，立即冰浴；以及(5)瞬时离心4秒；
4.进行核酸扩增处理，包括以下步骤(1)取DNA模板液2μl；(2)加入混合反应液23μl；(3)循环时间与温度设置95℃ 2分钟1次循环；94℃15秒55℃50秒}40次循环；以及72℃10秒5.检验结果报告即时荧光法检测目的是找到特有序列，检测结果在分娩前4小时报告，此检测结果对于决定选用抗生素治疗，进行分娩前预防，是及时而有必要的。
实施例3B族链球菌检测试剂盒及其使用方法每人份用于检测B族链球菌的试剂盒包括0.8ml拭子洗脱液，包括1x Tris、EDTA缓冲液，pH值为7.2；裂解液管，内装0.08ml玻璃珠；核酸扩增和杂交反应管，内装0.025ml的0.001％核酸扩增混和液、0.002％一对特异引物、0.05％dNTP、0.001％B族链球菌探针、0.001％内参照引物和探针，其中特异引物序列为5’CGG TTA ATGAGG CTA TTA CTA 3’和5’CAA TCA CAT CTG TTAAGG C 3’；0.07ml溶解液，为经处理的高纯水；0.03ml石蜡油；以及0.01ml阳性对照液，为B族链球菌特有序列。
采用根据本发明的试剂盒检测B族链球菌的方法，包括以下步骤1)吸取1ml拭子洗脱液放置于1.5ml离心管中；2)将拭子放置于装有洗脱液的离心管中，使拭子浸湿，然后稍微向上提起，剪断高于离心管的拭子柄部分，盖好盖子，室温静置5分钟，高速震荡5分钟，稍离心以便甩去离心管盖子上的液体；3)从洗脱液中吸取50μl液体放置在裂解液管中，高速震荡5-15分钟，其中震荡时间根据所用仪器的震荡强度而定；4)在95℃孵育2分钟，取出并立即置于冰浴中；5)向反应管中加入23μl溶解液，用吸头轻吹打溶解并将试剂混合均匀；以及6)再向反应管中加入10μl的石蜡油，取1.5μl裂解液管中的模板加到反应管中石蜡油的液面下，在石蜡油液面下，用吸头轻吹打4次，将试剂与模板混合均匀，按下列程序设置进行核酸扩增和杂交(即时核酸扩增)95℃2分钟1个循环94℃15秒55℃50秒 }40个循环72℃10秒比较例美国FDA通过的IDI-Strep BTM检测B族链球菌的方法，与本发明的方法不同之处在于引物、探针序列选择、以及内参照的制定，其中IDI-Strep BTM为加拿大人研制在美国首次上市的用于检测B族链球菌的试剂盒，价格为每人份30美元。
分别采用根据本发明的B族链球菌方法(称之为“乙链即时检测法”)与现有技术的IDI-Strep BTM检测方法进行对比试验，将对比试验的结果列于表1，而将临床诊断检测结果列于表2。
表1对比试验结果
表2临床诊断检测结果
从表2数据可以得出灵敏性＝(PCR方法的阳性样本数/培养方法的阳性样本数)×100％＝(38/39)×100％＝97.4％
特异性＝(PCR方法的阴性样本数/培养方法的阴性样本数)×100％＝(72/73)×100％＝98.6％符合率＝[(PCR方法的阳性样本数+PCR方法的阴性样本数)/总样本数]×100％＝[(38+72)/112]×100％＝98.2％阳性预测值＝(PCR方法的阳性样本数/耐药培养的阳性样本总数)×100％＝[38/(38+1)]×100％＝97.4％阴性预测值＝(PCR方法的阴性样本数/耐药培养的阴性样本总数)×100％＝[72/(1+72)]×100％＝98.6％如果以培养结果为参考，其中一例GBS阴性样本*虽与IDI结果不同(IDI为阳性)，但与培养结果相同(阴性)，一例GBS阳性样本**，IDI结果为阴性，培养结果也是阴性。
其中阳性预测值表示某一检测方法其阳性结果被证明为阳性的概率，阴性预测值表示某一检测方法其阴性结果被证明为阴性的概率。
由此可以看出，与现有技术的IDI-StrepTM检测方法相比，本发明的乙链即时检测法在灵敏性、特异性、阳性预测值、和阴性预测值方面至少等同或优于IDI-StrepTM检测方法(如果以培养结果为参照标准)。IDI-StrepTM试剂盒价格是本发明试剂盒的5倍。
此外，本发明用于快速检测B族链球菌的试剂盒可批量生产、操作简单、简便快捷、特异性好、灵敏性高、并且符合率高，具有良好的市场应用前景。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种为进行PCR扩增B族链球菌选定的靶序列而设计的引物，所述引物为以下的一对序列5’CGG TTA ATG AGG CTA TTA CTA 3’；以及5’CAA TCA CAT CTG TTA AGG C 3’。
2.一种用于检测B族链球菌的短柄圆环探针，所述短柄圆环探针序列为5’CAG GGT TGG CAC GCA ATG AAG TCT 3’，所述短柄是所述短柄圆环探针序列两端互补的六对碱基构成的寡核苷酸。
3.根据权利要求2所述的短柄圆环探针，其特征在于，所述5’端标记FAM的荧光素，而3’端标记DABCYL淬灭剂。
4.一种用于检测生物样品中B族链球菌的方法，包括以下步骤a)采集所述生物样品，并且进行预处理；b)制备DNA模板；c)将步骤b)得到的DNA模板进行PCR扩增处理，其中所用的一对引物序列为5’CGG TTA ATG AGG CTA TTACTA 3’和5’CAA TCA CAT CTG TTA AGG C 3’；以及d)将步骤c)得到的扩增靶序列进行检测。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤d)是采用短柄圆环探针荧光检测。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述短柄圆环探针包括短柄部分和圆环部分，其中圆环序列与所述靶序列是完全互补的序列。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述圆环序列是5’CAG GGT TGG CAC GCA ATG AAG TCT 3’。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述生物样品选自人类、动物、脱离人体、或动物体的组织、体液、和分泌物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述生物样品包括病变部位的分泌物和组织、血样、以及尿样。
10.一种用于检测B族链球菌的试剂盒，包括0.5-1ml拭子洗脱液，包括Tris和EDTA缓冲液，pH值在6-8之间；裂解液管，内装0.05-0.1ml玻璃珠；核酸扩增和杂交反应管，内装0.02-0.04ml的核酸扩增混和液、一对序列为5’CGG TTA ATG AGG CTA TTA CTA 3’和5’CAA TCA CAT CTG TTA AGG C 3’的引物、dNTP、B族链球菌探针、以及内参照引物和探针；0.05-0.1ml溶解液；以及0.02-0.05ml自备试剂。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述B族链球菌探针是序列为5’CAG GGT TGG CAC GCA ATG AAGTCT 3’的短柄圆环探针。
12.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括阳性对照液。
13.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述溶解液为经处理的高纯水、Tris-HCl、Triton X-100、或NaCl。
14.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述自备试剂为石蜡油。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测细菌的方法，尤其涉及一种为检测B族链球菌特有序列而设计的引物、短柄圆环探针、试剂盒及方法。本发明的目的在于提供一种有效、快速检测B族链球菌的方法，以供实验室、临床研究使用，并能够应用于普查和预防工作，寻找B族链球菌可能的动物来源及从动物到人的转移与进化。本发明用于检测B族链球菌的基因诊断试剂盒具有使用简便、快捷、灵敏性和特异性高、以及稳定性好的优点，有着广阔的市场应用前景。
文档编号C12Q1/68GK1712546SQ20041004973
公开日2005年12月28日 申请日期2004年6月25日 优先权日2004年6月25日
发明者吴秉铨, 高建平 申请人:吴秉铨